专利名称：一种l-色氨酸的生产方法
技术领域：
本发明涉及一种氨基酸的生产方法，具体涉及-于微生物发酵技术领域。
-种L-色氨酸的发酵生产方法，属
学名吲哚基丙氨酸；英文名
背景技术：
L-色氨酸是含有吲哚基的中性芳香族氨基酸 Tryptophan ；分子式为=C11H12N2O2，相对分子质量204. 21，熔点2890C0其结构式如下
.·~. ■ ■ .一· ■ ■ % ··_·· .·_"· ■ LH^-UH-L,UU
^ I,
:Hz\ /NH,r
NH
L-色氨酸为白色或微黄色结晶或结晶性粉末；无臭味微苦。水中微溶，在乙醇中极微 溶解，在氯仿中不溶，在甲酸中易溶，在氢氧化钠溶液或稀盐酸中溶解。它广泛地存在于天 然蛋白质中。L-色氨酸除在营养代谢中起重要作用外，还广泛用于医药、食品、饲料等方 面。近年来，随着色氨酸在医药、食品和饲料等方面应用的开拓，市场需求量不断增加。L-色氨酸是人体和动物生命活动中八种必需的氨基酸之一，对人和动物的生长发 育、新陈代谢起着重要的作用，被称为第二必需氨基酸。广泛应用于医药、食品和饲料等方 面。在生物体内，从L-色氨酸出发可合成5-羟基色胺、吲哚乙酸、烟酸、色素、生物碱和辅 酶等激素和生理活性物质。这些激素和生理活性物质参与生物体特定的生命活动。其中吲 哚乙酸是一种植物生长激素，5-羟基色胺是脊椎动物的一种神经递质，它在神经系统中的 含量与神经的兴奋和抑制状态有密切关系，同时它也是一种血管收缩素。因此，色氨酸具有 消除精神紧张、改善睡眠效果、预防和治疗糙皮病等功效，在医学上被用作氨基酸注射液和 复合氨基酸制剂。另外，由于色氨酸是一些植物蛋白中容易严重缺乏的氨基酸，可用它来强 化食品和做饲料添加剂，这对提高植物蛋白质的利用率具有重要的作用，它是继蛋氨酸和 赖氨酸之后的第三大饲料添加氨基酸。此外，L-色氨酸还有防霉、消毒以及阻止氧化的作 用，可以作为鱼类保鲜剂。L-色氨酸的生产方法有化学合成法、蛋白质水解法、酶促转化法和发酵法。由于 化学合成法和蛋白质水解法需要大量有机溶剂，存在原料来源及环境污染等问题，在生产 中极少使用；酶促转化法成本较高，污水量大，但由于产物浓度高、收率高、纯度高、副产物 少、精制操作容易等优点，现在还有厂家在使用。发酵法生产L-色氨酸由于其产率高、周期 短、控制容易等优点，目前已经成为工业化生产L-色氨酸的重要方法。以谷氨酸棒杆菌为 发酵菌种制备L-色氨酸具有产量高、产物中副产物少、便于产物分离提取等优点，因而，谷 氨酸棒杆菌成为L-色氨酸发酵工业最重要的生产菌。20世纪30年代日本就大规模开展了 发酵法生产L-色氨酸研究，主要侧重于传统的诱变育种技术改变菌种特性，提高L-色氨酸 产量，最高达7. 2g/L，近几年对L-色氨酸发酵研究较少。而我国对氨基酸系列的化合物的 研究始于70年代，随着L-色氨酸市场需求激增，越来越多的科研机构对L-色氨酸发酵进
5行了全面深入的研究。据调查显示，目前国内L-色氨酸发酵水平与世界先进水平有很大差 距。主要原因是育种技术、生产工艺落后，菌种产酸水平不高；发酵周期长、转化率及提取综 合收率低。因此，开发高产L-色氨酸工程菌和高效生产工艺是十分必要的。
发明内容
本发明针对上述生产L-色氨酸技术的不足，提供了一种产酸水平高、生产成本低 的L-色氨酸的生产方法。本发明是通过以下措施实现的
一种L-色氨酸的生产方法，其特征是至少包括以下步骤
(1)以谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)为菌种，经初级培养后进行摇瓶 培养得摇瓶液体菌种；
(2)以玉米为原料，经浸泡、磨浆、液化、糖化等步骤制得葡萄糖液，所得葡萄糖液作为 培养基的碳源及发酵流加糖；
(3)将摇瓶液体菌种进行二级培养得二级菌种，然后将二级菌种进行发酵培养得 L-色氨酸发酵液；
(4)将L-色氨酸发酵液进行提取、精制得L-色氨酸。上述摇瓶液体菌种培养至少包括以下步骤
a.以谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)为母种，按 0. 1%-0. 2% (ν/ν)的 接种量接入初级培养基中，在30°C _33°C下静置培养20-24h得初级菌种；初级培养基组分 按重量比计为葡萄糖1%，磷酸氢二钾0. 2%，硫酸镁0. 1%，酵母浸粉2%，琼脂2%，水94. 7%， ρΗ7· 0-7. 2 ；
b.将得到的初级菌种培养基液接种到摇瓶培养基中，在往复式摇床上培养，得0D_ 为0. 6-0. 8的摇瓶液体菌种；接种量为0. 1%-0. 2%( ν/ν)，摇床转速为120-140转/分，培 养温度为30°C _33°C，培养时间为16-18h，摇瓶培养基组成葡萄糖2%，磷酸氢二钾0. 2%， 硫酸镁 0. 1%，酵母浸粉 1%，豆浓 2%,/jC 94. 7%，pH 7. 0-7. 2。上述葡萄糖液的制备至少包括以下步骤
