专利名称：支持多能细胞生长的小分子和其方法
技术领域：
本发明涉及一种至少部分含有小分子神经递质的多能干细胞培养基。具体说来，本发明涉及确定成分的多能干细胞培养基，其基本上不含血清和饲养层，包括去甲肾上腺素、乙酰胆碱和多巴胺中的至少一者，并支持多能人类干细胞的悬浮细胞聚集体培养。
背景技术：
基于多能细胞的替代疗法的最终应用将需要开发顺应管理法规能够适应大规模培养和分化条件的方法。在美国，食品和药品管理局(FDA)以草案指引的形式向审阅者颁布了指引人类体细胞疗法新药研究申请(IND)的化学、制造和控制(CNC)审阅者说明和模板(Instructions and Template for Chemistry, Manufacturing, and Control(CMC)Reviewers of Human Somatic Cell Therapy Investigational New Drug Applications)；以及21CFR§ 1270和§1271法规。在欧洲，有关细胞疗法产品的要求略述于与人胚胎干(human embryonic stem, hES)细胞有关的几个指导和指南中。参看指导(Directive) 2004/23/EC、指导委员会(Commission Directives) 2006/17/EC 2006/86/E、欧洲法规1394/2007、指南EMEA/CHMP/410869，这些都以引用的方式全文并入本文中。每个国家对于人组织和细胞的质量和安全性(包括捐赠、取得、测试、加工、保存、储存和分配)都具有某些法规标准。法规确立了有关基于细胞的医疗产品的开发、制造和质量控制以及非临床和临床开发的指南。也参看安格(C. Unger)等人(2008)，人类分子遗传学(Human Molecular Genetics)17(Rl) :R48_R53。法规指南针对以制造规模生产干细胞及其产品提供了许多限制。举例来说，为了使多能细胞在体外保持未分化状态，研究性学习仍采用畜产品，例如小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast, MEF)饲养层和胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)。用于保持多能性的其它细胞培养条件含有血清替代品，例如KnockOut 血清替代品(KSR ;英杰公司(Invitrogen)),尽管其已确定较多成分,但仍含有包括未知化合物的复杂粗混合物，以及牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)或牛血清中富含脂质的白蛋白部分(AlbuMAX)。此外，血清批料的活性不同，且因此其保持多能未分化细胞培养物的能力也不同。因此，优选用非动物源性(“不含异源动物成分”)的确定组分替代牛血清，依据GMP进行多能细胞的生产。申请人:先前已经确定，IGF1、胰岛素、ERBB2和ERBB3受体活化是hES细胞增殖的标志。IGF1R/IR活化可归因于血清中的IGF1，或例如血清替代品中微克/毫升浓度的胰岛素，或众多生长条件中N2/B27细胞培养补充物。这些活性提供较强的PI3激酶/AKT信号，并且利用较低浓度的LR3-IGF1 (—种IGFl类似物)可实现相当的活化作用。参看麦克林恩(McLean)等人，2007，干细胞(Stem Cells) 25，29-38。ERBB2/3 磷酸化与 EGF 家族成员调蛋白(heregulin)/神经调节蛋白(neuregulin)在MEF-CM中的活性一致。参见王(Wang)等人，2007，血液学(Blood) 110，4111—9。抑制 IGFlR 和 ERBB2 将影响 hES 细胞的自我更新，就如同激活素和FGF信号传导的小分子抑制剂。参看罗宾斯(Robins)和斯库兹(Schulz)，2009，“干细胞培养和保持的新颖方法有关大规模ESC生长的培养基和额外细胞基质要求(Novel methods of Stem Cell Culture and Maintenance Media andextra cellular ma trix requirements for large scale ESC growth).，，干细胞新技术平台(Emerging Technology Platforms for Stem Cells)(编辑 U.拉克斯米中白斯 J.D·彻斯努特(U. Lakshmipathy J. D. Chesnut)和 B.泰雅拉吉(B. Thyagarajan),第 251-247 页)霍博肯(Hoboken).约翰威立出版公司(John Wiley & Sons Inc.);以及瓦利尔(Vallier)等人，2005细胞科学杂志(J Cell Sci) 118，4495-509)。这一确定成分培养基被开发出来，并称为DC-HAIF，其由以下各物组成DMEM/F12、非必需氨基酸、微量元素、抗坏血酸、β-巯基乙醇、青霉素(Penicillin)/链霉素(Streptomycin)(任选使用)，其中所含蛋白质只有辛酸萃取的不含脂肪酸的BSA、转铁蛋白和重组调蛋白I β (H)、激活素A(A)、LR3-IGF1(I)和FGF2 (F)。DC-HAIF支持长期保持多能hES细胞，以及使用ACXUTASE 进行的hES细胞的单细胞传代和按比例扩增。参看罗宾斯(Robins)和斯库兹(Schulz) (2009)同上文；王(Wang)等人，同上文。可用的分批测试的DC-HAIF商用调配物领有生命技术公司(LifeTechnologies)执照，并以商标名StemPro hES细胞SFM销售。仍需要鉴别在例如hES和iPS细胞等多能干细胞中具有关键功能的替代性和/或其它信号传导路径，并且这些信号传导路径能够用于治疗目的，其中培养组合物已确定成分和/或依据GMP标准生产。
发明内容
本发明涉及供多能细胞生长的包含基础盐营养液的组合物，其至少包含去甲肾上腺素和多巴胺，所述组合物基本上不含血清。
