专利名称：高密度发酵生产沼泽红假单胞菌发酵液的方法
技术领域：
本发明属于微生物发酵，特别是指一种高密度发酵生产沼泽红假单胞菌发酵液的 方法。
背景技术：
光合细菌作为一种营养丰富的光能自养菌，本身含有多种营养物质和生理活性物 质，具有进行光合作用、发酵以及固氮、产氢等功能，近几十年来受到广泛的关注，在人类生 活的多方面都具有重要作用，在废水处理、单细胞菌体蛋白生产、水产养殖、农牧业、生产食 用色素等方面的应用有着不可替代的生物学作用，特别是近年来作为生物制品的绿色、环 保作用更加受到各界人士的重视。随着现代工业、农业、养殖业的可持续发展，传统的光合 细菌生产的方法已不能满足各行业的需求，大规模、高密度发酵生产已成为光合菌生产的 方向，选择合适的菌株以及适当的培养条件是大规模工业化生产的关键技术步骤。
目前传统的光合细菌生产一般有室内和室外培养两种方法。室内培养适用比较少量的 生产，用透明的玻璃瓶(桶)或塑料瓶(桶)作容器，白炽灯作光源，在30°C培养，周期为7-10 天；室外培养适用规模较大的生产，用透明的大桶作容器或在地上挖出池子，以日光为光源 和能源，受季节影响很大，一般在发酵温度在高于25V，且低于35-38°C的季节才能生产， 生产周期受气温的影响在5-15天不等，产品质量的稳定性也不能有效保障。并且传统方法 生产光合细菌受季节等因素的影响不易进行规模化工业大生产。沼泽红假单胞菌seudomonas /^h1Siri1S)是研究和应用较为广泛的一种 光合细菌，属于外硫红螺菌科红假单胞菌属，最佳生长方式是利用各种有机化合物作碳源 和电子供体进行光照厌氧培养。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高密度发酵生产沼泽红假单胞菌发酵液的方法，用两 步法发酵生产沼泽红假单胞菌，与传统的生产方法相比较具有生产周期短和产品质量稳定 的优势，更易于大规模工业化生产。本发明的整体技术构思是
高密度发酵生产沼泽红假单胞菌发酵液的方法，包括如下工艺步骤
A、将沼泽红假单胞菌ASl.2349接种到种子培养基中，采用光照培养法进行扩大培养 制成种子液，按照体积比为种子培养基种子罐=200-300 1000的比例装料，将种子培养基 灭菌后，按照体积比为原始菌种种子培养基=3-5 100的接种量将原始菌种接入种子罐， 培养条件为温度，光照强度3000-4000LX，静止培养4_6天，发酵液呈淡红色，用显 微镜观察计数，菌体细胞卵形，生长正常，无杂菌污染，含菌量35-40亿/毫升以上，终止培 养；
B、将步骤A中的种子液接种到发酵培养基中，采用暗培养法进行发酵制成沼泽红假 单胞菌发酵液，按照体积比为发酵培养基发酵罐=60-70 100的比例装料，将发酵培养基灭菌后冷却，按照体积比为种子液发酵培养基=8-10 100的接种量将步骤A中制成的种 子液接入冷却后的发酵培养基，发酵条件为温度^_32°C，通风量按照发酵液通风量=1 0. 3-0. 5vvm，培养周期M-36小时，显微镜观察菌体细胞生长正常，无杂菌，终止发酵；
其中步骤A、B中种子培养基、发酵培养基pH=7. 0-7. 5，且由如下百分含量的原料组成 葡萄糖 0. 18%-0. 2% 硫酸铵 0. 18%-0. 22% 酵母膏 0. 12%-0. 18% 乙酸钠0. 16%-0. 2% 氯化钠0. 08%-0. 1% 余量为水。本发明中的具体的工艺步骤和工艺条件是
步骤A中种子培养基的灭菌条件为温度121°C、时间20-30分钟。步骤B中发酵培养基的灭菌条件为温度121_125°C、时间25_35分钟，灭菌冷却至 35°C以下后向发酵培养基中接入种子液。步骤B中终产物——沼泽红假单胞菌发酵液可采用最大或然值法(MPN5管法)测 定活菌含量。本发明中发酵的检测结果如下
