专利名称：一种纳米非病毒基因输送体系及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及一种纳米非病毒基因输送体系及其应用。
背景技术：
骨髓间充质干细胞在骨组织工程中具有十分重要的地位，是骨组织工程中种子细胞的主要来源。而滑膜细胞和软骨细胞则在骨关节炎的发生和进程中扮演着十分重要的角色，它们也常常被作为基因治疗的靶细胞。然而，这些骨关节相关细胞目前存在着基因转染效率低下的问题，这成为了技术进步的瓶颈，大大限制了临床基因治疗的开展。基因治疗是指运用基因工程技术将外源基因导入患者细胞内，以纠正或补偿致病基因引起的疾病。将外源基因导入细胞内必须借助一定的技术方法。目前基因转染的方法主要可以分为三大类，一类是生物学方法，一类是物理方法，还有一类是化学方法。生物学方法主要是指运用病毒作为载体将外源基因导入细胞的技术。目前研究最多的病毒载体是逆转录病毒载体，慢病毒载体，腺病毒载体，腺病毒相关病毒载体，单纯疱疹病毒载体等。物理方法主要是指运用物理手段将外源基因导入细胞的技术。目前常用的方法有显微注射， 电击穿膜，压力渗透，超声喷雾，粒子轰击等方法。化学方法则是指利用化学试剂将外源基因导入细胞的技术。目前较常用的转染试剂是以阳离子脂质体为母体材料的一系列衍生物。另外利用聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)和壳聚糖(Chitosan)为母体材料的一系列衍生物也有很多的报导。化学转染试剂种类繁多，考虑到转染效率、毒性等问题，不同的细胞所使用的化学转染试剂是不同的。因此，对于特定的细胞，需要找到最为合适的化学转染试剂。上述三类方法，彼此各有优缺点，实验者往往会根据不同的需求而使用不同的方法将外源基因导入细胞。在使用不同的导入方法时，主要需要考虑到以下这些因素安全性，有效性，可操作性以及成本因素。比如在生产转基因动物的时候，往往会通过显微注射的方法将外源基因导入受精卵细胞，或者精子和卵母细胞。但是这种方法需要实验操作人员有很强的操作经验和熟练的操作技术，另外显微注射方法对仪器的要求也比较高，这对于一般的细胞转染是不适合的。基因载体是携带外源基因导入细胞内的载体系统，一般可以分为病毒载体和非病毒载体两大类。这两类载体有各自的优缺点。病毒载体往往具有一定的免疫原性，细胞毒性，随机整合到宿主细胞基因组所引起的致癌作用，制备较为复杂等缺点，同时其具有较为广谱的宿主细胞，对于原代细胞有着较高的转染效率，这是非病毒载体所难以企及的。而非病毒载体有着较好的生物相容性和较低的细胞毒性，免疫原性也几乎没有。但它在不同靶细胞上的转染效率有着巨大的差异。这种差异主要体现为在原代细胞上相对较低的转染效率，这在一定程度上制约了其在临床上的运用。理想的基因载体应该是低毒、高效、低成本又可操作。非病毒基因载体的低细胞毒性、低免疫原性和较好的生物相容性一直被认为有望取代病毒载体。但是较之病毒基因载体，较低的转染效率一直是困扰其应用的巨大障碍。需要通过化学修饰等方法来提高非病毒基因载体的转染效率。非病毒基因载体根据母体材料的不同可分为两个大类，一类是阳离子脂质体及其衍生物，另一类是阳离子聚合物及其衍生物。阳离子脂质体主要有Lipo2000，Fugenee等， 它们在体外对于一些细胞系往往具有稳定而且较高的转染效率，这也是它们其中一些能够成为商品化转染试剂的一大原因。但是，阳离子脂质体对于一些原代细胞较低的转染效率确实制约了其在某些领域的运用。另外，在体内运用阳离子脂质体进行基因治疗时，阳离子脂质体往往会被血液中的血清白蛋白凝聚并且沉淀下来，从而大大降低了其转染效率。影响非病毒基因载体转染效率的因素有很多，可以从材料学角度和生物学角度分别进行讨论和分析。理想的非病毒基因载体首先要能够在生理pH和生理离子浓度条件下有较好的溶解性。其次它与质粒应有较好的复合能力，形成的复合物应具有较为合适的粒径和表面电位。有文献报导认为，粒径小于200μπι的粒子一般通过网格蛋白介导的内吞作用进入细胞，而粒径介于200 μ m-500 μ m的粒子一般通过细胞质囊微膜介导的内吞作用进入细胞。 这两种不同的内吞方式会直接导致复合物进入细胞后的不同命运。前者，通过网格蛋白介导的内吞作用，复合物必须经过溶酶体才能进入细胞质，而后者则可以不通过溶酶体而直接进入细胞质。