专利名称：β-胡萝卜素羟化酶基因DSM2在控制水稻抗旱性中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及水稻基因工程领域。具体涉及分离、克隆和通过功能验证得到一种能 够提高干旱耐受能力的水稻DSM2基因在水稻抗旱性遗传改良中的应用。本发明采用筛 选T-DNA插入水稻突变体库的方法，克隆到控制水稻抗旱基因DSM2，通过共分离检测表明 该突变体与干旱敏感表型是紧密连锁的，超量表达DSM2基因，提高转基因水稻抗干旱的能 力，证实了该基因的功能及应用途径。
背景技术：
植物的生长除了有其固有的遗传基础外，往往还会受到诸多环境因素的影响。干 旱、高盐、低温是最为常见的非生物逆境，严重影响了植物的生长，限制了植物的分布。非 生物逆境会造成作物产量和品质的下降，在许多地区是农业发展的瓶颈。因此，培育抗逆 作物一直是农业科学技术研究的主要目标之一。为了适应或抵御这些逆境条件，植物在经 过长期的生物驯化之后，形成了自己的一套防御干旱、高盐、低温、紫外线等逆境胁迫的自 我保护机制。干旱、高盐和低温胁迫，都破坏了植物细胞的离子平衡，致使细胞脱水，使植 物细胞受到离子和水分胁迫，干旱、高盐和紫外线还引起植物体得氧化胁迫，激发相关基 因的表达，导致植物在新陈代谢以及形态上的变化，如植物生长的减缓甚至停止，体内激 素(如ΑΒΑ)的瞬时上升，体内调节渗透压的物质的聚集等(Seki M，Umezawa T，Urano K， Shinozaki K. Regulatory metabolicnetworks in drought stress responses. Curr Opin Plant Biol, 2007,10 =296-302) 0并且植物在进化过程中也形成了一系列的信号转导路径 来介导对胁迫的反应，从而控制植物的生长发育。ABA(abscisic acid)是异戊二烯类的脂溶性化合物，也称萜类化合物，是植物内 源的激素之一。当植物在其生长发育的过程中暴露于逆境胁迫的条件下，其内源的ABA含 量急剧增加，现在很多研究表明ABA在触发植物对逆境刺激的反应中是一种必需的传递 体，因此ABA又被认为是一种植物‘非生物逆境激素’。因此完全了解植物体ABA的合成 及其与非生物逆境的关系是极其重要的，此外ABA在调控种子的成熟及萌发气孔的运动， 叶绿体和根的发育过程中也发挥着不可替代的作用。在最近二十年中，科学家们在植物中 已经鉴定了多种参与ABA合成的基因，某些ABA合成途径基因的缺失突变体表现出种子 胎萌或苗子白化的表型，如玉米和水稻胎萌突变体。此外，ABA合成前体类胡萝卜素减弱 的一些突变体表现出脆弱的氧化胁迫表型。在很多类胡萝卜素物质中，叶黄质被认为是 在非生物逆境中发挥主要作用的，其参与氧化胁迫主要是通过叶黄质循环(xanthophyll cycle)，主要是在弱光或黑暗中ZEP活性较高，玉米黄素向堇菜黄质转化，强光下堇菜黄质 脱环氧酶(violaxanthin de-epoxidase, VDE)活性较高，催化堇菜黄质向玉米黄质转化， 消耗多余光能，保护光合组织不受强光伤害，越来越多的研究证明植物体内普遍存在的叶 黄质循环主要参与光氧化损伤。除了参与强光保护反应，这些叶黄质存在于光合组织中参 与色素蛋白复合体的形成，也参与光能的捕获和活性氧的清除。参与叶黄质合成的基因在 拟南芥中有非血红素类型的胡萝卜素羟化酶基因家族Bi、Β2和血红素类型的细胞色素P450家族CYP97A3、CYP97C1，其三突变体及四突变体表现出脆弱的光保护能力(Tim， L Musetti，V. Kim,J. Magallanes-Lundback,M. DellaPennaiD. TheArabidopsis LUTl locus encodes a member of the cytochrome p450 family that is required forcarotenoid epsilon-ring hydroxylation activity. Proc Natl Acad Sci，2004，101 :402_407 ； Tian，L Magallanes—Lundback，M. Musetti, V.DellaPenna, D. Functional analysis of beta—and epsilon-ringcarotenoid hydroxylases in Arabidopsis. Plant Cell,2003, 15:1320-1332)。但他们与干旱这一重要农艺性状的关系至今还没有报道。此外这些参与 叶黄质合成的基因其编码的蛋白序列在植物界是高度保守的，但是由于启动子在进化过程 中的变异，导致它们存在表达模式及逆境诱导表达谱的差异。这些对申请人全面了解叶黄 质合成基因的功能是必不可少的，将其应用在解决农作物抗干旱这一重要的农艺性状方面 有着重要的意义。