专利名称：樱桃s基因型的快速鉴定方法
技术领域：
本发明涉及一种快速、低成本鉴定樱桃S基因型的方法。
背景技术：
樱桃S基因型的鉴定，均需要提取樱桃基因组DNA，现有技术常采用CTAB法提取， 具体步骤如下1.将樱桃叶片去掉主要脉络后加液氮研磨(可加入适量石英砂)成细粉状，分装到1. 5ml离心管中。2.加入 600 μ 1 预热 CTAB 提取液(Tris 100mM,NaCl 1. 4Μ, EDTA 20mM,2% CTAB, 2% PVP，pH 8. 0)和2%巯基乙醇(现用现加)，混勻，65°C水浴2_4h，期间可颠倒混勻几次。3.取出离心管，12000rpm 离心 lOmin。4.取上清，加600 μ 1氯仿，混勻，12000rpm离心5min。5.取上清，2V预冷无水乙醇沉淀，用灭菌牙签将沉淀挑出，晾干后溶于400 μ 1 TE 溶液(10mmol/l Tris · Cl, Immol/IEDTA, pH 8. 0)。6.力卩入 2 μ IRNaseA (10mg/ml)，37°C 2h。7.力口 400μ 1 酚/氯仿(1 1)，混勻，12000rpm 离心 5min。8.重复一次。9.取上清，加500μ 1氯仿，混勻，12000rpm离心5min。10.取上清，2V预冷无水乙醇沉淀，12000rpm离心5min。11.用75%乙醇吹洗沉淀，12000rpm离心3min。12.弃掉液体，12000rpm 离心 anin。13.将多余液体吸出，真空干燥5-lOmin。14.将干燥后的沉淀溶于40μ 1 TE溶液(同上)中，备用。问题在于，现有技术的这种提取方法效率很低，需要5-7小时。而后针对樱桃S基因型进行PCR反应，对PCR产物进行凝胶电泳及成像鉴定，问题在于，现有技术的PCR反应成本较高。
发明内容
本发明针对上述问题，以现代生物技术为基础，旨在提供一种鉴定范围较广、操作简便、速度快、成本低的樱桃S基因型快速鉴定方法，从而为栽培樱桃合理的配置授粉树， 实现樱桃自交亲和育种，并未为樱桃自交亲和新品种育种提供理想的种质资源，为鉴定更多的S基因包括S4’基因等提供有效方法。为了达到上述目的，本发明提供了一种鉴定樱桃S基因的方法，包括如下步骤步骤Sl 樱桃基因组DNA提取技术，具体过程包括a取100_200mg已经去掉主要脉络的樱桃叶片、加Hmg石英砂在液氮辅助下研磨成粉末状，移入1. 5ml Eppendorf管中，加入600 μ 1缓冲液，混勻；4°C，12000rpm，离心5分钟；b取上清，加入体积比25 M 1的酚氯仿异戊醇溶液，混勻，4°C， 12000rpm，离心5分钟；c取上清，加入体积比M 1的氯仿异戊醇溶液，混勻，40C，12000rpm,离心5分钟。重复1-2次，以蛋白层不出现为止；d取水相，加2. 5倍体积的无水乙醇和1/10体积3mol/L pH5. 3NaAc,混勻。_20°C 放置0. 5小时。4°C，12000rpm，离心5分钟；e弃上清，用70%无水乙醇洗沉淀1次；f室温下干燥后，溶于30-50 μ 1 TE或DEPC水中，-20 V或-70 V保存备用。步骤 S2 制备AS-PCR体系10XPCR Buffer 2. 5 μ L，浓度 25mmol · L-1 的 MgC12 1 μ L,浓度 2. 5mmol · L-1 的 dNTPs 0. 5 μ L,序列为5，-ACTTGTTCTTGGTTTCGCTTTCTTC-3，浓度为 10 μ mo 1 · Γ1 的上游引物 1 μ L,序列为 5，-CATGGATGGTGAAGTATTGTAATGG-3，浓度为 10 μ mol · Γ1 的下游弓 | 物 IyL,50 IOOng 的 DNA 2 μ L,浓度5U · μ Γ1 的 iTaq DNA 聚合酶 0. 3 μ L，PCR反应总体积25 μ L ；步骤S3 =AS-PCR反应程序预变性94°C 3min ；94°C变性 lmin，退火 lmin，72°C延伸 lmin，共 30 个循环； 最后72°C延伸IOmin ；步骤S4 将PCR产物进行凝胶电泳及成像鉴定。综上，根据上述检测过程，本发明还提供了一种樱桃S基因型快速鉴定试剂盒，含有PCR Buffer,dNTPs,Taq DNA聚合酶以及DNA Marker。还含有樱桃S基因的特异性引物对，如下上游引物5，-ACTTGTTCTTGGTTTCGCTTTCTTC-3，，下游引物5，-CATGGATGGTGAAGTATTGTAATGG-3，。优选方式下，本发明樱桃S基因型快速鉴定试剂盒，还包括PCR Buffer :10 X PCR Buffer 2. 5 μ L ；MgCl2 浓度为25mmol · Γ1，用双蒸水配制，放置在1. 5毫升Eppendorf管中，每个管中1毫升；dNTPs 浓度为2. 5mmol ·厂1，用双蒸水配制，放置在1. 5毫升Eppendorf管中，每个管中1毫升；引物1 浓度为IOymol · L—1，用双蒸水配制，放置在1. 5毫升Eppendorf管中，每个管中1毫升；引物2:浓度为IOymol · L—1，用双蒸水配制，放置在1. 5毫升Eppendorf管中，每个管中1毫升；Taq DNA 聚合酶5U · μ Γ1。