图I.在hES细胞中通过化合物筛选鉴别的神经递质/激素受体的拮抗剂/调节剂的说明。初步库筛选的碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,AP)染色显示对细胞无影响(+++，汇合生长)、中等影响(++)或严重(+)影响；还指示仅很少细胞(+/_)或无细胞(_)受影响。图中(左边一列)显示在初步筛选中鉴别的受体拮抗剂。此筛选是使用10μΜ化合物进行。显示二次剂量滴定分析法(50 μ M到0. I μ M列)，并且指示每一化合物和作用所靶向的受体类别。图2. hES细胞(例如BG02细胞)的低密度接种分析法。在6孔盘中，按10000个细胞/孔接种于StemPro hESC SFM(生命技术公司(Life Technologies))培养基中，并于7天后用碱性磷酸酶(AP+)染色。Y(Y27632)、ACh (乙酰胆碱)、NMDA (N-甲基-D-天冬氨酸)、NE ((-)-去甲肾上腺素)、NE. Bit ((±)-去甲肾上腺素(+)-酒石酸氢盐)。如所示，添加的化合物为10 μ M或50 μ Μ。
图3. hES细胞的低密度接种分析法。㈧在6孔盘中，按200到10000个细胞/孔接种于StemPro hESC SFM 培养基，或者StemPro hESC SFM+50 μ M NE，或StemPro hESCSFM+50 μ M Ach中，并于8天后用碱性磷酸酶(AP+)染色。显示可比较的集落数量。ACh (乙酰胆碱)、ΝΕ((±)_去甲肾上腺素(+)-酒石酸氢盐)。(B)由以低细胞密度接种并利用NE或ACh支持得到的hES细胞集落的未分化形态(第5天)。图4.使用RT-CES阻抗读取器读取的NE和ACh的滴度。按1000个细胞/孔将hES细胞接种于含有指 定浓度小分子(以μ M为单位)的StemPro hESC SFM中。在这一分析法中，细胞指数升高的时间选择与以较低密度存活和扩增的细胞的比例相关。增加NE和ACh的浓度一般使细胞指数在早期升高。在约160小时时出现的阻抗峰值是人为结果和
误差所致。图5.在低细胞密度分析法中小分子化合物组合的组合作用。(A)按1000个细胞/孔将 hES 细胞接种于含有 50 μ M(NE、AChj|-、GABA)或 10 μΜ(Υ27632)小分子的StemPro hESC SFM中。这一分析法使用RT-CES系统进行5天。观察到四组痕迹最有效的化合物/组合是NE/腺苷以及NE/ACh ;中间组含有呈个别因子形式的NE和ACh，以及一些其它组合；低水平组含有单独腺苷和GABA，以及几个无效因子/组合。(B)观察到的活性的概述。相对分级(_到+++)指示在支持低密度生长方面的有效性，协同作用通过填充灰色指示，且拮抗作用通过填充黑色指示。图6.支持低密度hES细胞存活的其它神经递质和相关化合物。按1000个细胞/孔将hES细胞接种于含有调蛋白、IGFl和激活素(HIA)以及指定小分子的StemPro hESC SFM中。(A)鉴别支持低密度存活的其它腺苷和肾上腺素受体激动剂。测试的化合物为10μΜ。微量DMSO是8个孔的平均值。(B)列表显示所鉴别化合物的信息。(C)多巴胺、高香草酸(homovanilloic acid，HVA)和血清素支持低密度hES细胞存活。测试的化合物为指定浓度。在约160小时时出现的阻抗峰值是人为结果和误差所致。图7.在不存在激活素情况下改进低细胞密度存活率。按1000个细胞/孔将hES细胞接种于含有生长因子与小分子的指定组合的StemPro hESC SFM中。调蛋白(H)、LR3-IGF1(I)、激活素(A)。图8.针对激活素对低密度存活/集落形成的影响的集落计数分析法。(A)将10000个hES细胞接种于含有生长因子与小分子的指定组合的StemPro hESC SFM中，并于7天后针对碱性磷酸酶活性进行染色。计算AP+集落数量，明显证实激活素对低密度培养具有不利影响。(B)在每一生长因子背景中+NE和+ACh条件的显微镜照片。在不存在激活素的情况下，集落是更为紧密且呈原型的未分化细胞。图9.针对生长因子与神经递质的组合的低密度RT-CES分析法。按1000个细胞/孔将hES细胞接种于含有生长因子与小分子的指定组合的StemPro hESC SFM中。调蛋白(H)、LR3-IGF1⑴、激活素㈧。测试的小分子为50 μ Μ。图10.在hES细胞的悬浮培养中NE和ACh的作用。(A)在低粘附6孔盘中，将5X106个CyT49细胞接种于含有调蛋白、LR3-IGF1、激活素和50μΜ指定神经递质的5ml StemPro hESC SFM中，并放在IOOrpm环境中。第4天，获取未分化悬浮聚集体的图像。(B)接种后24小时，采集每一条件的两个孔并计数，以确定活细胞数量。(C)第4天培养物分裂时每一条件的细胞数量。(D)使用(A)中的图像，使用ImagePiX)软件测量工具测定聚集体直径。显示来自每一条件的50到100个聚集体的平均直径和标准偏差。(E)第I代细胞的计数数据。将来自(A)中PO细胞的5\106个07了491^5细胞接种于相同条件中。在含有Y27632的条件中的聚集体较大，且须在接种后3天，在最大的聚集体的中心坏死之前传代。相反，在传代前，其它条件可培养6天，以产生较高细胞数量。图11.用NE、NE/ACh或NE/ACh培养的悬浮hES细胞保持未分化。CyT49细胞在NE、NE/ACh或NE/ACh存在下以悬浮聚集体形式生长16代，未出现形态分化。第10代后，将部分细胞再接种于粘附培养 物中，并通过核型分型和免疫荧光染色检查0CT4和Tra-1-61。所有培养物都保持未分化，且均匀表达这些多能标记物。(SP) StemPro SFM HIA、NE (+50 μ MNE)、ACh (+50 μ M ACh)、NE/ACh (+NE/ACh,均为50 μ M)。核型分型数据显示于右边。SP和SP+NE培养物的核型分型正常。含有ACh的培养物是非整倍体的。图12.在短期阻抗分析法中支持标准密度hES细胞(例如BG02)的NE和生长因子组合。(A)按IO4个细胞/孔将BG02细胞接种于含有50 μ M NE和指定生长因子组合的StemPro hESC SFM 中。调蛋白(H)、LR3-IGF1 (I)、激活素(A)、FGF2(F)。与在低细胞密度下得到的结果相对，NE可支持培养物在不存在调蛋白的情况下于一些条件中扩增。这些支持性组合包括NE/AIF、NE/IF、NE/IA和NE/I。(B)显示接种后50小时到60小时细胞指数的斜率(A中的线)的测量值。与只显示最小增殖的条件(NE/F)相比较，其它条件展现细胞指数的有效增加，表明细胞群扩增。图13.支持标准密度hES细胞(例如BGOl细胞)连续传代的去甲肾上腺素和生长因子组合。在连续培养期间hES细胞相对扩增。