水稻是重要的粮食作物和模式植物，通过水稻突变体来研究一些与植物生长、发 育和其他性状相关的基因已成为一种重要的基因功能研究手段。在申请人的前期研究中分 离到一个干旱敏感的水稻T-DNA突变体，其插入基因是一个β-胡萝卜素羟化酶基因。鉴 于水稻中胡萝卜素羟化酶是否能提高水稻的抗逆性目前尚无相关报道。因此，从水稻 中分离出胡萝卜素羟化酶基因，并鉴定它在提高水稻抗逆性方面所发挥的功能，对于 培育抗逆水稻新品种将具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的涉及一个胡萝卜素羟化酶基因家族DSM2基因在控制水稻抗旱 性改良中的应用。从水稻T-DNA突变体库中分离得到一个干旱敏感的水稻T-DNA突变体， 其插入基因是一个胡萝卜素羟化酶基因，基于这个突变体的表型，申请人将该基因命 名为DSM2。本发明分离和应用一种包含DSM2基因的DNA片段，该片段赋予水稻在干旱条件 下抗旱性增强的能力。其中，所述的DSM2基因的核苷酸序列如序列表SEQ Ν0:1所示，序列 长度为858bp，它对应的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示，其氨基酸序列为285个。它的蛋 白质序列如SEQ ID NO 2所示。携带有本发明DSM2基因的表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒载体，直接DNA 转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(WeiSSbaCh，1998，Method for Plant Molecular Biology VIII, Academy Press, New York, pp. 411-463 ；Geiserson and Corey, 1998, Plant Molecular Biology(2ndEdition)。可使用包括本发明的DSM2基因的表达载体转化宿主是包括水稻在内多种植物， 培育抗旱植物品种。本发明基因是受干旱诱导表达的，因此可将本发明的基因与任何感兴趣的干旱诱 导启动子结合后连入合适的表达载体，并转化植物宿主，在干旱条件下可诱导表达基因，提 高植物抗旱性。下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。
0010]序列表SEQ ID NO 1是本发明克隆的β -胡萝卜素羟化酶基因DSM2的核苷酸序列，序列长度为858bp，它对应的氨基酸序列如SEQ ID NO=I所示，氨基酸序列为285个。序列表SEQ ID NO 2是本发明的β -胡萝卜素羟化酶基因DSM2编码的的氨基酸 序列对应的蛋白质序列图1.是本发明分离克隆DSM2基因及功能鉴定的总体技术路线图。图2.根据插入位点设计引物验证表达量与T-DNA插入纯合位点的共分离示意图。 F表示T-DNA插入位点上游设计的引物，R表示在T-DNA插入位点下游设计的引物。以T-DNA 插入纯合突变体及对照植株的总RNA反转录得到的总cDNA为模板做半定量PCR，上一行引 物DSM2特异引物F+R，下一行引物以Actinl基因作为内参。DSM2基因在dsm2突变体中 表达量缺失。图3.是本发明的DSM2基因能被多种逆境干旱、高盐、紫外线(UV)、脱落酸(ABA) 等诱导表达，而低温、高温对DSM2表达影响不大，且有显著的组织特异性表达模式(图中编 号分别为1.节间，2.节，3.叶鞘，4.三叶期苗子，5.颖壳，6.种子，7. 二次枝梗，8.花药， 9. 一次继代愈伤，10. 二次继代愈伤，11.三次继代愈伤，12.幼芽，13.幼根，14.上午的剑 叶，15.下午的剑叶，16.叶枕。图4.水稻dsm2突变体苗期表型。上图干旱胁迫一天。下图干旱胁迫四天后恢 复四天。CK为转基因家系分离出的阴性对照，dsm2为DSM2 T-DNA插入突变体。图5.水稻dsm2突变体孕穗期表型。上图干旱胁迫前。下图干旱胁迫二十天后 恢复五天。CK为转基因家系分离出的阴性对照，dsm2为T-DNA插入突变体。图6.水稻dsm2突变体孕穗期干旱胁迫后地上部分生物量的统计结果，图中 normal是正常生长条件，M-DR是中度干旱胁迫，EX-DR是严重干旱胁迫。图7.水稻dsm2突变体孕穗期干旱胁迫后结实率的统计结果。图中mormal是正 常生长条件，M-DR是中度干旱胁迫，EX-DR是严重干旱胁迫。图8. DSM2-0X苗期超表达植株正常生长情况。图上和干旱胁迫7天后恢复4天 (下)，DSM2-0X为超量表达转基因Tl代家系，CK为转基因阴性家系。图9. DSM2-0X孕穗期超表达植株在PVC管中的生长情况。图左为PVC管中的干旱 胁迫前的植株形态，图右是干旱胁迫12天时植株的生长情况。图中DSM2-0X为超量表达 转基因Tl代家系，CK为转基因阴性家系。图10. DSM2-0X孕穗期超表达植株在PVC管中胁迫前后的绿色叶片数量的统计。 DSM2-0X为超量表达转基因Tl代家系，CK为转基因阴性家系。图11. DSM2-0X孕穗期超表达植株在PVC管中干旱胁迫及田间正常生长条件下的 花粉育性的统计。DSM2-0X为超量表达转基因Tl代家系，CK为转基因阴性家系。