a.将玉米放入浸泡罐中，在50-55 °C下浸泡3-5h ；
b.浸泡后将玉米磨成乳浆；
c.将玉米乳浆用液化喷射器在105°C _108°C条件下高温液化，然后在维持罐中保温 维持90 - 120min得液化液；
d.将步骤c后的液化液泵入糖化罐，加入液体糖化酶进行糖化得糖化液，液体糖 化酶加入量为80-120单位/g纯淀粉，糖化温度为55-65°C，pH为3. 8-4. 5，糖化时间为 33-36h ；所用糖化酶又称葡萄糖淀粉酶，糖化酶是一种习惯上的名称，学名为α-1，4_葡 萄糖水解酶；
e.糖化后用压滤机压滤糖化液，得葡萄糖液；压滤温度为60°C-70°C，压滤机压力为 0.15MPa-0. 3MPa ；
上述葡萄糖液制备过程中，步骤b所得乳浆的细度为30-35目，浓度为 18° Β _20° Β ;步骤c喷射液化器压力0.25-0. 45MPa;步骤e所用压滤机为板框压滤机。上述制备L-色氨酸发酵液至少包括以下步骤
6a.按0. 1-0. 2%(ν/ν)的接种量将摇瓶液体菌种接种到二级菌种培养基上，在 300C -33°C、pH6-8、压力 0. 03 — 0. IMPa 的条件下通风培养 14h — 16h，得 OD600 为 0. 7-1. 0 的二级菌种，通风比为1 :0. 2 — 0. 4v/v · min ；二级菌种培养基成分葡萄糖5%，磷酸氢二 钾 0. 2%，硫酸镁 0. 1，豆浓 1.5%jjC93.2%，pH 7. 0-7. 2，121 °C _125°C、15min 蒸汽灭菌；
b.按10-15%(v/v)的接种量将二级菌种接种到发酵培养基上进行通风发酵培养， 同时以连续流加方式添加葡萄糖液，使葡萄糖液的浓度始终保持在4-5wt%，发酵停止后得 L-色氨酸发酵液；发酵培养条件温度30°C -33°C、pH 6 一 8、压力0. 03 MPa 一 0. IMPa、通 风比1 :0. 2 — 0. 8 ν/ν ·π η、发酵时间38h — 40h ；发酵培养基成分葡萄糖15%，磷酸氢二 钾 0. 2%，硫酸镁 0. 1%，玉米浆 1. 0%，水 83. 7%, pH 7. 0-7. 2，121 °C _125°C、15min 蒸汽灭菌。上述L-色氨酸发酵液制备过程中，步骤a与步骤b中通入的空气为经0.25 —
0.3Mpa压缩、过滤后的无菌空气，无菌空气压缩、过滤所用的设备为通用的空气压缩机和空 气净化系统；步骤b中，葡萄糖液的浓度为500-700g/L，葡萄糖液经118°C、IOmin蒸汽灭菌 后加入。上述L-色氨酸发酵液提取、精制至少包括以下步骤
a.将L-色氨酸发酵液加热至60°C-70°C，用酸调pH值为2_4，经微滤膜除菌、超滤膜 除杂脱色，得滤清液；
b.将上述滤清液流入离子交换柱进行吸附，然后用洗脱剂进行洗脱，得L-色氨酸高 浓液；
c.L-色氨酸高浓液经反渗透膜脱水浓缩、减压蒸发浓缩后，得到L-色氨酸料液；
d.L-色氨酸料液在0°C -4°C、pH 5. 8-6. 0下结晶10h_12h，然后经离心分离得初级 L-色氨酸晶体；
e.将初级L-色氨酸晶体重新溶解，配成30g/L-50g/L的L-色氨酸溶液，然后将L-色 氨酸溶液用超滤膜脱色除杂、搅拌降温结晶、离心分离、干燥得L-色氨酸产品。上述L-色氨酸发酵液提取、精制过程中，步骤a中，所用酸为工业硫酸或工业盐 酸；微滤膜孔径为氧化锆膜、氧化铝膜或陶瓷膜，孔径0. 15-0. 35um，优选孔径为0. 22um的 陶瓷膜，微滤条件温度600C -700C，压力0. 2MPa-0. 35Mpa,发酵液流速60 L/m2 · h_150L/ m2 · h ；超滤膜为卷式膜或中空纤维膜，截留分子量为8-10万D，优选截留分子量为10万D 的卷式膜，超滤条件温度40°C -60°C，压力0. 2MPa-0. 35Mpa,发酵液流速50 L/m2 -h-lOOL/ m2 · h。微滤条件优选温度60°C，压力0. 25Mpa,发酵液流速100 L/m2 · h_120L/m2 · h ；超 滤条件优选温度50°C，压力0. 25Mpa，发酵液流速60_80L/m2 · h。上述L-色氨酸发酵液提取、精制过程中，步骤b中，离子交换柱中填充物为强酸 性阳离子交换树脂，优选磺酸型的强酸性离子交换树脂或001 X 7强酸性阳离子交换树脂， 吸附温度为25-35°C，滤清液流速为1. 0-2. 5v/v · min ；洗脱所用洗脱剂为2-3mol/L的氨 水或0. 5-1. 5mol/L氢氧化钠溶液，洗脱流速为0. 5-1. 5 v/v-min.优选条件吸附温度为 30°C，滤清液流速为1. 5-2. Ov/v · min ；洗脱所用洗脱剂为2-3mol/L的氨水，洗脱流速为