在6孔盘每一孔中，将每一代5X 105个hES细胞接种于含有50 μ M NE与指定生长因子的组合的StemPro hESC SFM中。调蛋白(H)、LR3-IGF1 (I)、激活素(A)、FGF2 (F)。在每一次传代结束时，绘制支持扩增的条件的细胞数量图。双虚线表示每一代接种的细胞数量。与HAIF对照培养物相比较，不存在调蛋白(AIF)导致经多次传代生长减少。在各孔包装紧密的外环中观察到集落生长，但不横过整个盘。仅暴露于IF的培养物在2次传代后无法有效保持，证实此细胞系需要激活素/nodal信号传导。存在NE对在AIF条件下增殖具有明显积极影响，使得甚至培养物生长和形态都类似于HAIF条件。NE不能取代激活素/nodal需求，这是因为经过几次传代，IF/ΝΕ条件有所区别。图14.支持标准密度hES细胞连续传代的去甲肾上腺素和生长因子组合。在连续培养期间hES细胞相对扩增。在6孔盘每一孔中，将每一代5 X 105个hES细胞接种于含有50 μ M NE与指定生长因子的组合的StemPro hESCSFM中。绘制在每一次传代结束时的细胞数量。双虚线表示每一代接种的细胞数量。调蛋白(H)、LR3-IGF1 (I)、激活素(A)、FGF2(F)。在第2次传代时，也使用AIF培养物建立额外的Al或AI/NE孔。与HAIF对照培养物相比较，不存在调蛋白(AIF)导致形态改变。尽管细胞保持未分化细胞的特征，但其外观更扁平且更大，细胞间具有更大间隙。在含有激活素(不存在调蛋白)的所有培养物中都观察到类似形态。在IF中的集落包装很紧密并呈半球形，与标准小鼠ES细胞培养物的形态较为相似。在IF/ΝΕ和IF/ΝΕ/头蛋白(Noggin)中的培养物展现异常形态，具有紧密的上皮集落和不明显的分化。图15.在含有NE和简化的生长因子组合的确定成分培养基中连续传代的hES细胞中多能标记物的表达。将如所述培养4代的人ES细胞(图14)接种到载片上，扩增并针对所述标记物进行免疫染色。在IF和IF/NE (以及AIF和AIF/NE，未图示)中扩增的培养物保持预期的多能标记物(包括0CT4、S0X2、SSEA4和TRA-1-60)表达谱。图16.在hES细胞中且在分化成胰腺内胚层期间肾上腺素受体表达的qPCR分析。基因名称用标识符指示(例如，ADRAlA指示a IA-肾上腺素受体)。胰腺分化的hES细胞样品是通过分化天数指示第O天，未分化的hES细胞；第2/3天，定形内胚层；第5/7天，原始消化管；第7/9天，后前肠；第11天，胰腺内胚层。图式是相对于第O天hES细胞样品的差异倍数表达(fold-expression)，并且经显示，这一样品的临界交叉点表明不同肾上腺素受体之间的相对表达水 平。图中显示包括BG01、BG02和CyT49细胞在内的其它hES细胞样品。ADRBl、ADRB2、ADRA2B和ADRAlD看起来是未分化hES细胞中最为一致且最高表达的肾上腺素受体。ADRA2C看起来在hES细胞样品中表达一致，但表达水平较低，而ADRAlA和ADRAlB只以较低水平表达，或在未分化细胞中只能不一致地检测到。图17.抑制肾上腺素受体影响低密度hES细胞的存活和扩增。在阻抗读取器中，按2000个细胞/孔将BG02细胞的低密度培养物接种于含有调蛋白、激活素、LR3-IGF1和50 μ M NE的StemPro hESC SFM中，并监测7天。包括每一对照物的8个孔，并且这些孔含有DMSO (负对照物)或DMS0/50 μ M NE (NE对照物)。一式两份，测试40种不同的α -肾上腺素受体或β -肾上腺素受体抑制剂对NE介导的低密度hES细胞存活/扩增的过度不利作用。鉴别影响hES细胞的7种α -肾上腺素受体拮抗剂(Ant. )、5种β -肾上腺素受体拮抗剂和2种β_肾上腺素受体阻断剂。每一活性化合物的名称、作用、已知选择性和描述都指示于图中。
具体实施例方式为了突显低密度hES细胞中具有关键功能的其它信号传导路径，将筛选具有已知生物活性的化合物的小分子库，以鉴别出不利地影响培养物扩增和/或多能性的化合物。在此类分析法中，预期抑制关键路径将导致增殖减慢、细胞毒性、细胞凋亡或分化。重要的是，此筛选法是针对简单的确定成分培养基背景进行，降低了通常由例如血清或半分馏白蛋白等未确定或可变的组分引入的不一致性。简单的碱性磷酸酶染色分析法被用来确定约50种影响hES细胞生长的化合物。在这些化合物中鉴别出许多细胞表面神经递质受体抑制齐U，表明这些受体在自我更新方面所起的信号传导作用。使用天然存在的配体或药理学相关衍生物，发现也可充当激素或调节剂的数类小分子神经递质可支持低密度生长的hES细胞的存活和/或扩增。这些活性对于开发适于hES细胞的商业和临床应用的先进技术至关重要，例如可靠的单细胞克隆技术、在符合GMP的完全确定的条件下有效衍生新hES细胞系的技术、hES细胞的悬浮生长和传代后活力增强。定义除非另作说明，否则本文中使用的术语应根据相关领域技术人员的常规用法理解。除下文提供的术语的定义外，分子生物学中常用术语的定义也可见于林格(Rieger)等人，1991,遗传学词典经典和分子遗传学(Glossary of genetics !classical andmolecular),第5版，柏林(Berlin):施普林格-维拉格出版公司(Springer-Verlag)；和分子生物学实验技术(Current Protocols in Molecular Biology), F. M.奥斯贝尔(F. M. Ausubel)等人编，实验室指南(Current Protocols),格里尼出版公司与约翰威立出版公司的合资企业(a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. andJohn Wiley & Sons, Inc.), (1998增补)。应了解,说明书和权利要求书中使用的“一个(种)”可视其使用的上下文而表示一个(种)或一个(种)以上。因此，例如提到“一个细胞”可表示至少一个细胞、两个细胞或多个细胞。另外，为达成本说明书和所附权利要求书的目的，除非另作指示，否则表示成分的量、物质百分含量或比例、反 应条件以及说明书和权利要求书中所用其它数值的所有数字都应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。因此，除非作相反指示，否则以下说明书和所附权利要求书中陈述的数字参数都是近似值，其可视本发明意图获得的所需特性而变化。