专利名称：一种微生物油脂的提取方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物油脂的提取方法。
背景技术：
多不饱和脂肪酸(PUFA)对人体的生长发育及身体健康起着至关重要的作用。人 体维持各种组织的正常功能，必须保证有充足的各种脂肪酸，如果缺乏，则会引发一系列症 状，包括生长发育迟缓、皮肤异常鳞屑、智力障碍等。例如二十二碳六烯酸(DHA)作为一种 重要的PUFA，在增强记忆、思维能力，提高智力等方面具有非常显著的作用。当膳食中长期 缺乏DHA时，会对人的智力，记忆能力及思维能力产生不良影响。人群流行病学研究发现， 体内DHA含量高的人心理承受力较强，智力发育指数也高。目前使用微生物发酵生产多不饱和脂肪酸油脂的技术已经非常成熟，但是在微生 物油脂的提取工艺上还存在一些问题，需要进行改进。CN101133144A的专利申请公开了使用植物种子和生物体混合干燥后通过压榨得 到含有不饱和脂肪酸的油脂，该工艺的主要问题在于植物种子本身的脂肪酸降低了目标 脂肪酸的含量，同时由于微藻等生物体细胞外壁比较坚硬的，实际提油效果不容乐观。CN1217029A的专利申请公开了使用从用巴氏法灭菌的生物量中制备含有多不饱 和脂肪酸油脂的方法，然后在后期提油的过程中通过造粒、烘干，使用有机溶剂提油，而该 过程耗时多，且使用高温灭菌及干燥的工艺，不利于多不饱和脂肪酸的保存。CN101195813A的专利申请公开了一种使用高压均质破碎细胞壁提取油脂的工艺， 该工艺需要使用到120MPa的高压多次对微生物细胞进行破碎，生产所需要的能耗巨大，不 利于实现大规模生产。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种微生物油脂的提取方法，该提取方法能有 效萃取出微生物细胞内的油脂，即提油率高，且提油效率高，工艺简单，有利于实现规模化生产。为解决上述技术问题，所采用的技术方案为一种微生物油脂的提取方法，包括以 下步骤
(1)将产油微生物菌种接种到液体培养基中发酵，控制发酵过程中液体培养基的PH值 为6 8，通过72 200h的发酵，得到发酵液；
(2)调节步骤(1)得到的发酵液温度为4(T60°C，并将发酵液的pH值调节为3.5 4. 5， 进行搅拌，使微生物在12h内自溶；
(3)在步骤(2)得到的发酵液中加入萃取溶剂进行萃取，收集上层混合油；
(4)在步骤(3)萃取分离得到的下层溶液中加入萃取溶剂，进行二次萃取，收集上层混 合油；
(5)将步骤(3)和步骤(4)得到的上层混合油混合，蒸馏回收其中的萃取溶剂，即得微生物油脂产品。按上述方案，在进行步骤(3)之前，在发酵液中加入破乳剂，破乳剂的重量和发酵 液的体积的比例为0. 01 0. 05:1 kg/L。按上述方案，所述的破乳剂为无机盐或与水互溶的有机溶剂，所述的无机盐优选 为氯化钠或氯化钙，所述的有机溶剂优选为乙醇或丙酮。按上述方案，所述产油微生物中干物质的含油量大于或等于30%，即经发酵培养后 菌体油脂含量大于或等于细胞干重的30%，具体优选为隐球酵母、高山被孢霉中的一种或海 洋微藻中的任一种。按上述方案，步骤(1)所述的发酵步骤具体为将产油微生物菌种接种到斜面后， 进行液体摇瓶培养，然后转接到发酵罐中，将培养基的PH值控制在6 8，调节发酵温度为 2(T30°C，每分钟的空气流量为发酵液体积的0. 5^1. 5倍，培养72 200h，得到发酵液。按上述方案，步骤(2)所述的pH调节剂为盐酸、硫酸、磷酸、柠檬酸中的一种。按上述方案，步骤(3)的具体步骤为在步骤(2)得到的发酵液中加入萃取溶剂， 所述萃取溶剂的体积为发酵液体积的50 200%，调节萃取温度为40 60°C，搅拌30 60min,静置分层，收集上层混合油。按上述方案，步骤(4)的具体步骤为在步骤(3)萃取分离得到的下层溶液中加 入萃取溶剂，所述萃取溶剂的体积为下层溶液体积的100 200%，调节萃取温度在40 60°C，搅拌30 60min，静置分层，收集上层混合油。按上述方案，步骤(3)或步骤(4)所述的萃取溶剂包括所有能萃取油脂的有机溶 剂，优选为6号抽提溶剂、己烷、庚烷或石油醚。按上述方案，在进行步骤(5)之前，将步骤(4)重复进行至少一次。本发明提供的微生物油脂的提取方法，具有以下主要优点