1.0-1. 2v/v · min。上述L-色氨酸发酵液提取、精制过程中，步骤c中，反渗透膜醋酸纤维素膜或聚酰 胺复合膜(孔径大于5埃)，截留分子量小于等于100，脱水浓缩条件压力0. 5-0. 6MPa，温度 50-600C ；减压蒸发浓缩条件温度70-90°C，真空度-0. 06 -0. IMPa0脱水浓缩条件优选压力0. 55MPa，温度55°C ；减压蒸发浓缩条件优选温度80°C，真空度-0. 08MPa。上述L-色氨酸发酵液提取、精制过程中，步骤e中，超滤膜为卷式膜或中空纤 维膜，截留分子量为4000-6000D，优选截留分子量为5000D的卷式膜，脱色除杂条件温 度 40°C -60°C，压力 0. 2MPa-0. 35Mpa,流速 50 L/m2. h_80L/m2. h ；溶液脱色除杂后，降温 至0°C _4°C结晶10h-12h，然后离心分离得精级L-色氨酸晶体，精级L-色氨酸晶体在 700C -80°C、真空度-0. 06 Mpa -0. 1 Mpa的条件下干燥2_4h，得L-色氨酸产品。优选 的，超滤膜脱色除杂条件温度60°C，压力0. 3Mpa，流速60_70L/m2. h ；溶液脱色除杂后，降 温至0°C结晶10h-12h，然后离心分离得精级L-色氨酸晶体，精级L-色氨酸晶体在75°C、真 空度-0. 08 Mpa的条件下干燥2-4h，得L-色氨酸产品。本发明的优点是①以普通的谷氨酸棒杆菌为发酵菌种，通过控制培养基组成及 发酵条件，使菌种产酸水平大幅度提高，最高可达40g/L ；②利用玉米生产葡萄糖液工艺合 理，产品质量稳定，生产成本低；③连续流加葡萄糖液，使培养基中葡萄糖的含量波动小，能 够控制在最佳的含量，利于微生物的生长和发酵产物的生成，使发酵产酸水平盒糖酸转化 率提高；④提取精制工艺流程合理，L-色氨酸产品纯度可达99%以上，收率达75%以上。
具体实施例方式下面通过具体实施例对本发明进行进一步阐述，应该明白的是，下述说明仅是为 了解释本发明，并不对其内容进行限定。如无特别说明，所述接种量均为体积比接种量。本发明实施例所用的培养基组成如下
初级培养基组分按重量比计为葡萄糖1%，磷酸氢二钾0. 2%，硫酸镁0. 1%，酵母浸粉 2%,琼脂 2%,/K 94. 7%, ρΗ7· 0-7. 2。摇瓶培养基组成按重量比计葡萄糖2%，磷酸氢二钾0.2%，硫酸镁0. 1%，酵母浸粉 1%，豆浓 2%,/K 94. 7%, ρΗ 7. 0-7. 2。二级菌种培养基成分按重量比计葡萄糖5%，磷酸氢二钾0. 2%，硫酸镁0. 1，豆浓 1. 5%, /K 93. 2%, ρΗ 7. 0-7. 2，121 °C _125°C、15min 蒸汽灭菌。发酵培养基成分按重量比计葡萄糖15%，磷酸氢二钾0. 2%，硫酸镁0. 1%，玉米浆 1. 0%, /Jc 83. 7%, ρΗ 7. 0-7. 2，121 °C _125°C、15min 蒸汽灭菌。实施例1
1、摇瓶液体菌种培养
①将初级菌种培养基装入茄瓶，然后按0.1%的接种量接入谷氨酸棒杆菌菌种，在32°c 条件下静置培养24h后获初级菌种；
②将摇瓶培养基放入摇瓶，接入上步得到的初级菌种培养基液，在往复式摇床上培养， 接种量为0. 1%，转速120转/分，温度32°C，时间周期18h，获摇瓶液体菌种，所得菌种镜检 菌体均勻，粗壮，无污染，用752分光光度计测量(量程10mm，波长600nm)得OD为0. 68。2、葡萄糖液生产
①将玉米在浸泡罐内浸泡时间4h，维持温度50°C；
②用砂磨机将玉米磨成玉米乳浆，其细度为30目，浓度达18° Β ;
③将玉米乳浆用液化喷射器在105°C条件下高温液化，然后进入维持罐保温维持 120min得液化液，喷射液化器压力为0. 25MPa ；④将液化液泵入糖化罐，加入液体糖化酶进行糖化得糖化液，液体糖化酶加入量为 80-100单位/g纯淀粉，糖化温度保持为60°C，pH为3. 8，糖化周期36h ；
⑤糖化后用板框压滤机压滤糖化液，压滤温度70°C，压力0.25MPa,得浓度为 250-350g/L的葡萄糖液，葡萄糖液经脱水浓缩用做下一步发酵液生产中的流加糖。3、L-色氨酸发酵液制取
①将二级菌种培养基经蒸汽灭菌后泵入二级种子罐，降温至33°C后接入摇瓶液体菌 种，接种量为0. 1%，同时将经过0. 25Mpa压缩、过滤后的无菌空气输入二级种子罐；此时通 风比1 0. 3v/V. min, ρΗ6· 8，压力0. 05MPa，培养16h，获得二级菌种，二级菌种镜检菌体均 勻，粗壮，无污染，用752分光光度计测量(量程10mm，波长600nm)得OD为0. 8 ；