在最低限度上，且不打算将等同原则(doctrine of equivalent)的应用局限于权利要求书的范围，各数字参数至少应根据所报导的有效数位的数字并应用常用的舍入技术来解释。本文中使用的“约”意思指，称为“约”的数字包含所述数字土所述数字的1%到10%。例如，视情形而定，约50个核苷酸可表示45到55个核苷酸，或少到49到51个核苷酸。无论何时出现在本文中，数字范围，例如“45到55”是指在指定范围内的每一整数；例如“45%到55%”是指所述百分含量可为45%、46%等，最大为55%且包括55 %。在本文所述范围包括小数值时，例如“I. 2%到10.5%”，这一范围是指在指定范围中所述最小增量的每一小数值；例如“1.2%到10. 5% ”意思指所述百分含量可为1.2%、1.3%、1.4%、I. 5%等，最大为10. 5%且包括10. 5% -MuI- 20%到10. 50% ”意思指所述百分含量可为I. 20%Λ. 21%Λ. 22%Λ. 23%等，最大为 10. 50%且包括 10. 50%。制造规模的悬浮培养通常利用连续灌注培养基作为保持细胞活力同时使细胞密度最大的方法。在此情形中，更换培养基对培养物施加流体剪切力，从而不同地影响粘附细胞和悬浮的聚集体。当培养基沿切向流过细胞表面时，固定的粘附细胞将经受流体剪切应力。相比之下，由于聚集体对所施加的剪切力反应而自由翻滚，使得悬浮的聚集体在整个聚集体表面上所经历的剪切应力明显较低。预期长期的剪切应力将不利于粘附的ES细胞，并且悬浮的聚集体形式是最佳存活和功能所优选的。因此，基于需要按照以上观察的有关剪切速率和剪切应力的力学产生多能干细胞和/或源自于多能干细胞的专能祖细胞的有效制造工艺，本发明首次提供用于以悬浮形式且更具体说来以细胞聚集体悬浮形式产生多能干细胞和/或源自于多能干细胞的专能祖细胞的制造方法。本文中使用的“单细胞悬浮液”或等效的表述是指彼此分离(即，未聚集)的流体与细胞或更通常说来多个细胞的混合物，其可借助任何可用的机械、生物学或化学方式制备。本文所述的单细胞悬浮液通常是悬浮于例如基础盐溶液、生理盐水、细胞培养基等生理溶液中的活hES细胞或hES源性细胞的制剂。有几种方法可用于解离来自初生组织、培养的粘附细胞和细胞聚集体的细胞簇以形成单细胞悬浮液，包括(但不限于)通过物理力(机械解离，例如细胞刮、通过窄孔吸管研磨、细针抽吸、涡旋解聚集和通过细尼龙(nylon)或不锈钢筛网强制过滤)、酶(酶促解离，例如胰蛋白酶、胶原蛋白酶、Accutase 等)或其组合解离细胞的方法。此外，能够支持hES细胞的单细胞悬浮液生长和存活的方法和培养基条件可用于扩增、细胞分选和适于多孔板分析法的指定接种，并使培养程序和克隆扩增能自动化。因此，本发明一个实施例提供用于产生能够支持长期保持和有效扩增未分化的多能hES细胞或分化的hES细胞的稳定单细胞酶促解离hES细胞或hES源性细胞培养系统的方法。
本文中使用的术语“接触”(即，使例如可分化的细胞等细胞与化合物接触)拟包括在体外一起培育化合物和细胞(例如，将化合物添加到培养的细胞中)。术语“接触”不打算包括在体内将细胞暴露于包含某些组分、化合物、生长因子等(例如神经递质、ErbB3配体、TGF-β家族成员等)的确定成分细胞培养基，因为这些物质天然存在于个体中(即，暴露可由天然生理过程所引起)。举例来说，使细胞与含有神经递质、ErbB3配体和TGF-β家族成员的确定成分细胞培养基接触的步骤可以任何适合的方式进行，但应理解为暴露细胞以与上述组分接触。举例来说，可通过将细胞与组分以粘附培养或悬浮培养的方式培育(培养)来接触细胞。应了解 ，与确定成分培养基中的组分接触的细胞可进一步用细胞分化环境处理以使细胞稳定，或使细胞分化。本文在有关细胞培养的上下文中使用的“支持”是指足以供细胞培养物实现所需生长、活力、多能性和/或其它特征的培养基组成和其特定组分。因此，支持未分化hES细胞扩增的确定成分培养基是当在不含其它因子、化合物、添加剂等的情况下用来培养hES细胞时，细胞将生长而不发生分化的培养基。支持hES细胞扩增的化合物或因子是当添加到所述培养基条件中时会使hES细胞生长的化合物或因子。本文中使用的“确定成分细胞培养基”、“确定成分培养基(defined culturemedia/defined media) ”可互换使用，意思指含有特定比例、量或活性的无机组分和有机组分(包括生物组分和生物活性组分)的水性组合物，其能精确地繁殖，并具有实质上类似的特性。确定成分培养基可含有蛋白质，优选重组蛋白质，条件是这些蛋白质经过制备或纯化，而不具有明显的逐批量或逐批次变化。动物血清固有地具有不确定性和可变性，且因此确定成分培养基中不包括血清。然而，在确定成分培养基中可包括基于质量、摩尔当量或活性(例如可测量的生物活性)的量或比例的个别高度纯化的血清或其它蛋白质、因子等。本文中使用的术语“分化”是指产生比来源细胞类型更专门化的细胞类型。因此，本术语涵盖部分分化和末端分化的细胞类型。来源于hES细胞的分化的细胞一般称为“hES源性细胞”、“hES源性细胞聚集体培养物”、“hES源性单细胞悬浮液”、“hES源性细胞粘附培养物”等。本文中使用的术语“实质上”是指很大范围或程度。例如，“实质上类似”在上下文中可用于描述某一方法在很大范围上或程度上类似于另一方法。然而，本文中使用的术语“实质上不含”(例如“实质上不含”，或“实质上不含污染物”，或“实质上不含血清”，或“实质上不含胰岛素或类胰岛素生长因子”或等效的表述)意思指，所述溶液、培养基、补充物、赋形剂等至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%或至少约100%不含血清、污染物或其等效物。在本发明一个实施例中，提供的确定成分培养基不含血清，或为100%不含血清的，或为实质上不含血清的。相比之下，“实质上类似”的组合物、工艺、方法、溶液、培养基、补充物、赋形剂等与前文所述或在以全文引用方式并入本文中的先前所述工艺或方法中的参考组合物、工艺、方法、溶液、培养基、补充物、赋形剂至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%类似。在本发明某些实施例中，术语“富含”是指细胞培养物含有超过约50155%,60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或 95%所需细胞谱系。本文中使用的术语化合物的“有效量”或等效的表述是指化合物的所述量足以在其余组分存在下，在不存在饲养层细胞且不存在血清或血清替代品情况下实现所需结果，例如，使多能细胞培养物稳定超过I个月、2个月、3个月、4个月、5个月和/或6个月或更长月份。在本发明其它方面中，化合物的“有效量”或等效的表述意思指，化合物的所述浓度足以在其余组分存在下，在不存在饲养层细胞且不存在血清或血清替代品情况下使多能细胞培养物稳定超过5、10、15、20、25、30或40代。类似地，所属领域技术人员易于测定这