图12 :DSM2超表达所用载体示意图。
具体实施例方式以下实施例定义了本发明，并描述了本发明在分离DSM2 T-DNA插入突变体，克隆 包含有DSM2基因完整编码区段和基因的启动子区段的DNA片段，以及验证DSM2基因功能 的方法。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且 在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用不 同的用途和条件。实施例1 分离DSM2 T-DNA突变体
从水稻突变体库RMD(本发明的起始材料即突变体04Z11AW79检索地址http:// rmd. ncpgr. cn/search. cgi，华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室管理)中挑取受 逆境诱导上升的基因位点相应的T-DNA插入突变体04Z11AW79，其中在上述网站突变体库 中所登录的DSM2 T-DNA突变体04Z11AW79的侧翼序列(该序列长度为338bp)如下CCAGGATTTGACCAATGTCTGATGCTTAACGTGGCCGTATTAAAATGACAAAAGTGCATGATGTAGTAC TATGTTCAGTTGATTACATTCACATTCCATGGCCGCCTGCCAAAAAAAAATGAATTTATCTGTCAAGAGAAGCCAAAGCGTAAAGCGAACT CCAAAAGATCTTGATGTCCTTGCTGCATCGGATAAACAATAAAAAATTGAACATTCGAGATCGAGAAAATTTAAAAAAACGGATTGGCCTG GCCTCCTTGATTTCCCTGAGAACCCTATAATGGATTATAATATCTTTGATTTATTTTCTCGGGCGGCTTCGACTTGTGAATATCTGC根据侧翼序列与水稻基因组的匹配情况可以确定插入位点在转录起始位点ATG 下游852bp处，根据插入位点设计的半定量PCR检测，其具体步骤如下所述的PCR反应体的 操作。检测DSM2基因表达量的引物对的DNA序列如下引物F :5，GCTTCGCCTGGCAAATGG 3，， 引物 R :5’ ACCGTCCAAATGAGCTTCCA 3’。PCR 反应体系的总体积为 50 μ 1，cDNA 模板 Iul (约 IOOng) ,2 XGC bufferl 酶反应缓冲液、IOmM dNTP 0. 5ul、IOuM 引物 0. 5ul、1 单位 rTaq 酶， 加双蒸水至50 μ 1。反应程序为94°C变性5min，94°C 30s,50°C 30s,72°C 45s,28个循环， 72°C延伸5min。PCR扩增结果如图1，中花11号(ZHll)为野生型对照(未转基因)，没有 T-DNA插入的植株引物F和引物R配对可以扩增的出DSM2基因，dsm2为T-DNA插入纯合突 变体，有T-DNA插入的纯合突变体没有DSM2基因的转录，不能扩增出DSM2基因，图2显示 在dsm2突变体中DSM2基因不能表达。 实施例2 检测水稻内源DSM2基因的表达水平 申请人:选用籼稻品种“中花11号”(简称ZH11，一个公开推广应用的水稻品种) 作为表达谱分析的材料。种子催芽后，在小桶正常土壤中生长至四叶期时进行各种逆境 和激素的处理。干旱处理是不在浇水让其自然干燥，分别在胁迫前、胁迫后1天、2天、 3天取样及复水恢复2天后取样；高盐胁迫是向桶中加入含有300mmol/L NaCl的溶液， 分别在胁迫前，2小时、12小时、36小时取样；低温胁迫是把四叶期水稻幼苗放入4V人 工气候室，分别于胁迫前、胁迫后2小时、12小时、24时取样。激素处理是用200 μ M脱落 酸(ABA)均勻的喷洒水稻植株表面后并加到苗子生长的土壤中，分别在胁迫前、胁迫后 30min，3小时、6小时后取样。总RNA的提取采用TRIZOL试剂(购自Invitrogen公司) 提取，提取方法按照上述TRIZOL试剂说明书)，利用反转录酶SSIII (购自Invitrogen 公司)将其反转录合成cDNA(方法根据Invitrogen公司反转录酶试剂说明书)，反 应条件为65°C 5min,50°C 120min,70°C IOmin0以上述反转录合成的cDNA为模板， 用弓丨物(5， -ATCGCCAACGTGCCCTACT-3’ 和 5’ -GCACACCTTCGAACTTGTCCAT-3，)对 DSM2 基因进行特异的PCR扩增。同时用引物(AF 5 ’ -TGGCATCTCTCAGCACATTCC-3，和AR 5’ -TGCACAATGGATGGGTCAGA-3’ )对水稻Actinl基因做特异扩增(扩增产物长76bp)，以 作为内对照进行定量分析。