②将发酵培养基经蒸汽灭菌后泵入发酵罐，降温至33°C后接入二级菌种进行通风发 酵，通入空气为上述①中的无菌空气，同时将经118°C、10min蒸汽灭菌后的600g/L的葡萄 糖液以连续流加的方式加入发酵罐中，使发酵罐中葡萄糖液浓度始终保持在4-5%之间，流 加结束后，葡萄糖浓度稳步下降到0-0. 5g/L,发酵终止，发酵停止后得L-色氨酸发酵液， 接种量为10%，通风比为1 0. 5v/V. min,pH 6.8 (通入液氨控制PH值)，压力0. 05MPa，发酵 38h，产酸达到38. 6g/L、转化率18. 2%04、L-色氨酸提取精制
①将L-色氨酸发酵液送入提取储料罐，加热至70°C，用工业硫酸调PH值为4，经微 滤膜除菌、超滤膜除杂脱色得滤清液，所用微滤膜为孔径0. 22um的陶瓷膜，微滤控制温度 70°C，压力0. 25Mpa，流速90 L/m2. h ；所用超滤膜为截留分子量为10万D的卷式膜，超滤滤 控制温度50°C，压力0. 30Mpa,流速80L/m2. h ；
②滤清液进入离子交换柱，柱中填充001X7强酸性阳离子交换树脂，在30°C流速为 1. 8v/V ·π η进行吸附，吸附后用2. 5mol/L的氨水进行洗脱，洗脱流速控制在1. Ov/V -min, 得到L-色氨酸高浓液。③L-色氨酸高浓液经反渗透膜脱水浓缩(反渗透膜为截留分子量< 100D的醋酸 纤维素膜，压力0. 5MPa，温度50°C)、减压蒸发浓缩后(温度80°C，真空度-0. 08MPa)，得到 L-色氨酸料液。④L-色氨酸料液送入结晶罐搅拌降温至0°C、调PH为6. 0、时间IOh后获晶体，将 结晶料液离心分离，得初级L-色氨酸晶体；
⑤将初级L-色氨酸晶体重新溶解，并配置含量达到40g/L的L-色氨酸溶液使其充分 溶解；将充分溶解后的初级L-色氨酸晶体经超滤膜进行脱色、除杂后送入精品L-色氨酸结 晶罐搅伴降温至0°C，结晶时间12h，获得精级L-色氨酸晶体；超滤膜为超滤膜截留分子量 为5000D的卷式膜，温度60°C，压力0. 30Mpa，流速80L/m2. h ；
⑥将精级L-色氨酸晶体用离心机分离，然后在温度80°C、真空度-0.OSMpa的条件下进 行真空干燥机烘干3小时，最后粉碎、包装，检测产品纯度为99. 2%获合格L-色氨酸产品， 收率77. 2%ο实施例2
1、摇瓶液体菌种培养
①将初级菌种培养基装入茄瓶，然后按0. 2%的接种量接入谷氨酸棒杆菌菌种，在 30-33°C条件下静置培养20-24h后获初级菌种；
9②将摇瓶培养基放入摇瓶，接入上步得到的初级菌种培养基液，在往复式摇床上培养， 接种量为0. 15%，转速140转/分，温度30-33°C，时间周期16h，获摇瓶液体菌种，所得菌 种镜检菌体均勻，粗壮，无污染，用752分光光度计测量(量程10mm，波长600nm)得OD为 0. 6。2、葡萄糖液生产
①将玉米在浸泡罐内浸泡时间3-5h，浸泡温度55°C；
②用砂磨机将玉米磨成玉米乳浆，其细度为32-35目，浓度达20°Β ;
③将玉米乳浆用液化喷射器在108°C条件下高温液化，然后进入维持罐保温维持 90min得液化液，喷射液化器压力为0. 45MPa ；
④将液化液泵入糖化罐，加入液体糖化酶进行糖化得糖化液，液体糖化酶加入量为 100-120单位/g纯淀粉，糖化温度为55°C，pH为4. 5，糖化周期33h ；
⑤糖化后用板框压滤机压滤糖化液，压滤温度60°C，压力0.3MPa，得浓度为300_350g/ L的葡萄糖液，葡萄糖液经脱水浓缩用做下一步发酵液生产中的流加糖。3、L-色氨酸发酵液制取
①将二级菌种培养基经蒸汽灭菌后泵入二级种子罐，降温至30-33°C后接入摇瓶液体 菌种，接种量为0. 2%，同时将经过0. 3Mpa压缩、过滤后的无菌空气输入二级种子罐；此时通 风比1 :0. 4v/V. min, pH8，压力0. 03MPa，培养14h，获得二级菌种，二级菌种镜检菌体均勻， 粗壮，无污染，用752分光光度计测量(量程10mm，波长600nm)得OD为0. 7 ；
②将发酵培养基经蒸汽灭菌后泵入发酵罐，降温至30-33°C后接入二级菌种进行通风 发酵，通入空气为上述①中的无菌空气，同时将经118°C、IOmin蒸汽灭菌后的500g/L的葡 萄糖液以连续流加的方式加入发酵罐中，使发酵罐中葡萄糖液浓度始终保持在4-5%之间， 流加结束后，葡萄糖浓度稳步下降到0-0. 5g/L,发酵终止，发酵停止后得L-色氨酸发酵液， 接种量为15%，通风比为1 0. 8v/V. min,pH 6(通入液氨控制PH值)，压力0. IMPa，发酵40h， 产酸达到39. 2g/L、转化率18. 9%。4、L-色氨酸提取精制