1.通过调节微生物发酵后得到的发酵液的PH值，使微生物细胞自溶，可有利于有效 萃取出微生物细胞内的油脂，提高萃取率即提油率；
2.在进行萃取之前加入的破乳剂可使自溶后的微生物细胞内的油脂容易被溶剂萃 取，从而进一步提高微生物油脂的提油效率；
3.工艺操作简单，利于实现规模化生产。
具体实施例方式下述实施例1-5中实验室提油的具体步骤为将产油微生物发酵后得到的发酵液 中的微生物细胞滤出，干燥称重，使用索式抽提设备将微生物干细胞中的油脂萃取完全，再 将抽提得到的油脂恒重称量，即可得到理论含油量。实施例1
(1)采用双鞭甲藻菌种接种到斜面后，进行液体摇瓶培养，然后转接到70L自动发酵 罐中，其中所述培养基的组成为胰蛋白胨lg/L，酵母膏2g/L，葡萄糖30g/L，KH2PO4 3g/L， NaCl 30g/L，MgSO4. 7H20 lOg/L, KCl lg/L, CaCl2 0. 3g/L, NaHCO3 lg/L, FeSO4 0.01g/L，谷 氨酸40g/L，其余为水，调节培养基的pH值为6 8，维持发酵罐的温度在25 28°C，每分钟的 空气流量为发酵液体积的0. 8倍，培养126h，发酵结束，得到发酵液；
(2)调节发酵液的温度至40°C，并用磷酸调节发酵液pH值到3.5，持续搅拌6小时，使发酵液中的微生物细胞自溶，获得50L发酵液；
(3)取步骤(2)得到的50L发酵液，加入25L庚烷做萃取溶剂，在40°C的温度条件下， 搅拌30min，搅拌速度为300r/min，静置分层60min，收集上层混合油；
(4)在步骤(3)萃取分离得到的下层溶液中加入25L庚烷进行二次萃取，萃取步骤如 上，收集上层混合油，如此重复萃取1次，共萃取2次；
(5)将前述步骤收集的上层混合油混合后，进入脱油罐脱溶，得油脂1034g。生产提油率的计算
取IL步骤(1)得到的发酵液进行实验室提油，得到微生物油脂23g，将IL生产提油提 取的油脂量与IL实验室提油提取的油脂量相比，由此计算可得本实施例的生产提油率为 90. 0%。实施例2
(1)采用双鞭甲藻菌种接种到斜面后，进行液体摇瓶培养，然后转接到70L自动发酵 罐中，其中所述培养基的组成为胰蛋白胨lg/L，酵母膏2g/L，葡萄糖30g/L，KH2PO4 3g/L， NaCl 30g/L，MgSO4. 7H20 lOg/L, KCl lg/L, CaCl2 0. 3g/L, NaHCO3 lg/L, FeSO4 0.01g/L，谷 氨酸40g/L，其余为水，调节培养基的pH值为6 8，维持发酵罐的温度在25 28°C，每分钟的 空气流量为发酵液体积的0. 8倍，培养126h，发酵结束，得到发酵液；
(2)调节发酵液的温度至50°C，并用硫酸调节发酵液pH值到3.5，持续搅拌6小时，使 发酵液中的微生物细胞自溶，获得50L发酵液；
(3)取步骤(2)得到的50L发酵液，加入IL乙醇，搅拌均勻；
(4)在步骤(3)的溶液中继续加入50L石油醚，在50°C的温度条件下，搅拌30min，静置 分层30min，收集上层混合油；
(5)在步骤(4)萃取分离得到的下层溶液中再加入50L石油醚进行二次萃取，萃取步骤 如上，收集上层混合油，如此重复萃取1次，共萃取2次；
(6)将前述步骤收集的上层混合油混合后，进入脱油罐脱溶，得油脂llOOg。生产提油率的计算
取IL步骤(1)得到的发酵液进行实验室提油，提取油脂23g，将IL生产提油提取的油 脂量与IL实验室提油提取的油脂量进行相比，由此计算此生产提油率为95. 6%。实施例3