一浓度。本文中使用的术语“表达”是指细胞中多核苷酸的转录和/或多肽的翻译，因此表达某一分子的细胞中所述分子的含量明显高于不表达所述分子的细胞中的含量。所属领域技术人员众所周知测量分子表达的方法 ，且其包括(不限于)RNA印迹法(Northernblotting)、RT-PCR、原位杂交法、蛋白质印迹法(Western blotting)和免疫染色法。本文中当提到细胞、细胞系、细胞培养物或细胞群时使用的术语“分离的”是指自细胞天然来源实质上分离，由此能够在体外培养细胞、细胞系、细胞培养物或细胞群。此外，所用术语“分离”是指一组两个或两个以上细胞中一个或一个以上细胞的物理分离，其中所述细胞是根据例如细胞形态和/或标记物表达等所需特征选择。参照以下本发明的详细描述和其中包括的实例将更容易地了解本发明。然而，在揭示和描述本发明组合物和方法之前，应了解，本发明不局限于特定核酸、特定多肽、特定细胞类型、特定宿主细胞、特定条件或特定方法等，因此当然可发生变化，而且所属领域技术人员将易于了解其中的众多修改和变更。参看萨姆布鲁克(Sambrook)等人,1989,分子克隆(Molecular Cloning),第 2 版,冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory),纽约州普莱恩维尤(Plainview, New York);麦纳提斯(Maniatis)等人，1982,分子克隆，冷泉港实验室，纽约州普莱恩维尤；吴(编)1993，酶学方法(Meth. Enzymol.) 218，第I部分；吴(编)1979，酶学方法，68 ;吴等人(编)，1983，酶学方法，100和101 ;古斯曼(Grossman)和莫德维(Moldave)(编)1980，酶学方法，65 ;米勒(Miller)(编)1972，分子遗传学实验指南(Experiments in Molecular Genetics),冷泉港实验室，纽约州冷泉港(Cold Spring Harbor, New York);欧德(Old)和皮尔摩斯(Primrose), 1981,基因操作原理(Principles of Gene Manipulation),伯克利加州大学出版社(University ofCalifornia Press, Berkeley);斯奇雷夫(Schleif)和文新克(Wensink), 1982,分子生物学实践方法(Practical Methods in Molecular Biology);格鲁威尔(Glover)(编)1985,DNA克隆(DNA Cloning)第I卷和第II卷，IRL出版社，英国牛津(Oxford，UK);赫姆斯(Hames)和霍金斯(Higgins)(编)1985,核酸杂交(Nucleic Acid Hybridization), IRL 出版社，英国牛津；以及赛特罗(Setlow)和霍兰德(Hollaender) 1979，遗传工程原理和方法(Genetic Engineering !Principles and Methods),第 1-4 卷，纽约派拉蒙出版社(PlenumPress7New York)。最后，所采用的缩写和命名法被认为是所属领域中以及专业杂志(例如本文引用的专业杂志)中常用的标准缩写和命名法。本发明是基于申请人先前的观察结果可以使用含有高度纯化的生长因子的确定成分培养基组合物(例如培养基DC-HAIF)，在不存在分化的情况下支持多能干细胞扩增。本发明提供确定成分培养基，其包括影响对活力、生长、多能性和自我更新极为重要的信号转导路径的小分子有机化合物。通过筛选药物活性化合物库中降低hES细胞活力、生长或效力的化合物，已经鉴别出在这一点上极为重要的各种路径。根据已知作用将这些化合物归类。鉴别的路径包括很大一部分由神经递质受体介导的路径。具体说来，鉴别为对多能干细胞生长具有不利影响的许多化合物是已知的神经递质受体拮抗剂。本文中使用的“神经递质”或“内源神经递质”是指在突触前神经元的轴突末梢激发时释放并行进穿过突触间隙(synaptic cleft)以激发或抑制靶细胞(例如突触后神经元、树突状末梢(dendritic terminus))的一组物质中的任一种。神经递质包括小分子化合物(即，< 800道尔顿(Dalton))，例如单胺和氨基酸；以及较大物质，例如肽。常见的小分子神经递质包括去甲肾上腺素(正肾上腺素)
(4_[ (IR)-2-氨基-I-羟乙基]苯 _1，2_ 二醇)
OH
HO肾上腺素(epinephrine/adrenaline)((R)-4-(I-羟基-2-(甲基氨基)乙基)苯-I，2-二醇)
OH
HO乙酰胆碱(2-乙酰氧基-N，N，N-三甲基乙铵)
I /谷氨酸(2-氨基戊二酸)
OO
NH2多巴胺(4_(2_ 氛基乙基)苯-I, 2_ 二醇)[
权利要求
1.一种确定成分细胞培养基，其包含选自由神经递质受体的激动剂、拮抗剂、配体和调节剂组成的群组的化合物； 条件是，所述确定成分细胞培养基支持在不存在分化的情况下其中所 培养的人多能干细胞扩增。
2.根据权利要求I所述的确定成分细胞培养基，其中所述神经递质受体是肾上腺素能、多巴胺能、胆碱能、组胺能、谷氨酸能、血清素能或腺苷受体。
3.根据权利要求2所述的确定成分细胞培养基，其中所述神经递质受体是肾上腺素能受体。
4.根据权利要求2所述的确定成分细胞培养基，其中所述化合物是所述神经递质受体的激动剂。
5.根据权利要求4所述的确定成分细胞培养基，其中所述化合物选自由以下组成的群组去甲肾上腺素、乙酰胆碱、腺苷、多巴胺、其结构类似物、衍生物和生理学上可接受的盐。
6.根据权利要求5所述的确定成分细胞培养基，其中所述化合物选自由以下组成的群组去甲肾上腺素、乙酰胆碱、腺苷、其结构类似物、衍生物和生理学上可接受的盐。