①将L-色氨酸发酵液送入提取储料罐，加热至60°C，用工业盐酸调PH值为2，经微滤 膜除菌、超滤膜除杂脱色得滤清液，所用微滤膜为孔径0. 15-0. 2um的氧化锆膜，微滤控制 温度60°C，压力0. 35Mpa，流速150 L/m2. h ；所用超滤膜为截留分子量为8万D的中空纤维 膜，超滤滤控制温度60°C，压力0. 20Mpa,流速50L/m2. h ；
②滤清液进入离子交换柱，柱中填充磺酸型的强酸性离子交换树脂，在25°C流速为 1. Ov/V ·π η进行吸附，吸附后用2. Omol/L的氨水进行洗脱，洗脱流速控制在1. 5v/V -min, 得到L-色氨酸高浓液。③L-色氨酸高浓液经反渗透膜脱水浓缩(反渗透膜为截留分子量< 100D的聚 酰胺复合膜，孔径大于5埃，压力0. 6MPa，温度60°C)、减压蒸发浓缩后(温度90°C，真空 度-0. 06MPa)，得到L-色氨酸料液。④L-色氨酸料液送入结晶罐搅拌降温至4°C、调PH为5. 8、时间12h后获晶体，将 结晶料液离心分离，得初级L-色氨酸晶体；
⑤将初级L-色氨酸晶体重新溶解，并配置含量达到30g/L的L-色氨酸溶液使其充分 溶解；将充分溶解后的初级L-色氨酸晶体经超滤膜进行脱色、除杂后送入精品L-色氨酸结晶罐搅伴降温至4°C，结晶时间10h，获得精级L-色氨酸晶体；超滤膜为超滤膜截留分子量 为4000D的卷式膜，温度40°C，压力0. 2Mpa，流速50L/m2· h ；
⑥将精级L-色氨酸晶体用离心机分离，然后在温度70°C、真空度-0. 06Mpa的条件下进 行真空干燥机烘干4小时，最后粉碎、包装，检测产品纯度为99. 3%获合格L-色氨酸产品， 收率77. 8%ο实施例3
1、摇瓶液体菌种培养
①将初级菌种培养基装入茄瓶，然后按0.15%的接种量接入谷氨酸棒杆菌菌种，在 30-33°C条件下静置培养20-24h后获初级菌种；
②将摇瓶培养基放入摇瓶，接入上步得到的初级菌种培养基液，在往复式摇床上培养， 接种量为0. 2%，转速130转/分，温度30-33°C，时间周期16h，获摇瓶液体菌种，所得菌种镜 检菌体均勻，粗壮，无污染，用752分光光度计测量(量程10mm，波长600nm)得OD为0. 8。2、葡萄糖液生产
①将玉米在浸泡罐内浸泡时间3-5h，浸泡温度53°C；
②用砂磨机将玉米磨成玉米乳浆，其细度为30-32目，浓度达19°Β ；
③将玉米乳浆用液化喷射器在105°C条件下高温液化，然后进入维持罐保温维持 IlOmin得液化液，喷射液化器压力为0. 3MPa ；
④将液化液泵入糖化罐，加入液体糖化酶进行糖化得糖化液，液体糖化酶加入量为120 单位/g纯淀粉，糖化温度为65°C，pH为4. 0，糖化周期36h ；
⑤糖化后用板框压滤机压滤糖化液，压滤温度65°C，压力0.15MPa,得浓度为330g/L的 葡萄糖液，葡萄糖液经脱水浓缩用做下一步发酵液生产中的流加糖。3、L-色氨酸发酵液制取
①将二级菌种培养基经蒸汽灭菌后泵入二级种子罐，降温至30-33°C后接入摇瓶液体 菌种，接种量为0. 15%，同时将经过0. 3Mpa压缩、过滤后的无菌空气输入二级种子罐；此时 通风比1 :0. 2v/V.min，pH6，压力0. IMPa，培养16h，获得二级菌种，二级菌种镜检菌体均勻， 粗壮，无污染，用752分光光度计测量(量程10mm，波长600nm)得OD为1. 0 ；
②将发酵培养基经蒸汽灭菌后泵入发酵罐，降温至30-33°C后接入二级菌种进行通风 发酵，通入空气为上述①中的无菌空气，同时将经118°C、10min蒸汽灭菌后的700g/L的葡 萄糖液以连续流加的方式加入发酵罐中，使发酵罐中葡萄糖液浓度始终保持在4-5%之间， 流加结束后，葡萄糖浓度稳步下降到0-0. 5g/L,发酵终止，发酵停止后得L-色氨酸发酵液， 接种量为12%，通风比为1 :0. 2v/V.min，pH 8 (通入液氨控制PH值)，压力0. 03MPa，发酵 40h，产酸达到39. 5g/L、转化率19. 0%。4、L-色氨酸提取精制
①将L-色氨酸发酵液送入提取储料罐，加热至65°C，用工业盐酸调PH值为3，经微滤 膜除菌、超滤膜除杂脱色得滤清液，所用微滤膜为孔径0. 3-0. 35um的氧化铝膜，微滤控制 温度60°C，压力0. 2Mpa，流速60 L/m2. h ；所用超滤膜为截留分子量为10万D的中空纤维 膜，超滤滤控制温度40°C，压力0. 35Mpa，流速100L/m2. h ；
②滤清液进入离子交换柱，柱中填充磺酸型的强酸性离子交换树脂，在35°C流速为 2. 5v/V · min进行吸附，吸附后用0. 5mol/L的氢氧化钠溶液进行洗脱，洗脱流速控制在得到L-色氨酸高浓液。③L-色氨酸高浓液经反渗透膜脱水浓缩(反渗透膜为截留分子量< 100D的醋 酸纤维素膜或聚酰胺复合膜，压力0. 55MPa，温度55°C)、减压蒸发浓缩后(温度70°C，真空 度-0. IMPa)，得到L-色氨酸料液。④L-色氨酸料液送入结晶罐搅拌降温至2°C、调PH为5. 8、时间12h后获晶体，将 结晶料液离心分离，得初级L-色氨酸晶体；