反应条件为95°C 5min ；95°C 10sec，60°C 5sec，72°C 34sec，45 个循环。反应过程中进行荧光检测实时定量分析。结果表明，DSM2基因(SEQ NO 1)在高 盐、紫外线和干旱处理后诱导上升表达，在低温胁迫中也有轻微地下降表达，组织表达谱取自野生型中花11号(一个公开推广应用的水稻品种)各个发育时期的组织样品，检测发现 DSM2存在典型的组织发育特异性(图3)。实施例3 鉴定突变体干旱胁迫表型将已鉴定好基因型的纯合突变体(dsm2)和野生型家系(CK)催芽后直播到小圆桶 中。试验用的土壤为中国南方水稻土与粗沙按体积比为2 3混合而成，每圆桶等量均勻 沙土加等体积水，水自行渗漏确保土壤的紧实度一致，试验设3次重复。对健康生长的4叶 期的植株进行断水干旱胁迫6-10天(具体根据天气情况而定)，然后复水恢复5天，拍照并 调查植株的存活率。与野生型对照相比，T-DNA纯合植株表现为干旱敏感表型，在高度胁迫 复水后，纯合植株基本全部死亡，而野生型仍有80%以上的存活率。该试验取三个突变体家 系每个家系设3次生物学重复，结果一致。说明该突变表型确实是T-DNA插入造成的。为了验证该突变体的遗传稳定性及进一步验证共分离情况，将Tl代杂合单株收 获的种子播种得到T2代纯合，杂合和阴性种子。同样经行上述胁迫实验，结果纯合突变体 较阴性对照对干旱敏感(图4)。为了鉴定突变体孕穗期的表型将突变体及其对照种植于上面有可移动遮雨棚的 沙土大田中南方水稻土与粗沙按体积比为1 2混合而成，每行10株每家系种植3行，试 验设3次生物学重复做严重干旱胁迫实验。同时在PVC管(南方水稻土与粗沙按体积比为 1 2混合)中做中度干旱胁迫实验。正常生长条件是在常规水田中进行。干旱胁迫是对 健康生长的孕穗期植株进行断水15-20天(具体根据天气情况而定，雨天有可移动遮雨棚 覆盖)，然后复水恢复7天拍照。与杂合家系分离出的阴型对照相比，T-DNA纯合植株表现 为干旱敏感表型(图5)，一个月后收割地上部分称量地上部分生物量并考种发现突变体在 中度干旱胁迫及严重干旱胁迫条件下地上部分生物量(图6)及结实率(图7)均显著低于 对照。实施例4 :DSM2基因超量表达载体的构建和遗传转化为了能更好的分析DSM2基因的功能，申请人将其在水稻中超量表达。从转基因植 株的表型研究该基因的功能。其突变体对干旱敏感，申请人将这个基因命名为dsm2。超量表达载体构建方法如下首先通过杳找DSM2基因在水稻基因组注释网站 TIGRChttp//www. tigr. org)DSM2 注释号L0C 0s03r03370,与 KOME (http//cdnaOl. dna. affrc. go. jp/cDNA/)DSM2注释号AK287823，预测为一个编码β -胡萝卜素羟化酶的基因 (该基因的完整核苷酸序列见SEQ ID Ν0:1所示，其编码区核苷酸长度为858bp，核苷酸 序列对应的氨基酸序列为285个)，依次为参考设计引物。以水稻品种“中花11”干旱处 理3天后的总RNA反转录得到的混合cDNA为模板，用引物DSM2FLF(5，-GGGGACCACTTTGTA CAAGAAAGCTGGGTATGGCCGTCGCGAGGCTGGT-3，)和 DSM2FLR(5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCT GGGTTCATTGGATCGCATCTAAG-3，)，扩增出包含DSM2基因完整编码区的cDNA片断(该完整 编码区的cDNA片断是否就是SEQ ID NO=I中的从1-858位的核苷酸序列)，反应条件为 94°C预变性 5min ；94°C 30sec,50°C 30sec,72°C 50sec，30 个循环；72°C延伸 5min。用上海 生工生物工程技术服务有限公司生产的DNA片段回收试剂盒，向PCR产物中加入3倍体积 的binding缓冲液(buffer)，移入回收柱中，8000rpm离心lmin，弃流出的液体，向回 柱 中力口入 500 μ 1 washing buffer，8000rpm 离心 lmin，再向回收柱中力口入 500 μ 1 washingbuffer，8000rpm再离心lmin，在超净工作台上把回收柱吹干，加入elution buffer 20 μ 1，静置5min，后12000rpm离心2min，得到纯化的PCR产物即DSM2基因，取1μ 1上述 纯化后的PCR产物(DSM2基因)，0· 3μ 1 pD0NR207中间载体(Invitrogen公司)，1 μ 1 BP 重组酶及缓冲体系混合液(购自Invitrogen公司)，2. 7 μ 1 ddH20,室温(25°C )反应12 小时将DSM2基因导入到骨架载体pCB2004H(35S启动子，由华中农业大学作物遗传改良 国家重点实验室改造，图12。)