7.根据权利要求6所述的确定成分细胞培养基，其中所述化合物是去甲肾上腺素或其结构类似物、衍生物或生理学上可接受的盐。
8.根据权利要求7所述的确定成分细胞培养基，其进一步包含选自由以下组成的群组的化合物乙酰胆碱、腺苷、其结构类似物、衍生物、生理学上可接受的盐和组合。
9.根据权利要求6所述的确定成分细胞培养基，其中所述化合物是乙酰胆碱或其结构类似物、衍生物或生理学上可接受的盐。
10.根据权利要求6所述的确定成分细胞培养基，其中所述化合物是腺苷或其结构类似物、衍生物或生理学上可接受的盐。
11.根据权利要求10所述的确定成分细胞培养基，其进一步包含GABA或其结构类似物、衍生物或生理学上可接受的盐。
12.根据权利要求4所述的确定成分细胞培养基，其中所述人多能干细胞是以较低初始细胞密度培养。
13.根据权利要求12所述的确定成分细胞培养基，其中所述化合物选自由以下组成的群组去甲肾上腺素、乙酰胆碱、其结构类似物、衍生物、生理学上可接受的盐和组合。
14.根据权利要求12所述的确定成分细胞培养基，其中所述化合物选自由以下组成的群组盐酸对氨基可乐定(p-aminoclonidine hydrochloride)、甲磺酸乙基异丙肾上腺素(isotharine mesylate)、盐酸异丙肾上腺素(isoproterenol hydrochloride)和5,-N-甲基甲酰胺基腺苷。
15.根据权利要求13所述的确定成分细胞培养基，其包含至少一种生长因子。
16.根据权利要求15所述的确定成分细胞培养基，其中所述生长因子选自由以下组成的群组ErbB3配体或其功能片段JGF-β家族成员或其功能片段；类胰岛素生长因子受体(IGF-IR)活化剂或其功能片段；和成纤维细胞生长因子(FGF)受体活化剂或其功能片段。
17.根据权利要求16所述的确定成分细胞培养基，其中所述培养基不含外源胰岛素、胰岛素代用品、类胰岛素作用剂和其功能片段。
18.根据权利要求16所述的确定成分细胞培养基，其中所述ErbB3配体选自由以下组成的群组神经调节蛋白-I、调蛋白(Heregulin)-P(HRG-P)、调蛋白-a(HRG_a)、Neu分化因子(NDF)、乙酰胆碱受体诱导活性(ARIA)、神经胶质生长因子2 (GGF2)、感觉和运动神经元源性因子(SMDF)、神经调节蛋白-2 ;表皮调节素(Epiregulin)、Biregulin和其功能片段。
19.根据权利要求16所述的确定成分细胞培养基，其中所述TGF-β家族成员选自由以下组成的群组Nodal、激活素Α、激活素B、TGF-β、骨形态发生蛋白-2 (ΒΜΡ2)、⑶F-8、⑶F-II和骨形态发生蛋白-4(ΒΜΡ4)。
20.根据权利要求16所述的确定成分细胞培养基，其中所述IGF-IR活化剂选自由以下组成的群组IGF-1、IGF-2、长型R3-IGF1和其功能片段。
21.根据权利要求16所述的确定成分细胞培养基，其中所述FGF受体活化剂选自由以下组成的群组FGF-2、FGF-7、FGF-10, FGF-22和其功能片段。
22.根据权利要求16所述的确定成分细胞培养基，其中所述培养基不含外源FGF受体 活化剂或其功能片段。
23.根据权利要求16所述的确定成分细胞培养基，其中所述至少一种生长因子选自由以下组成的群组ErbB3配体、类胰岛素生长因子、其功能片段和组合。
24.根据权利要求23所述的确定成分细胞培养基，其中所述培养基不含外源FGF受体活化剂、TGF-β家族成员和其功能片段。
25.根据权利要求24所述的确定成分细胞培养基，其中所述化合物是去甲肾上腺素或其结构类似物、衍生物或生理学上可接受的盐。
26.根据权利要求25所述的确定成分细胞培养基，其进一步包含选自由以下组成的群组的化合物腺苷、血清素和多巴胺、其结构类似物、衍生物、生理学上可接受的盐和组合。
27.根据权利要求4所述的确定成分细胞培养基，其中所述多能干细胞是以单细胞聚集体悬浮液形式培养。
28.根据权利要求27所述的确定成分细胞培养基，其中所述组合物支持处于实质上整倍体状态的所述多能干细胞扩增。
29.根据权利要求28所述的确定成分细胞培养基，其中所述化合物是去甲肾上腺素或其结构类似物、衍生物或生理学上可接受的盐。
30.根据权利要求29所述的确定成分细胞培养基，其包含至少一种生长因子。
31.根据权利要求30所述的确定成分细胞培养基，其中所述至少一种生长因子选自由以下组成的群组ErbB3配体或其功能片段JGF-β家族成员或其功能片段；类胰岛素生长因子受体(IGF-IR)活化剂或其功能片段；和其组合。
32.根据权利要求30所述的确定成分细胞培养基，其中所述培养基不含外源胰岛素、胰岛素代用品、类胰岛素作用剂和其功能片段。
33.根据权利要求4所述的确定成分细胞培养基，其中所述化合物包含去甲肾上腺素或其结构类似物、衍生物或生理学上可接受的盐；且所述人多能干细胞是以标准初始细胞密度培养。
34.根据权利要求33所述的确定成分细胞培养基，其包含至少一种生长因子。
35.根据权利要求34所述的确定成分细胞培养基，其中所述生长因子选自由以下组成的群组ErbB3配体JGF-β家族成员；类胰岛素生长因子受体(IGF-IR)活化剂；成纤维细胞生长因子(FGF)受体活化剂；其功能片段和组合。
36.根据权利要求35所述的确定成分细胞培养基，其中所述培养基不含外源FGF受体活化剂和其功能片段。
37.根据权利要求35所述的确定成分细胞培养基，其中所述培养基不含外源TGF-β家族成员和其功能片段。
38.根据权利要求35所述的确定成分细胞培养基，其中所述培养基不含外源ErbB3配体和其功能片段。
39.根据权利要求35所述的确定成分细胞培养基，其中所述培养基不含外源胰岛素、胰岛素代用品、类胰岛素作用剂和其功能片段。
40.根据权利要求35所述的确定成分细胞培养基，其中所述至少一种生长因子由以下 各物的组合组成类胰岛素生长因子受体(IGF-IR)活化剂或其功能片段；成纤维细胞生长因子(FGF)受体活化剂或其功能片段；和任选使用的ErbB3配体或其功能片段。
41.根据权利要求41所述的确定成分细胞培养基，其进一步包含头蛋白。
42.一种组合物，其包含 a)确定成分细胞培养基，其包含选自由神经递质受体的激动剂、拮抗剂、配体和调节剂组成的群组的化合物；和 b)人多能干细胞； 条件是，所述确定成分细胞培养基支持在不存在分化的情况下其中所培养的所述人多能干细胞扩增。