本发明的原理在于根据S基因保守序列设计PCR反应特异引物，该特异引物以樱桃基因组DNA为模板与变性的基因组DNA单链复性，此后在Taq DNA聚合酶的作用下，四种脱氧核糖核苷酸按照碱基配对原则陆续加在该引物的后面，形成子链DNA分子。该子链DNA 分子作为下一次循环的模板，合成出新一代的子DNA分子，这种过程不断重复进行，各种S 基因的拷贝大量增加，最后可通过电泳检测到。本试剂盒在樱桃的栽培和育种方面都有很好的应用前景。表现在，1.本试剂盒可以确定樱桃品种的S基因型，为樱桃授粉树的配置提供准确的DNA水平上的遗传基础，有利于樱桃授粉树的合理配置；2.本试剂盒可为樱桃自交亲和育种提供一种十分有效的早期选择方法，该方法大大地降低了实验工作量，节省了实验地和研究经费，使得实验研究不受季节及植株生长时期的限制；3.通过应用本试剂盒选育出的樱桃自交亲和的纯合体种质可为樱桃自交亲和新品种育种提供理想的种质资源。本试剂盒可以鉴定更多的S基因包括 S4’基因，且操作简便、成本低。因此该技术的推广使用已具备了市场和技术基础，具有推广应用的现实性。特别是本发明的步骤Sl樱桃基因组DNA提取技术，与现有技术的CTAB法相比，本研究所采用的DNA提取方法提取DNA所用时间为60-65分钟，而CTAB法所用时间大约为 5-7小时。两种方法所提取的DNA纯度基本一致，均为1. 7-1. 8，都可满足PCR反应之需。
而在PCR反应成本上，本发明的PCR反应成本要低很多，仅是现有技术类似方法的 43% -58%。见下表。AS-PCR成本核算(一个样品)
权利要求
1. 一种樱桃S基因型的快速鉴定方法，其特征在于，包括步骤(Si)樱桃基因组DNA提取技术，具体过程包括(Sla)取100-200mg已经去掉主要脉络的樱桃叶片、加l_2mg石英砂在液氮辅助下研磨成粉末状，移入1. 5ml Eppendorf管中，加入600 μ 1缓冲液，混勻；、4°C，12000rpm，离心5 分钟；(Slb)取上清，加入体积比依次为25 24 1的酚、氯仿、异戊醇溶液，混勻，4°C， 12000rpm，离心5分钟；(Slc)取上清，加入体积比依次为M 1的氯仿、异戊醇溶液，混勻，4°C，12000rpm，离心5分钟。重复1-2次，以蛋白层不出现为止；(Sld)取水相，加2. 5倍体积的无水乙醇和1/10体积3mol/L pH5. 3的NaAc，混勻；_20°C放置0. 5小时；4°C，12000rpm，离心5分钟； (Se)弃上清，用、70%无水乙醇洗沉淀1次；(Slf)室温下干燥后，溶于30-50 μ 1 TE或DEPC水中，-20°C或_70°C保存备用； 步骤(S》制备AS-PCR体系，如下、10XPCR Buffer 2. 5 μ L，浓度 25mmol · L-1 的 MgC12 1 μ L, 浓度 2. 5mmol · Γ1 的 dNTPs 0. 5 μ L,序列为 5，-ACTTGTTCTTGGTTTCGCTTTCTTC-3，浓度为 10 μ mo 1 · Γ1 的上游引物 1 μ L，序列为 5，-CATGGATGGTGAAGTATTGTAATGG-3，浓度为 10 μ mo 1 · Γ1 的下游引物 1 μ L，、50 IOOng 的 DNA 2 μ L,浓度 5U · μ Γ1 的 iTaq DNA 聚合酶 0. 3 μ L，PCR反应总体积25 μ L ；步骤(S； ) AS-PCR反应程序预变性94°C 3min ；94°C变性lmin，退火lmin，72°C延伸lmin，共30个循环；最后 72°C延伸 IOmin ；步骤(S4)将PCR产物进行凝胶电泳及成像鉴定。
全文摘要
本发明一种樱桃S基因型的快速鉴定方法，包括步骤1樱桃基因组DNA提取。步骤2制备AS-PCR体系及反应，其中，樱桃S基因的特异性引物对为上游引物5’-ACTTGTTCTTGGTTTCGCTTTCTTC-3’，下游引物5’-CATGGATGGTGAAGTATTGTAATGG-3’。步骤3将PCR产物进行凝胶电泳及成像鉴定。本发明旨在提供一种操作简便、速度快、成本低、鉴定范围较广的樱桃S基因型快速鉴定方法，以便为樱桃栽培时合理地配置授粉树，为樱桃自交亲和育种，为樱桃自交亲和新品种育种提供理想的种质资源，为鉴定更多的S基因包括S4’基因等提供一种十分有效的方法。
文档编号C12Q1/68GK102373272SQ20101026396
公开日2012年3月14日 申请日期2010年8月26日 优先权日2010年8月26日
发明者侯义龙 申请人:大连大学