构建成超量表达载体，其后转化大肠杆菌DHlO β (该大肠 杆菌DHlOii菌株购自Invitrogen公司)。通过PCR筛选阳性克隆，取阳性克隆中间载体 DSM2-0X-pD0NR207 (Invitrogen 公司)质粒 1 μ 1，1 μ lpCB2004H, 1 μ 1 LR 重组酶及 buffer 混合液，2 μ IddH2O,于室温(25 °C)反应12小时，其后转化大肠杆菌DHlO β (大肠杆菌 DHlO β菌株，pD0NR207载体及BP以及LR重组酶君购自Invitrogen公司)。通过PCR筛 选阳性克隆，为最终目标载体，被命名为遗传转化的DSM2-0X-pCB2004H(载体上的DSM2基 因序列就是SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列，序列长度为858bp)(图12)。通过农杆菌介导的水稻遗传转化方法(其具体步骤如下所述)将上述超表达载体 DSM20X-pCB2004H转入到水稻品种“中花11”(中国水稻研究所提供的一个公开使用的水稻 品种)中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、练苗、移栽， 得到转基因植株。上述农杆菌介导的水稻(中花11)遗传转化方法(体系)在Hiei等人 艮道的方法(Hiei 等，Efficient transformation of rice, Oryza sativa L. , mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA,Plant J, 6 =271-282,1994)基础上改良进行。本实施例的具体遗传转化步骤如下(1)电转化将最终超表达目标载体DSM2-0X_pCB2004H(图12)，用1800v电压，电 转化入农杆菌EHA105菌株，涂到带有对应抗性选择的LA培养基上，筛选出阳性克隆，用于 下述转化愈伤。(2)愈伤组织诱导将成熟的水稻种子中花11 (中国水稻研究所提供的一个公开 使用的水稻品种)去壳，然后依次用70%的乙醇处理1分钟，0. 15%氯化汞(HgCl2)种子 表面消毒15分钟；用灭菌水洗种子4-5次；将该消过毒的种子放在诱导培养基上(成分见 后)；将接种后的愈伤组织诱导培养基置于黑暗处培养4周，温度25士 1°C。(3)愈伤继代挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基(成分 见后)上黑暗下培养2周，温度25士 1°C。(4)预培养挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基(成分见后)上黑暗 下培养2周，温度25士 1°C。(5)农杆菌培养在带有对应抗性选择的LA培养基上(成分见后)预培养农杆菌 EHA105 (来源于CAMBIA，商用菌株，携带有本发明的超表达载体DSM20X_pCB2004H)两天，培 养温度28°C ；将所述的农杆菌转移至悬浮培养基(成分见后)里，28°C摇床上培养2-3小 时。(6)农杆菌侵染将预培养的愈伤转移至灭菌好的瓶子内；调节农杆菌的悬浮液 至0D6000. 8-1. O ；将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸 干；然后放置在共培养基(成分见后)上培养3天，培养温度19-20°C。(7)愈伤洗涤和选择培养灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；浸泡在含400ppm羧苄青霉素(CN)的灭菌水中30分钟；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；转移愈伤至选择培 养基(成分见后)上选择2-3次，每次2周(第一次筛选羧苄青霉素浓度为400ppm，第二次 以后为250ppm，潮霉素浓度250ppm)。(8)分化将抗性愈伤转移至预分化培养基(成分见后)上黑暗处培养5-7周；转 移预分化培养的愈伤至分化培养基上(成分见后)，光照下培养，温度26°C。(9)生根剪掉分化时产生的根；然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3 周，温度26 0C ο(10)移栽洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最 初的几天保持水分湿润。