43.根据权利要求42所述的组合物，其中所述神经递质受体是肾上腺素能、多巴胺能、胆碱能、组胺能、谷氨酸能、血清素能或腺苷受体。
44.根据权利要求43所述的组合物，其中所述神经递质受体是肾上腺素能受体。
45.根据权利要求43所述的组合物，其中所述化合物是所述神经递质受体的激动剂。
46.根据权利要求45所述的组合物，其中所述化合物选自由以下组成的群组去甲肾上腺素、乙酰胆碱、腺苷、多巴胺、其结构类似物、衍生物和生理学上可接受的盐。
47.根据权利要求46所述的组合物，其中所述化合物选自由以下组成的群组去甲肾上腺素、乙酰胆碱、腺苷、其结构类似物、衍生物和生理学上可接受的盐。
48.根据权利要求47所述的组合物，其中所述化合物是去甲肾上腺素或其结构类似物、衍生物或生理学上可接受的盐。
49.根据权利要求48所述的组合物，其进一步包含选自由以下组成的群组的化合物乙酰胆碱、腺苷、其结构类似物、衍生物、生理学上可接受的盐和组合。
50.根据权利要求45所述的组合物，其中所述化合物是乙酰胆碱或其结构类似物、衍生物或生理学上可接受的盐。
51.根据权利要求45所述的组合物，其中所述化合物是腺苷或其结构类似物、衍生物或生理学上可接受的盐。
52.根据权利要求51所述的组合物，其进一步包含GABA或其结构类似物、衍生物或生理学上可接受的盐。
53.根据权利要求43所述的组合物，其中所述人多能干细胞是以较低初始细胞密度存在于所述确定成分细胞培养基中。
54.根据权利要求53所述的组合物，其中所述化合物选自由以下组成的群组去甲肾上腺素、乙酰胆碱、其结构类似物、衍生物、生理学上可接受的盐和组合。
55.根据权利要求53所述的组合物，其中所述化合物选自由以下组成的群组盐酸对氨基可乐定、甲磺酸乙基异丙肾上腺素、盐酸异丙肾上腺素和5' -N-甲基甲酰胺基腺苷。
56.根据权利要求54所述的组合物，其包含至少一种生长因子。
57.根据权利要求56所述的组合物，其中所述生长因子选自由以下组成的群组ErbB3配体或其功能片段JGF-β家族成员或其功能片段；类胰岛素生长因子受体(IGF-IR)活化剂或其功能片段；和成纤维细胞生长因子(FGF)受体活化剂或其功能片段。
58.根据权利要求57所述的组合物，其中所述确定成分细胞培养基不含外源胰岛素、胰岛素代用品、类胰岛素作用剂和其功能片段。
59.根据权利要求57所述的组合物，其中所述ErbB3配体选自由以下组成的群组神经调节蛋白-I、调蛋白-P(HRG-P)、调蛋白-a(HRG-a)、Neu分化因子(NDF)、乙酰胆碱受体 诱导活性(ARIA)、神经胶质生长因子2 (GGF2)、感觉和运动神经元源性因子(SMDF)、神经调节蛋白-2 ;表皮调节素、Biregulin和其功能片段。
60.根据权利要求57所述的组合物，其中所述TGF-β家族成员选自由以下组成的群组Nodal、激活素Α、激活素B、TGF-i3、骨形态发生蛋白-2(BMP2)、a)F-8、ffl)F-ll和骨形态发生蛋白-4(BMP4)。
61.根据权利要求57所述的组合物，其中所述IGF-IR活化剂选自由以下组成的群组IGF-U IGF-2、长型R3-IGF1和其功能片段。
62.根据权利要求57所述的组合物，其中所述FGF受体活化剂选自由以下组成的群组FGF-2、FGF-7、FGF-10, FGF-22 和其功能片段。
63.根据权利要求57所述的组合物，其中所述确定成分细胞培养基不含外源FGF受体活化剂或其功能片段。
64.根据权利要求57所述的组合物，其中所述至少一种生长因子选自由以下组成的群组ErbB3配体、类胰岛素生长因子、其功能片段和组合。
65.根据权利要求64所述的组合物，其中所述确定成分细胞培养基不含外源FGF受体活化剂、TGF- β家族成员和其功能片段。
66.根据权利要求65所述的组合物，其中所述化合物是去甲肾上腺素或其结构类似物、衍生物或生理学上可接受的盐。
67.根据权利要求65所述的组合物，其进一步包含选自由以下组成的群组的化合物腺苷、血清素和多巴胺、其结构类似物、衍生物、生理学上可接受的盐和组合。
68.根据权利要求45所述的组合物，其中所述人多能干细胞是以单细胞聚集体悬浮液形式培养。
69.根据权利要求68所述的组合物，其中所述人多能干细胞实质上为整倍体。
70.根据权利要求69所述的组合物，其中所述化合物是去甲肾上腺素或其结构类似物、衍生物或生理学上可接受的盐。
71.根据权利要求70所述的组合物，其包含至少一种生长因子。
72.根据权利要求71所述的组合物，其中所述至少一种生长因子选自由以下组成的群组ErbB3配体或其功能片段JGF-β家族成员或其功能片段；类胰岛素生长因子受体(IGF-IR)活化剂或其功能片段；和其组合。
73.根据权利要求71所述的组合物，其中所述培养基不含外源胰岛素、胰岛素代用品、类胰岛素作用剂和其功能片段。
74.根据权利要求45所述的组合物，其中所述化合物包含去甲肾上腺素或其结构类似物、衍生物或生理学上可接受的盐；且所述人多能干细胞是以标准初始细胞密度培养。
75.根据权利要求74所述的组合物，其包含至少一种生长因子。
76.根据权利要求75所述的组合物，其中所述生长因子选自由以下组成的群组ErbB3配体JGF-β家族成员；类胰岛素生长因子受体(IGF-IR)活化剂；成纤维细胞生长因子(FGF)受体活化剂；其功能片段和组合。
77.根据权利要求76所述的组合物，其中所述确定成分细胞培养基不含外源FGF受体 活化剂和其功能片段。
78.根据权利要求76所述的组合物，其中所述确定成分细胞培养基不含外源TGF-β家族成员和其功能片段。
79.根据权利要求76所述的组合物，其中所述确定成分细胞培养基不含外源ErbB3配体和其功能片段。
80.根据权利要求76所述的组合物，其中所述确定成分细胞培养基不含外源胰岛素、胰岛素代用品、类胰岛素作用剂和其功能片段。
81.根据权利要求76所述的组合物，其中所述至少一种生长因子由以下各物的组合组成类胰岛素生长因子受体(IGF-IR)活化剂或其功能片段；成纤维细胞生长因子(FGF)受体活化剂或其功能片段；和任选使用的ErbB3配体或其功能片段。
82.根据权利要求81所述的组合物，其进一步包含头蛋白。
83.一种用于扩增人多能干细胞的方法，其包含在确定成分细胞培养基中培育所述人多能干细胞，所述确定成分细胞培养基包含选自由以下组成的群组的化合物神经递质受体的激动剂、拮抗剂、配体和调节剂；其中所述细胞在所述培育期间分裂但不。