河北省微生物研究所检测中心按照《中华人民共和国行业标准-光合细菌菌剂》(NY 527-2002)记载的方法，对利用本发明的方法制备的沼泽红假单胞菌发酵液进行测试，菌体 浓度可以达到70亿/毫升以上，最高可以达到77. 6亿/毫升(目前光合细菌产品没有国家 标准，国家行业标准的要求仅是不低于5亿/毫升)。本发明所具备的实质性特点和显著的技术进步在于
1、生产周期短，发酵液中的菌体浓度高。采用上述培养基配方和生产工艺发酵生产沼 泽红假单胞菌，发酵生产周期短，仅为M 36小时；菌体浓度可以达到70亿/毫升以上。2、生产成本低，工艺容易控制。用两步法发酵生产光合细菌原料的总固形物含量 不超过1%，且全部为市售化工原料，生产成本低廉，用通用式发酵罐发酵生产工艺易控制， 产品质量稳定，可以达到大规模工业化生产的要求。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明作进一步描述，但不作为对本发明的限定，本发明的保 护范围以权利要求书所记载的内容为准，任何依据本发明说明书所作出的等效技术手段替 换，均不脱离本发明的保护范围。实施例1
高密度发酵生产沼泽红假单胞菌发酵液的方法，包括如下工艺步骤
A、将沼泽红假单胞菌ASl.2349接种到种子培养基中，采用光照培养法进行扩大培养 制成种子液，按照体积比为种子培养基种子罐=200 1000的比例将原始菌种接入IOOOml 三角瓶中，将种子培养基灭菌后，按照体积比为原始菌种种子培养基=3 100的接种量将 菌种接入三角瓶中，培养条件为温度，光照强度3000-4000LX，静止培养4_6天，发酵液 呈淡红色，用显微镜观察计数，菌体细胞卵形，生长正常，无杂菌污染，含菌量35-40亿/毫 升以上，终止培养；
B、将步骤A中的种子液接种到发酵培养基中，采用暗培养法进行发酵制成沼泽红假单 胞菌发酵液，按照体积比为发酵培养基发酵罐=60 100的比例装料，将发酵培养基灭菌后 冷却，按照体积比为种子液发酵培养基=8 100的接种量将步骤A中制成的种子液接入冷却后的发酵培养基，发酵条件为温度，通风量按照发酵液通风量=1 :0. 3vvm,培养周 期M-36小时，显微镜观察菌体细胞生长正常，无杂菌，终止发酵；
其中步骤A、B中种子培养基、发酵培养基pH=7.0，且由如下百分含量的原料组成 葡萄糖0. 18 硫酸铵0. 18% 酵母膏0. 12% 乙酸钠0.16% 氯化钠0.08% 余量为水。发酵罐采用通用式发酵罐。步骤A中种子培养基的灭菌条件为温度121°C、时间20-30分钟。步骤B中发酵培养基的灭菌条件为温度121_125°C、时间25_35分钟，灭菌冷却至 35°C以下后向发酵培养基中接入种子液。步骤B中终产物——沼泽红假单胞菌发酵液可采用最大或然值法(MPN5管法)测 定活菌含量。实施例2
高密度发酵生产沼泽红假单胞菌发酵液的方法，包括如下工艺步骤
A、将沼泽红假单胞菌ASl.2349接种到种子培养基中，采用光照培养法进行扩大培养 制成种子液，按照体积比为种子培养基种子罐=300 1000的比例装料，将种子培养基灭菌 后，按照体积比为原始菌种种子培养基=5 100的接种量将原始菌种接入种子罐，培养条 件为温度32°C，光照强度3000-4000LX，静止培养4_6天，发酵液呈淡红色，用显微镜观察计 数，菌体细胞卵形，生长正常，无杂菌污染，含菌量35-40亿/毫升以上，终止培养；