对于复合物的表面电位，目前认为带有少量的表面电荷(IOmV左右)是比较理想的。因为过高的表面电荷很容易在体内的血液循环过程中与血清白蛋白发生凝聚， 而过低的表面电荷则不利于细胞表面的带有负电荷的膜蛋白吸附这些复合物。复合物的粒径和表面电位在很大程度上又与非病毒载体材料与外源基因的比例，即氮磷比(N/P)有关。有些情况下，复合物的形状也会影响到转染效率。在很多研究中发现，相同的非病毒基因载体在不同种类的细胞中往往会有显著不同的转染效率。这些不同，首先体现在非病毒基因载体对于各种细胞的细胞毒性是不同的， 其次每一种细胞自身的生理特性也各有差异。综上，对于不同的细胞，选择的非病毒载体往往是不同的，本领域需要针对骨关节相关细胞进行研究，以开发出合适它们的转染试剂。
发明内容
本发明的目的在于提供一种纳米非病毒基因输送体系及其应用。在本发明的第一方面，提供一种将外源基因转染入骨关节相关细胞中的方法，包括(1)将表达所述外源基因的表达体系与基因输送体系混合，获得转染液；(2)将转染液加入到骨关节相关细胞中，从而外源基因被转染入细胞中；所述的基因输送体系是低分子量(分子量小于2000Da;较佳地分子量在 400-1500Da之间；更佳地在500_1000Da之间；更佳地在500-800之间；最佳地分子量为 600Da)的聚乙烯亚胺与环糊精的复合物。在一个优选例中，所述的表达所述外源基因的表达体系与基因输送体系形成复合物，培养于无血清培养基，得到转染液。在另一优选例中，所述的基因输送体系具有式I结构的复合物，
权利要求
1.一种将外源基因转染入骨关节相关细胞中的方法，包括(1)将表达所述外源基因的表达体系与基因输送体系混合，获得转染液；(2)将转染液加入到骨关节相关细胞中，从而外源基因被转染入细胞中； 所述的基因输送体系是低分子量的聚乙烯亚胺与环糊精的复合物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的基因输送体系具有式I结构的复合物，
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的骨关节相关细胞选自滑膜细胞，软 骨细胞，骨髓间充质干细胞。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的骨关节相关细胞是骨髓间充质干细胞。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述外源基因的表达体系与基因输送体系 混合的方法为将含有基因输送体系的水溶液与含有表达所述外源基因的表达体系的水溶 液混合，使得基因输送体系中的有效氮与外源基因中的有效磷的比例为20-35。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，相对于骨髓间充质干细胞或滑膜细胞，基因 输送体系中的有效氮与外源基因中的有效磷的比例为25-35。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，相对于软骨细胞，基因输送体系中的有效氮 与外源基因中的有效磷的比例为20-30。
8.式I结构的复合物的用途，用于制备将外源基因转染入骨关节相关细胞中的试剂。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的骨关节相关细胞选自滑膜细胞，软骨细胞，骨髓间充质干细胞。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的骨关节相关细胞为骨髓间充质干细胞。
全文摘要
本发明涉及一种纳米非病毒基因输送体系及其应用。本发明首次针对骨关节相关细胞的特点，找到了合适的基因转染试剂。所述的转染试剂是低分子量聚乙烯亚胺与环糊精的复合物，将其用于将外源基因转染入骨关节相关细胞中，具有很高的转染效率，且毒性低。
文档编号C12N5/10GK102417914SQ201010292778
公开日2012年4月18日 申请日期2010年9月27日 优先权日2010年9月27日
发明者张晓玲, 戴尅戎, 汤谷平, 童海骏 申请人:中国科学院上海生命科学研究院