(1)采用双鞭甲藻安瓿罐接种到斜面后，进行液体摇瓶培养，然后转接到一级种子罐培 养后，再转接入50m3发酵罐培养，其中所述培养基的组成为胰蛋白胨lg/L，酵母膏2g/ L，葡萄糖 30g/L, KH2PO4 3g/L, NaCl 30g/L, MgSO4. 7H20 lOg/L, KCl lg/L, CaCl2 0. 3g/L， NaHCO3 lg/L, FeSO4 0. 01g/L，谷氨酸40g/L，其余为水，调节培养基的pH值为6 8，维持发酵 罐的温度在25 28°C，每分钟的空气流量为发酵液体积的1. 5倍，培养120h，发酵结束，得到 发酵液；
(2)调节发酵液的温度至55°C，并用盐酸调节发酵液的pH值到4.0左右，持续12小时， 使发酵液中的微生物细胞自溶，获得40m3发酵液；
(3)取步骤(2)的发酵液40m3，加入50m3己烷，在60°C的温度条件下，机械搅拌50min， 静置分层，收集上层混合油；
(4)在步骤(3)萃取分离得到的下层溶液中再加入50m3己烷进行二次萃取，萃取步骤
5如上，收集上层混合油，如此重复萃取1次，共萃取2次；
(5)将前述步骤收集得到的上层混合油混合，送入脱油罐脱溶，得油脂1090Kg。生产提油率的计算
取IL步骤(1)得到的发酵液进行实验室提油，提取油脂28. 5g，将IL生产提油提取 的油脂量与IL实验室提油提取的油脂量进行相比，由此计算本实施例的生产提油率为 95. 6%ο实施例4
(1)采用高山被孢霉安瓿罐接种到斜面后，进行液体摇瓶培养，然后转接到一级种子罐 培养后，再转接入50m3发酵罐培养，其中所述培养基的组成为葡萄糖20g/L，酵母粉IOg/ L ；谷氨酸5g/L，其余为水，调节培养基的pH值为6 8，维持发酵罐的温度在25 28°C，每分 钟的空气流量为发酵液体积的1. 2倍，培养160h，发酵结束，得到发酵液；
(2)调节发酵液的温度至45°C，并用柠檬酸调节发酵液的pH值到4.0左右，持续搅拌 12小时，使发酵液中的微生物细胞自溶后，获得40m3发酵液；
(3)取步骤(2)得到的发酵液40m3，加入2吨的氯化钠，在发酵液中搅拌溶解；
(4)在步骤(3)的溶液中继续加入SOm36号抽提溶剂，在50°C的温度条件下，机械搅拌 60min，静置分层，收集上层混合油；
(5)在下层溶液中再加入SOm36号抽提溶剂进行二次萃取，萃取步骤如上，收集上层混 合油，如此重复萃取1次，共萃取2次；
(6)将上述收集得到的上层混合油混合，送入脱油罐脱溶，得油脂530Kg。生产提油率的计算
取IL步骤(1)得到的发酵液进行实验室提油，提取油脂13. 9g，将IL生产提油提取 的油脂量与IL实验室提油提取的油脂量进行相比，由此计算本实施例的生产提油率为 95. 3%ο实施例5
(1)采用隐球酵母菌菌种接种到斜面后，进行液体摇瓶培养，然后转接到一级种子罐培 养后，再转接入100L发酵罐培养，其中所述培养基的组成为葡萄糖40g/L，硫酸铵2g/L， 酵母膏1. 9g/L，磷酸氢二钠2g/L，磷酸二氢钾7g/L，七水合硫酸镁1. 5g/L，其余为水，调节 培养基的PH值为6 8，维持发酵罐的温度在25 28°C，每分钟的空气流量为发酵液体积的1 倍，培养120h，发酵结束，得到发酵液；
(2)调节发酵液的温度至60°C，并用盐酸调节发酵液的pH值到4.5，持续搅拌12小时， 使发酵液中的微生物细胞自溶后，获得50L发酵液；
(3)取步骤(2)得到的发酵液50L，加入50L6号抽提溶剂，在50°C的温度条件下，机械 搅拌60min，静置分层，收集上层混合油；
(4)在下层溶液中再加入50L6号抽提溶剂进行二次萃取，萃取步骤如上，收集上层混 合油，如此重复萃取2次，共萃取3次；
(5)将上述收集得到的上层混合油混合，送入脱油罐脱溶，得油脂1021g。生产提油率的计算