84.根据权利要求83所述的方法，其中所述神经递质受体是肾上腺素能、多巴胺能、胆碱能、组胺能、谷氨酸能、血清素能或腺苷受体。
85.根据权利要求84所述的方法，其中所述神经递质受体是肾上腺素能受体。
86.根据权利要求84所述的方法，其中所述化合物是所述神经递质受体的激动剂。
87.根据权利要求86所述的方法，其中所述化合物选自由以下组成的群组去甲肾上腺素、乙酰胆碱、腺苷、多巴胺、其结构类似物、衍生物和生理学上可接受的盐。
88.根据权利要求87所述的方法，其中所述化合物选自由以下组成的群组去甲肾上腺素、乙酰胆碱、腺苷、其结构类似物、衍生物和生理学上可接受的盐。
89.根据权利要求88所述的方法，其中所述化合物是去甲肾上腺素或其结构类似物、衍生物或生理学上可接受的盐。
90.根据权利要求89所述的方法，其中所述培养基包含选自由以下组成的群组的化合物乙酰胆碱、腺苷、其结构类似物、衍生物、生理学上可接受的盐和组合。
91.根据权利要求88所述的方法，其中所述化合物是乙酰胆碱或其结构类似物、衍生物或生理学上可接受的盐。
92.根据权利要求88所述的方法，其中所述化合物是腺苷或其结构类似物、衍生物或生理学上可接受的盐。
93.根据权利要求92所述的方法，其中所述培养基包含GABA或其结构类似物、衍生物或生理学上可接受的盐。
94.根据权利要求86所述的方法，其中所述人多能干细胞是以较低初始细胞密度培养。
95.根据权利要求94所述的方法，其中所述化合物选自由以下组成的群组去甲肾上腺素、乙酰胆碱、其结构类似物、衍生物、生理学上可接受的盐和组合。
96.根据权利要求94所述的方法，其中所述化合物选自由以下组成的群组盐酸对氨基可乐定、甲磺酸乙基异丙肾上腺素、盐酸异丙肾上腺素和5' -N-甲基甲酰胺基腺苷。
97.根据权利要求95所述的方法，其中所述培养基包含至少一种生长因子。
98.根据权利要求97所述的方法，其中所述生长因子选自由以下组成的群组ErbB3配体或其功能片段JGF-β家族成员或其功能片段；类胰岛素生长因子受体(IGF-IR)活化剂或其功能片段；和成纤维细胞生长因子(FGF)受体活化剂或其功能片段。
99.根据权利要求98所述的方法，其中所述培养基不含外源胰岛素、胰岛素代用品、类胰岛素作用剂和其功能片段。
100.根据权利要求98所述的方法，其中所述ErbB3配体选自由以下组成的群组神经调节蛋白-I、调蛋白-P(HRG-P)、调蛋白-a(HRG-a)、Neu分化因子(NDF)、乙酰胆碱受体诱导活性(ARIA)、神经胶质生长因子2 (GGF2)、感觉和运动神经元源性因子(SMDF)、神经调节蛋白-2 ;表皮调节素、Biregulin和其功能片段。
101.根据权利要求98所述的方法，其中所述TGF-β家族成员选自由以下组成的群组Nodal、激活素A、激活素B、TGF-β、骨形态发生蛋白-2 (ΒΜΡ2)、⑶F-8、⑶F-II和骨形态发生蛋白-4 (ΒΜΡ4) ο
102.根据权利要求98所述的方法，其中所述IGF-IR活化剂选自由以下组成的群组IGF-U IGF-2、长型R3-IGF1和其功能片段。
103.根据权利要求98所述的方法，其中所述FGF受体活化剂选自由以下组成的群组FGF-2、FGF-7、FGF-10, FGF-22 和其功能片段。
104.根据权利要求98所述的方法，其中所述培养基不含外源FGF受体活化剂或其功能片段。
105.根据权利要求98所述的方法，其中所述至少一种生长因子选自由以下组成的群组ErbB3配体、类胰岛素生长因子、其功能片段和组合。
106.根据权利要求105所述的方法，其中所述培养基不含外源FGF受体活化剂、TGF-β家族成员和其功能片段。
107.根据权利要求106所述的方法，其中所述化合物是去甲肾上腺素或其结构类似物、衍生物或生理学上可接受的盐。
108.根据权利要求107所述的方法，其中所述培养基进一步包含选自由以下组成的群组的化合物腺苷、血清素和多巴胺、其结构类似物、衍生物、生理学上可接受的盐和组合。
109.根据权利要求86所述的方法，其中所述人多能干细胞是以单细胞聚集体悬浮液形式培养。
110.根据权利要求109所述的方法，其中所述人多能干细胞实质上为整倍体。
111.根据权利要求110所述的方法，其中所述化合物是去甲肾上腺素或其结构类似物、衍生物或生理学上可接受的盐。
112.根据权利要求111所述的方法，其中所述培养基包含至少一种生长因子。
113.根据权利要求112所述的方法，其中所述至少一种生长因子选自由以下组成的群组ErbB3配体或其功能片段JGF-β家族成员或其功能片段；类胰岛素生长因子受体(IGF-IR)活化剂或其功能片段；和其组合。
114.根据权利要求112所述的方法，其中所述培养基不含外源胰岛素、胰岛素代用品、类胰岛素作用剂和其功能片段。
115.根据权利要求86所述的方法，其中所述化合物包含去甲肾上腺素或其结构类似物、衍生物或生理学上可接受的盐；且所述人多能干细胞是以标准初始细胞密度培养。
116.根据权利要求115所述的方法，其中所述培养基包含至少一种生长因子。
117.根据权利要求116所述的方法，其中所述生长因子选自由以下组成的群组ErbB3配体JGF-β家族成员；类胰岛素生长因子受体(IGF-IR)活化剂；成纤维细胞生长因子(FGF)受体活化剂；其功能片段和组合。
118.根据权利要求117所述的方法，其中所述培养基不含外源FGF受体活化剂和其功能片段。
119.根据权利要求117所述的方法，其中所述培养基不含外源TGF-β家族成员和其功能片段。
120.根据权利要求117所述的方法，其中所述培养基不含外源ErbB3配体和其功能片段。
121.根据权利要求117所述的方法，其中所述培养基不含外源胰岛素、胰岛素代用品、类胰岛素作用剂和其功能片段。
122.根据权利要求117所述的方法，其中所述至少一种生长因子由以下各物的组合组成类胰岛素生长因子受体(IGF-IR)活化剂或其功能片段；成纤维细胞生长因子(FGF)受体活化剂或其功能片段；和任选使用的ErbB3配体或其功能片段。
123.根据权利要求122所述的方法，其中所述培养基进一步包含头蛋白。
全文摘要
本发明涉及用于保持未分化的多能干细胞培养物的组合物和方法。
文档编号C12N5/02GK102741396SQ201080018473
公开日2012年10月17日 申请日期2010年4月27日 优先权日2009年4月27日
发明者托马斯C·舒尔茨, 艾伦J·罗宾斯 申请人:威盛细胞有限公司