培养基组分及其配方(1)试剂和溶液缩写本发明中培养基所用到的植物激 素的缩写表示如下6_BA(6-BenzylaminoPurine,6-苄基腺嘌呤)；CN(Carbenicillin, 羧节青霉素)；KT(Kinetin，激动素)；NAA (Napthalene acetic acid,萘乙酸)； IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；2,4-D(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid, 2, 4_二itifiZiSI) ；AS(Acetosringone,；CH(CaseinEnzymatic Hydrolysate, 水解酪蛋白)；HN(Hygromycin B，潮霉素)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜)； N6max (N6大量成分溶液)；N6mix (N6微量成分溶液)；MSmax (MS大量成分溶液)；MSmix (MS 微量成分溶液)。(2)主要溶液配方1)N6培养基大量元素母液[10倍浓缩液(IOX)]的配制硝酸钾(KNO3)28. 3g磷酸二氢钾(KH2PO4)4. Og硫酸铵((NH4)2SO4)4. 63g硫酸镁(MgSO4· 7H20)1. 85g氯化钙(CaCl2· 2H20)1. 66g逐一溶解，然后室温下定容至IOOOml。2)N6培养基微量元素母液[100倍浓缩液(100X)]的配制碘化钾(KI)0. 08g硼酸(H3BO3)0. 16g硫酸锰(MnSO4· 4H20)0. 44g硫酸锌(ZnSO4· 7H20)0. 15g室温下溶解并定容至1000ml。3)铁盐(Fe2EDTA)贮存液(100X)的配制准备800ml双蒸水并加热至70°C，加入乙二铵四乙酸二钠(Na2EDTA · 2H20) 3. 73 克，充分溶解后在70°C水浴中保持2小时，定容至1000ml，4°C保存备用。4)维生素贮存液(100X)配制烟酸(Nicotinicacid)0. Ig维生素Bl (Thiamine HCl)0. Ig维生素B6(Pyridoxine HCl)0. Ig甘氨酸(Glycine)0. 2g0077
0078
0079
0080 0081 0082
0083
0084
0085
0086
0087
0088
0089
0090
0091 为mg
0092
0093
0094
0095
0096
0097
0098
0099
0100 0101 0102
0103
0104
0105 50ml
肌醇(Inositol)IOg
加水定容至1000ml，4°C保存备用。
5)MS培养基大量元素母液(IOX)的配制 硝酸铵(NH4NO3)16. 5g 硝酸钾 19. Og 磷酸二氢钾 1. 7g 硫酸镁 3. 7g 氯化钙 4.4g 室温下溶解并定容至1000ml。
6)MS培养基微量元素母液(100X)的配制 碘化钾0.083g 硼酸 0.62g 硫酸锰 0.86g 钼酸钠(Na2MoO4 · 2H20) 0. 025g 硫酸铜(CuSO4 · 5H20) 0. 0025g 室温下溶解并定容至1000ml。
7)2，4-0贮存液，6-8々贮存液，萘乙酸(NAA)贮存液，吲哚乙酸(IAA)贮存液1均
ml ο
8)葡萄糖贮存液0.5g/ml。
9)AS贮存液的配制秤取AS 0. 392g，DMSO IOmlt (3)用于水稻遗传转化的培养基配方
1)愈伤组织诱导培养基
N6max 母液(IOX) N6mix 母液(100X) Fe2+EDTA 贮存液(100X) 维生素贮存液(100X) 2，4-D贮存液 脯氨酸(Proline) CH
蔴糖(Sucrose) Phytagel
IOOml IOml IOml IOml 2. 5ml 0. 3g 0. 6g 30g
3g
加蒸馏水至900ml，IN氢氧化钾调节pH值到5. 9，煮沸并定容至1000ml，分装到 角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。
0106]2)继代培养基0107]N6max 母液(IOX)IOOml0108]N6mix 母液(100X)IOml0109]Fe2+EDTA 贮存液(100X)IOml0110]维生素贮存液(100X)IOml0111]2，4-D贮存液2. Oml0112]
0113]
0114]
0115]
0116] 50ml Ξ
0117]
0118]
0119]
0120] 0121] 0122]
0123]
0124]
0125]
0126]
基并加入5ml葡萄糖贮存液和250 μ 1 AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)
脯氨酸
CH
蔗糖
Phytagel
0. 5g 0. 6g 30g 3g
加蒸馏水至900ml，IN氢氧化钾调节pH值到5. 9，煮沸并定容至1000ml，分装到 角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。 3)预培养基
N6max 母液(IOX)12. 5ml
N6mix 母液(100X)1. 25ml
Fe2+EDTA 贮存液(100X)2.5ml
维生素贮存液(100X)2. 5ml