⑤将初级L-色氨酸晶体重新溶解，并配置含量达到50g/L的L-色氨酸溶液使其充分 溶解；将充分溶解后的初级L-色氨酸晶体经超滤膜进行脱色、除杂后送入精品L-色氨酸结 晶罐搅伴降温至0°C，结晶时间12h，获得精级L-色氨酸晶体；超滤膜为超滤膜截留分子量 为6000D的卷式膜，温度50°C，压力0. 35Mpa，流速60L/m2. h ；
⑥将精级L-色氨酸晶体用离心机分离，然后在温度75°C、真空度-0.IMpa的条件下进 行真空干燥机烘干2小时，最后粉碎、包装，检测产品纯度为99. 1%获合格L-色氨酸产品， 收率76. 9%ο实施例4
1、摇瓶液体菌种培养
①将初级菌种培养基装入茄瓶，然后按0.2%的接种量接入谷氨酸棒杆菌菌种，在32°C 条件下静置培养24h后获初级菌种；
②将摇瓶培养基放入摇瓶，接入上步得到的初级菌种培养基液，在往复式摇床上培养， 接种量为0. 15%，转速140转/分，温度32°C，时间周期18h，获摇瓶液体菌种，所得菌种镜检 菌体均勻，粗壮，无污染，用752分光光度计测量(量程10mm，波长600nm)得OD为0. 68。2、葡萄糖液生产同实施例1。3、L-色氨酸发酵液制取同实施例3。4、L-色氨酸提取精制
①将L-色氨酸发酵液送入提取储料罐，加热至70°C，用工业硫酸调PH值为4，经微 滤膜除菌、超滤膜除杂脱色得滤清液，所用微滤膜为孔径0. 22um的陶瓷膜，微滤控制温度 60°C，压力0.25Mpa，流速120 L/m2. h ；所用超滤膜为截留分子量为10万D的卷式膜，超滤 滤控制温度50°C，压力0. 25Mpa，流速60L/m2· h ；
②滤清液进入离子交换柱，柱中填充001X7强酸性阳离子交换树脂，在30°C流速为
1.5v/V ·π η进行吸附，吸附后用3. Omol/L的氨水进行洗脱，洗脱流速控制在1. 2v/V -min, 得到L-色氨酸高浓液。③L-色氨酸高浓液经反渗透膜脱水浓缩(反渗透膜为截留分子量< 100D的醋 酸纤维素膜或聚酰胺复合膜，压力0. 55MPa,温度55°C )、减压蒸发浓缩后(温度80°C，真空 度-0. 08MPa)，得到L-色氨酸料液。④L-色氨酸料液送入结晶罐搅拌降温至0°C、调PH为6. 0、时间IOh后获晶体，将 结晶料液离心分离，得初级L-色氨酸晶体；
⑤将初级L-色氨酸晶体重新溶解，并配置含量达到40g/L的L-色氨酸溶液使其充分 溶解；将充分溶解后的初级L-色氨酸晶体经超滤膜进行脱色、除杂后送入精品L-色氨酸结 晶罐搅伴降温至0°C，结晶时间12h，获得精级L-色氨酸晶体；超滤膜为超滤膜截留分子量 为5000D的卷式膜，温度60°C，压力0. 30Mpa，流速70L/m2. h ；
12⑥将精级L-色氨酸晶体用离心机分离，然后在温度75°C、真空度-0. OSMpa的条件下进 行真空干燥机烘干3小时，最后粉碎、包装，检测产品纯度为99. 7%获合格L-色氨酸产品， 收率78. 9%ο实施例5
1、摇瓶液体菌种培养同实施例2。2、葡萄糖液生产同实施例2。3、L-色氨酸发酵液制取同实施例2。4、L-色氨酸提取精制
①将L-色氨酸发酵液送入提取储料罐，加热至70°C，用工业硫酸调PH值为4，经微 滤膜除菌、超滤膜除杂脱色得滤清液，所用微滤膜为孔径0. 22um的陶瓷膜，微滤控制温度 60°C，压力0.25Mpa，流速100 L/m2. h ；所用超滤膜为截留分子量为10万D的卷式膜，超滤 滤控制温度50°C，压力0. 25Mpa，流速60L/m2· h ；
②滤清液进入离子交换柱，柱中填充001X7强酸性阳离子交换树脂，在30°C流速为 2. Ov/v · min进行吸附，吸附后用1. 5mol/L的氢氧化钠水溶液进行洗脱，洗脱流速控制在 1. 2v/V · min，得到L-色氨酸高浓液。其他，同实施例2。所得L-色氨酸产品纯度为99. 5%，收率79. 5%。实施例6
1、摇瓶液体菌种培养同实施例3。2、葡萄糖液生产同实施例3。3、L-色氨酸发酵液制取
①将二级菌种培养基经蒸汽灭菌后泵入二级种子罐，降温至33°C后接入摇瓶液体菌 种，接种量为0. 15%，同时将经过0. 3Mpa压缩、过滤后的无菌空气输入二级种子罐；此时通 风比1 0. 5v/V. min, ρΗ6· 8，压力0. 05MPa，培养16h，获得二级菌种，二级菌种镜检菌体均 勻，粗壮，无污染，用752分光光度计测量(量程10mm，波长600nm)得OD为0. 9 ；