B、将步骤A中的种子液接种到发酵培养基中，采用暗培养法进行发酵制成沼泽红假单 胞菌发酵液，按照体积比为发酵培养基发酵罐=70 100的比例装料，将发酵培养基灭菌后 冷却，按照体积比为种子液发酵培养基=10 100的接种量将步骤A中制成的种子液接入 冷却后的发酵培养基，发酵条件为温度32°C，通风量按照发酵液通风量=1 0. 5vvm，培养 周期M-36小时，显微镜观察菌体细胞生长正常，无杂菌，终止发酵；
其中步骤A、B中种子培养基、发酵培养基pH=7. 5，且由如下百分含量的原料组成 葡萄糖0. 2% 硫酸铵0. 22% 酵母膏0. 18% 乙酸钠0.洲 氯化钠0.1% 余量为水。发酵罐采用通用式发酵罐。步骤A中种子培养基的灭菌条件为温度121°C、时间20-30分钟。步骤B中发酵培养基的灭菌条件为温度121_125°C、时间25_35分钟，灭菌冷却至 35°C以下后向发酵培养基中接入种子液。步骤B中终产物——沼泽红假单胞菌发酵液可采用最大或然值法(MPN5管法)测 定活菌含量。
权利要求
1.高密度发酵生产沼泽红假单胞菌发酵液的方法，其特征在于包括如下工艺步骤A、将沼泽红假单胞菌ASl.2349接种到种子培养基中，采用光照培养法进行扩大培养 制成种子液，按照体积比为种子培养基种子罐=200-300 1000的比例装料，将种子培养基 灭菌后，按照体积比为原始菌种种子培养基=3-5 100的接种量将原始菌种接入种子罐， 培养条件为温度，光照强度3000-4000LX，静止培养4_6天，发酵液呈淡红色，用显 微镜观察计数，菌体细胞卵形，生长正常，无杂菌污染，含菌量35-40亿/毫升以上，终止培 养；B、将步骤A中的种子液接种到发酵培养基中，采用暗培养法进行发酵制成沼泽红假 单胞菌发酵液，按照体积比为发酵培养基发酵罐=60-70 100的比例装料，将发酵培养基 灭菌后冷却，按照体积比为种子液发酵培养基=8-10 100的接种量将步骤A中制成的种 子液接入冷却后的发酵培养基，发酵条件为温度^_32°C，通风量按照发酵液通风量=1 0. 3-0. 5vvm，培养周期M-36小时，显微镜观察菌体细胞生长正常，无杂菌，终止发酵；其中步骤A、B中种子培养基、发酵培养基pH=7. 0-7. 5，且由如下百分含量的原料组成葡萄糖 0. 18%-0. 2% 硫酸铵 0. 18%-0. 22% 酵母膏 0. 12%-0. 18%乙酸钠0. 16%-0. 2% 氯化钠0. 08%-0. 1% 余量为水。
2.根据权利要求所述的高密度发酵生产沼泽红假单胞菌发酵液的方法，其特征在于所 述的步骤A中种子培养基的灭菌条件为温度121°C、时间20-30分钟。
3.根据权利要求1所述的高密度发酵生产沼泽红假单胞菌发酵液的方法，其特征在于 步骤B中发酵培养基的灭菌条件为温度121-125°C、时间25-35分钟，灭菌冷却至35°C以下 后向发酵培养基中接入种子液。
全文摘要
本发明属于微生物发酵，特别是指一种高密度发酵生产沼泽红假单胞菌发酵液的方法。以沼泽红假单胞菌AS1.2349作为原始菌种，依次采用光照培养法进行扩培，将扩培制成的种子液接入发酵培养基采用暗培养法进行发酵制成沼泽红假单胞菌发酵液。本发明解决了现有技术存在的周期长、产品质量不易得到控制等问题。具有发酵周期短、产品质量稳定、生产成本低等优点。
文档编号C12R1/38GK102061279SQ201010552678
公开日2011年5月18日 申请日期2010年11月22日 优先权日2010年11月22日
发明者唐兆宏, 李军, 李宾, 章淑艳, 赵丛波, 陈文杰, 马清河, 魏亚新 申请人:河北省微生物研究所