2，4-DC存液0.75ml
CH0. 15g
蔗糖5g
琼脂粉(Agarose)1. 75g
加蒸馏水至250ml，IN氢氧化钾调节pH值到5. 6，封口灭菌。使用前加热溶解培养
0127]4)共培养基0128]N6max 母液(IOX)12. 5ml0129]N6mix 母液(100X)1. 25ml0130]Fe2+EDTA 贮存液(100X)2. 5ml0131]维生素贮存液(100X)2. 5ml0132]2，4-D贮存液0. 75ml0133]CH0. 2g0134]蔗糖5g0135]琼脂粉1.75g0136]加蒸馏水至250ml，IN氢氧化钾调节pH值到5. 6，封口灭菌。使用前加热溶解培养
基并加入5ml葡萄糖贮存液和250 μ 1 AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/每皿)
0137]5)悬浮培养基0138]N6max 母液(IOX)5ml0139]N6mix 母液(100X)0. 5ml0140]Fe2+EDTA 贮存液(100X)0. 5ml0141]维生素贮存液(100X)Iml0142]2，4-D贮存液0. 2ml0143]CH0. 08g0144]蔗糖2g0145]加蒸馏水至IOOml，调节pH值到5.4，分装到两个角瓶中，封口灭菌。使
用前加入Iml葡萄糖贮存液和100 μ 1 AS贮存液t
6)选择培养基
N6max 母液(IOX)25ml
N6mix 母液(100X)2. 5ml
Fe2+EDTA 贮存液(100X)2. 5ml
维生素贮存液(100X)2. 5ml
2，4-D贮存液0.625ml
CH0. 15g
蔗糖7. 5g
琼脂粉1.75g
加蒸馏水至250ml，调节pH值到6. 0，封口灭菌。使用前溶解培养基，加入250 μ 1HN和400ppmCN，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。
7)预分化培养基
N6max 母液(IOX)25ml
N6mix 母液(100X)2. 5ml
Fe2+EDTA 贮存液(100X)2. 5ml
维生素贮存液(100X)2. 5ml
6-BA贮存液0. 5ml
KT贮存液0. 5ml
NAA贮存液50 μ 1
IAA贮存液50 μ 1
CH0. 15g
蔗糖7. 5g
琼脂粉1.75g
加蒸馏水至250ml，IN氢氧化钾调节pH值到5.9，封口灭菌。使用前溶解培养基，加入250μ 1 HN和200ppm CN，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。
8)分化培养基
N6max 母液(IOX)100ml
N6mix 母液(100X)IOml
Fe2+EDTA 贮存液(100X)IOml
维生素贮存液(100X)IOml
6-BA贮存液2ml
KT贮存液2ml
NAA贮存液0. 2ml
IAA贮存液0. 2ml
CHIg
蔗糖30g
Phytagel3g
加蒸馏水至900ml，IN氢氧化钾调节pH值到6.0。煮沸并定容至1000ml，分装到
50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口灭菌。
9)生根培养基
MSmax 母液(IOX)50mlMSmix 母液(100X)5mlFe2+EDTA 贮存液(100X)5ml维生素贮存液(100X)5ml蔗糖30gPhytagel3g加蒸馏水至900ml，IN氢氧化钾调节pH值到5. 8。煮沸并定容至1000ml，分装到 生根管中(25ml/管)，封口灭菌。实施例5 :DSM2超量表达转基因T1代家系在干旱胁迫下的生长状况本实施例选取了转DSM2基因(序列见序列表SEQ NO 1)的超量表达的T1家系(编 号为DSM2-0X)进行了干旱胁迫实验。具体步骤如下将超量表达转基因家系(DSM2-0X)种 子去壳消毒(浓度为70%酒精处理lmin，0. 15%氯化汞处理lOmin，无菌水清洗数次)，在 含有50mg/L潮霉素的V2MS培养基上发芽，转基因但没有超表达家系做对照(CK)家系晚 一天播于不含潮霉素的1/2MS培养基上，2-3天后挑选发芽好且长势一致的种子转移到小 圆桶中。试验用的土壤为南方水稻土与粗沙按体积比为2 3混合而成，每圆桶等量均勻 沙土加等体积水，水自行渗漏确保土壤的紧实度一致，试验设3次重复。对健康生长的4叶 期的植株进行断水干旱胁迫6-10天(具体根据天气情况而定)，然后复水恢复5天，拍照并 调查植株的存活率。与对照相比，超量表达植株表现为抗干旱表型，在高度胁迫复水后，对 照植株基本全部死亡，而野生型仍有50%以上的存活率。该试验取三个超表达家系每个家 系设3次生物学重复，结果一致。说明该超表达DSM2基因的确提高转基因植株抗干旱的能 力(图8)。孕穗期干旱胁迫是在塑料大棚下的PVC管(南方水稻土与粗沙按体积比为1 2 混合，直径17cm，高度1. 