②将发酵培养基经蒸汽灭菌后泵入发酵罐，降温至32°C后接入二级菌种进行通风发 酵，通入空气为上述①中的无菌空气，同时将经118°C、IOmin蒸汽灭菌后的700g/L的葡萄 糖液以连续流加的方式加入发酵罐中，使发酵罐中葡萄糖液浓度始终保持在4-5%之间，发 酵停止后得L-色氨酸发酵液，接种量为15%，通风比为1 :0. 6v/V. min,pH 6. 8 (通入液氨控 制PH值)，压力0. 05MPa，发酵40h，产酸达到40. Og/L、转化率19.8%。4、L_色氨酸提取精制同实施例3，所得L-色氨酸产品纯度为99. 5%，收率78. 3%。
权利要求
一种L 色氨酸的生产方法，其特征是至少包括以下步骤(1) 以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)为菌种，经初级培养后进行摇瓶培养得摇瓶液体菌种； (2) 以玉米为原料，经浸泡、磨浆、液化、糖化等步骤制得葡萄糖液，所得葡萄糖液作为培养基的碳源及发酵流加糖； (3) 将摇瓶液体菌种进行二级培养得二级菌种，然后将二级菌种进行发酵培养得L 色氨酸发酵液；(4) 将L 色氨酸发酵液进行提取、精制得L 色氨酸。
2.根据权利要求1所述的生产方法，其特征是摇瓶液体菌种培养至少包括以下步骤a.以谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)为母种，按 0. 1%-0. 2% (ν/ν)的 接种量接入初级培养基中，在30°C _33°C下静置培养20-24h得初级菌种；初级培养基组分 按重量比计为葡萄糖1%，磷酸氢二钾0. 2%，硫酸镁0. 1%，酵母浸粉2%，琼脂2%，水94. 7%， ρΗ7· 0-7. 2 ；b.将得到的初级菌种培养基液接种到摇瓶培养基中，在往复式摇床上培养，得0D_ 为0. 6-0. 8的摇瓶液体菌种；接种量为0. 1%-0. 2%( ν/ν)，摇床转速为120-140转/分，培 养温度为30°C _33°C，培养时间为16-18h，摇瓶培养基组成葡萄糖2%，磷酸氢二钾0. 2%， 硫酸镁 0. 1%，酵母浸粉 1%，豆浓 2%,/jC 94. 7%，pH 7. 0-7. 2。
3.根据权利要求1所述的生产方法，其特征是葡萄糖液的制备至少包括以下步骤a.将玉米放入浸泡罐中，在50-55 °C下浸泡3-5h ；b.浸泡后将玉米磨成乳浆；c.将玉米乳浆用液化喷射器在105°C _108°C条件下高温液化，然后在维持罐中保温 维持90 - 120min得液化液；d.将步骤c后的液化液泵入糖化罐，加入液体糖化酶进行糖化得糖化液，液体糖 化酶加入量为80-120单位/g纯淀粉，糖化温度为55-65°C，pH为3. 8-4. 5，糖化时间为 33-36h ；e.糖化后用压滤机压滤糖化液，得葡萄糖液；压滤温度为60°C-70°C，压滤机压力为 0.15MPa-0. 3MPa。
4.根据权利要求3所述的生产方法，其特征是葡萄糖液制备过程中，步骤b所得乳浆 的细度为30-35目，浓度为18° Β _20° Be ；步骤c喷射液化器压力0. 25-0. 45MPa ；步骤e 所用压滤机为板框压滤机。
5.根据权利要求1所述的生产方法，其特征是制备L-色氨酸发酵液至少包括以下步骤a.按0. 1-0. 2%(ν/ν)的接种量将摇瓶液体菌种接种到二级菌种培养基上，在 300C -33°C、pH6-8、压力 0. 03 — 0. IMPa 的条件下通风培养 14h — 16h，得 OD600 为 0. 7-1. 0 的二级菌种，通风比为1 :0. 2 — 0. 4v/v · min ；二级菌种培养基成分葡萄糖5%，磷酸氢二 钾 0. 2%，硫酸镁 0. 1，豆浓 1. 5%，水 93. 2%, pH 7. 0-7. 2，121 °C _125°C、15min 蒸汽灭菌；b.按10-15%(v/v)的接种量将二级菌种接种到发酵培养基上进行通风发酵培养， 同时以连续流加方式添加葡萄糖液，使葡萄糖液的浓度始终保持在4-5wt%，发酵停止后得 L-色氨酸发酵液；发酵培养条件温度30°C -33°C、pH 6 一 8、压力0. 03 MPa 一 0. IMPa、通风比1 :0. 2 — 0. 8 ν/ν ·π η、发酵时间38h — 40h ；发酵培养基成分葡萄糖15%，磷酸氢二 钾 0. 2%，硫酸镁 0. 1%，玉米浆 1. 0%，水 83. 7%, pH 7. 0-7. 2，121 °C _125°C、15min 蒸汽灭菌。
6.根据权利要求5所述的生产方法，其特征是L-色氨酸发酵液制备过程中，步骤a与 步骤b中通入的空气为经0. 25 - 0. 3Mpa压缩、过滤后的无菌空气；步骤b中，葡萄糖液的 浓度为500-700g/L，葡萄糖液经118°C、IOmin蒸汽灭菌后加入。