取IL步骤(2)得到的发酵液进行实验室提油，提取油脂22. 4g，将IL生产提油提取 的油脂量与IL实验室提油提取的油脂量进行相比，由此计算本实施例的生产提油率为91. 1%。 上述实施例2和实施例4中在加入萃取剂进行萃取之前，先加入破乳剂，可加快 萃取过程中的分层，缩短静置分层时间，从而提高萃取效率。
权利要求
一种微生物油脂的提取方法，其特征在于包括以下步骤(1)将产油微生物菌种接种到液体培养基中发酵，控制发酵过程中液体培养基的pH值为6~8，通过72~200h的发酵，得到发酵液；(2)调节步骤(1)得到的发酵液温度为40~60℃，并将发酵液的pH值调节为3.5～4.5，进行搅拌，使微生物在12h内自溶；(3)在步骤(2)得到的发酵液中加入萃取溶剂进行萃取，收集上层混合油；(4)在步骤(3)萃取分离得到的下层溶液中加入萃取溶剂，进行二次萃取，收集上层混合油；(5)将步骤(3)和步骤(4)得到的上层混合油混合，蒸馏回收其中的萃取溶剂，即得微生物油脂产品。
2.根据权利要求1所述的微生物油脂的提取方法，其特征在于在进行步骤(3)之前， 在发酵液中加入破乳剂，破乳剂的重量和发酵液的体积的比例为0. 01 0. 05:1 kg/L。
3.根据权利要求2所述的微生物油脂的提取方法，其特征在于所述的破乳剂为无机 盐或与水互溶的有机溶剂，所述的无机盐为氯化钠或氯化钙，所述的有机溶剂为乙醇或丙酮。
4.根据权利要求1所述的微生物油脂的提取方法，其特征在于所述产油微生物中干 物质的含油量大于或等于30%，具体为隐球酵母、高山被孢霉中的一种或海洋微藻中的任一 种。
5.根据权利要求1所述的微生物油脂的提取方法，其特征在于步骤(1)所述的发酵步 骤具体为将产油微生物菌种接种到斜面后，进行液体摇瓶培养，然后转接到发酵罐中，将 培养基的PH值控制在6 8，调节发酵温度为20 30°C，每分钟的空气流量为发酵液体积 的0. 5 1. 5倍，培养72 200h，得到发酵液。
6.根据权利要求1所述的微生物油脂的提取方法，其特征在于步骤(2)所述的pH调 节剂为盐酸、硫酸、磷酸、柠檬酸中的一种。
7.根据权利要求1所述的微生物油脂的提取方法，其特征在于所述步骤(3)的具体 步骤为在步骤(2)得到的发酵液中加入萃取溶剂，所述萃取溶剂的体积为发酵液体积的 50 200%，调节萃取温度为40 60°C，搅拌30 60min，静置分层，收集上层混合油。
8.根据权利要求1所述的微生物油脂的提取方法，其特征在于所述步骤(4)的具体步 骤为在步骤(3)萃取分离得到的下层溶液中加入萃取溶剂，所述萃取溶剂的体积为下层 溶液体积的100 200%，调节萃取温度在40 60°C，搅拌30 60min，静置分层，收集上层 混合油。
9.根据权利要求1所述的微生物油脂的提取方法，其特征在于所述的萃取溶剂为6 号抽提溶剂、己烷、庚烷或石油醚。
10.根据权利要求1所述的微生物油脂的提取方法，其特征在于在进行步骤(5)之前， 将步骤(4)重复进行至少一次。
全文摘要
一种微生物油脂的提取方法，包括以下步骤(1)将产油微生物菌种发酵，得到发酵液；(2)将步骤(1)得到的发酵液的pH值调节为3.5～4.5，使微生物自溶；(3)在步骤(2)得到的发酵液中加入萃取溶剂进行萃取，收集上层混合油；(4)在步骤(3)萃取分离得到的下层溶液中加入萃取溶剂，进行二次萃取，收集上层混合油；(5)将步骤(3)和步骤(4)得到的上层混合油混合，蒸馏回收其中的萃取溶剂，即得微生物油脂产品。该提取方法能有效萃取出微生物细胞内的油脂，即提油率高，且提油效率高，工艺简单，有利于实现规模化生产。
文档编号C12P7/64GK101985637SQ20101052770
公开日2011年3月16日 申请日期2010年11月2日 优先权日2010年11月2日
发明者向丽, 唐孝鹏, 尚耘, 汪志明, 肖子豪, 马凡提 申请人:嘉吉烯王生物工程(武汉)有限公司