2m)中做干旱胁迫实验。超表达幼苗的筛选同上，选取了 DSM2基因 (SEQ NO 1)超量表达T1代超表达家系DSM2-0X和转基因但没有超表达家系做对照CK进行 了干旱胁迫实验。具体步骤如下将超量表达转基因家系DSM2-0X和CK种子去壳消毒(浓 度为70 %酒精处理Imin，0. 15 %氯化汞处理IOmin，无菌水清洗数次)，在含有50mg/L潮霉 素的1/2MS培养基上发芽，对照CK晚一天播于不含潮霉素的1/2MS培养基上，2-3天后挑选 发芽好且长势一致的种子转移到PVC管中，让其在水分充足的条件下正常生长至孕穗期开 始不再浇水，使其自行干旱胁迫。胁迫至12天后，拍照，统计看到超表达植株绿叶数显著高 于对照(图10)，并做的I-IK碘染实验检测花粉的育性，步骤如下分别取同一时期的 超表达超量表达的T1家系(DSM2-0X)及对照CK的花药，置于载玻片上，滴一滴的I-IK 染液染色Imin后，在显微镜下观察，DSM2-0X超表达植株在干旱胁迫后具有较对照CK有较 高的育性(图11)。实施例6 :DSM2超量表达T1代家系、突变体及野生型中类胡萝卜素含量的测定取DSM2基因(序列见序列表SEQ ID NO 1)超量表达T1代家系(编号为DSM2-0X)、 突变体(编号为dsm2)及野生型对照CK (未转基因)4-5叶期植株的地上部分，提取类胡萝
卜素，方法如下每一家系取0. 5g苗期叶片，液氮磨碎后加入1.5ml甲醇，4°C轻摇5分钟 后，加入800ul，2. 5M Tris-HC1，4M NaCl 500 μ 1，4°C轻摇10分钟。再加入4ml氯仿，置于冰 盒上，期间轻摇几次，40C 4000rpm离心5min，轻轻吸取黄色上清(水相)4ml，重复该步骤4次，后置于冰盒上用氮吹仪吹干。用200μ 1，甲醇溶解。用液相色谱仪检测。结果表明突变体 中番茄红素、叶黄素、α-胡萝卜素、及胡萝卜素含量均上升。但叶黄质含量显著下降。 而DSM2超量表达的转基因植株中的叶黄质显著上升，胡萝卜素显著下降，而番茄红素、 叶黄素、α-胡萝卜素、没有显著变化(表1)。可以断定DSM2基因编码的蛋白质为β-胡 萝卜素羟基化酶，即催化胡萝卜素转化成叶黄质，而叶黄质可以提高对干旱造成的氧 'iWiiWiiliiBi^ilH$ (Tian,L. Musetti，V. Kim, J. Magallanes-Lundback,M. DellaPenna, D. The Arabidopsis LUTl locus encodes a member of thecytochrome p450 family that is required for carotenoid epsilon-ring hydroxylation activity. ProcNatl Acad Sci，2004，101 402-407 ；Tian, L. Magallanes-Lundback, M.Musetti, V. DellaPenna, D. Functional analysis of beta—and epsilon-ring carotenoid hydroxylases in Arabidopsis. PlantCell, 200315 :1320_1332)。因此，上述结果说明DSM2基因对抗旱性贡 献可能主要是通过DSM2催化β-胡萝卜素变成叶黄质的反应控制叶黄质的含量来实现的。 本发明对类胡萝卜素及DSM2基因催化的代谢相关物质含量测定间表1所示。表1类胡萝卜素及DSM2基因催化的代谢相关物质含量测定
权利要求
一种控制水稻抗旱性的基因DSM2在水稻抗旱性遗传改良中的应用，其特征在于该基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示。
2.一种控制水稻抗旱性的基因DSM2在水稻抗旱性遗传改良中的应用，其特征在于该 基因的蛋白质的序列如序列表SEQ ID N0:2所示。
全文摘要
本发明涉及植物基因工程技术领域。本发明分离、克隆和通过生物学功能验证得到一种能够提高水稻对干旱耐受能力的基因DSM2，属于一种β-胡萝卜素羟化酶基因。采用筛选T-DNA插入水稻突变体库的方法，从水稻突变体库中克隆得到与水稻抗旱性状相关的基因DSM2，共分离检测表明该突变体与干旱敏感表型是紧密连锁的，利用农杆菌介导的遗传转化方法，使该基因在水稻中超量表达，提高了转基因水稻抗干旱的能力，研究证实了该基因作为抗旱功能的新用途。所述β-胡萝卜素羟化酶基因DSM2的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示，序列长度为858bp，编码285个氨基酸，其蛋白质的序列如SEQ ID NO2所示。
文档编号C12N15/53GK101979584SQ20101023158
公开日2011年2月23日 申请日期2010年7月15日 优先权日2010年7月15日
发明者熊立仲, 都浩 申请人:华中农业大学