7.根据权利要求1所述的生产方法，其特征是L-色氨酸发酵液提取、精制至少包括以 下步骤a.将L-色氨酸发酵液加热至60°C-70°C，用酸调pH值为2_4，经微滤膜除菌、超滤膜 除杂脱色，得滤清液；b.将上述滤清液流入离子交换柱进行吸附，然后用洗脱剂进行洗脱，得L-色氨酸高 浓液；c.L-色氨酸高浓液经反渗透膜脱水浓缩、减压蒸发浓缩后，得到L-色氨酸料液；d.L-色氨酸料液在0°C -4°C、pH 5. 8-6. 0下结晶10h_12h，然后经离心分离得初级 L-色氨酸晶体；e.将初级L-色氨酸晶体重新溶解，配成30g/L-50g/L的L-色氨酸溶液，然后将L-色 氨酸溶液用超滤膜脱色除杂、搅拌降温结晶、离心分离、干燥得L-色氨酸产品。
8.根据权利要求7所述的生产方法，其特征是L-色氨酸发酵液提取、精制过程中， 步骤a中，所用酸为工业硫酸或工业盐酸；微滤膜孔径为0. 15-0. 35um,微滤条件温度 60 0C -70°C，压力 0. 2MPa-0. 35Mpa，发酵液流速 60 L/m2 · h-150L/m2 · h ；超滤膜截留分 子量为8-10万D，超滤条件温度40°C -60°C，压力0. 2MPa_0. 35Mpa，发酵液流速50 L/ τα · h-100L/m2 · h ；步骤b中，离子交换柱中填充物为强酸性阳离子交换树脂，吸附温度为25-35°C，滤清 液流速为1. 0-2. 5v/v · min ；洗脱所用洗脱剂为2-3mol/L的氨水或0. 5-1. 5mol/L氢氧化 钠溶液，洗脱流速为0. 5-1. 5 ν/ν · min ；步骤c中，反渗透膜截留分子量小于等于100，脱水浓缩条件压力0. 5-0. 6MPa，温度 50-600C ；减压蒸发浓缩条件温度70-90°C，真空度-0. 06 -0. IMPa ；步骤e中，超滤膜截留分子量为4000-6000D，脱色除杂条件温度40°C -60°C，压力 0. 2MPa-0. 35Mpa,流速 50_80L/m2 · h ；溶液脱色除杂后，降温至 0°C _4°C 结晶 10h_12h， 然后离心分离得精级L-色氨酸晶体，精级L-色氨酸晶体在70°C -80°C、真空度-0. 06 Mpa -0. 1 Mpa的条件下干燥2_4h，得L-色氨酸产品。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征是步骤a中，微滤膜为氧化锆膜、氧化铝 膜或陶瓷膜，微滤条件温度60°C，压力0. 25Mpa，发酵液流速100 L/m2 .h-120L/m2 -h ；超滤 膜为卷式膜或中空纤维膜，超滤条件温度50°C，压力0. 25Mpa，发酵液流速60_80L/m2 · h ；步骤b中，离子交换柱中填充物为磺酸型的强酸性离子交换树脂，吸附温度为30°C，滤 清液流速为1. 5-2. Ov/v -min ；洗脱所用洗脱剂为2-3mol/L的氨水，洗脱流速为1. 0-1. 2v/ ν · min ；步骤c中，反渗透膜为醋酸纤维素膜或聚酰胺复合膜，脱水浓缩条件压力0. 55MPa，温 度55°C ；减压蒸发浓缩条件温度80°C，真空度-0. OSMPa ；步骤e中，超滤膜卷式膜或中空纤维膜，脱色除杂条件温度60°C，压力0. 3Mpa，流速60-70L/m2.h ；溶液脱色除杂后，降温至0°C结晶10h_12h，然后离心分离得精级L-色氨酸晶 体，精级L-色氨酸晶体在75°C、真空度-0. 08 Mpa的条件下干燥2_4h，得L-色氨酸产品。
10.根据权利要求7、8或9所述的生产方法，其特征是步骤a中，微滤膜为孔径为 0. 22um的陶瓷膜，超滤膜为截留分子量为10万D的卷式膜；步骤b中，离子交换柱中填充 物为001X7强酸性阳离子交换树脂；步骤e中，超滤膜为截留分子量为5000D的卷式膜。
全文摘要
本发明公开了一种L-色氨酸的生产方法，包括以下步骤以谷氨酸棒杆菌为菌种，经初级培养后进行摇瓶培养得摇瓶液体菌种；以玉米为原料，经浸泡、磨浆、液化、糖化等步骤制得葡萄糖液，所得葡萄糖液作为培养基的碳源及发酵流加糖；将摇瓶液体菌种进行二级培养得二级菌种，然后将二级菌种进行发酵培养得L-色氨酸发酵液；将L-色氨酸发酵液进行提取、精制得L-色氨酸。本发明通过控制培养基组成及发酵条件，菌种产酸最高可达40g/L；利用玉米生产葡萄糖液，生产成本低；连续流加葡萄糖液，使培养基中葡萄糖的含量波动小，使发酵产酸水平盒糖酸转化率提高；提取精制工艺流程合理，L-色氨酸产品纯度可达99%以上，收率达75%以上。
文档编号C12P13/22GK101914584SQ201010274179
公开日2010年12月15日 申请日期2010年9月3日 优先权日2010年9月3日
发明者冯志彬, 张华 , 王东阳, 蔡传康, 闫汝东 申请人:王东阳;蔡传康;闫汝东;冯志彬;张华