作为ssl替代品的烘焙酶组合物的制作方法

专利名称：：作为ssl替代品的烘焙酶组合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及新烘焙酶组合物、通过使用所述组合物生产的面团和由此获得的烘焙产品。本发明还涉及新烘焙酶组合物的用途，以在面团或由此获得的烘焙产品的生产中替代SSL或CSL。
背景技术：
：为改进面团的处理性质和/或烘焙产品的最终性质，人们进行连续的努力来开发具有改进性质的加工助剂。加工助剂在本文中被定义为改进面团的处理性质和/或烘焙产品的最终性质的化合物。可被改进的面团性质包括稳定性、可加工性、气体保留能力、减小的粘性、弹性、延展性、成型性等等。可被改进的烘焙产品的性质包括条块(loaf)体积、面包皮脆性、减少起泡、碎屑结构、碎屑柔软性、风味、相关的陈化(Staleness)和保质期。改进这些面团和/或烘焙产品的加工助剂可被分为两组化学添加剂和酶(也被称为烘焙酶)。具有改进性质的化学添加剂包括氧化剂(例如抗坏血酸、溴酸盐和偶氮二碳酸盐)、还原剂(例如L-半胱氨酸和谷胱甘肽)、作为面团调节剂(例如双乙酰酒石酸单甘油酯/二甘油酯(DATEM)、硬脂酰乳酸钠(SSL)或硬脂酰乳酸钙(CSL))或作为碎屑软化剂(例如甘油一硬脂酸酯(GMS)等等)的乳化剂、脂肪物质(例如甘油三酯(脂肪)或卵磷脂)和其他添加剂。在烘焙工业中应用的乳化剂可被粗略分为碎屑软化剂和面团强化剂。蒸馏单甘油酯主要被用于碎屑软化。单甘油酯与淀粉的复合防止淀粉完全再结晶，所述复合导致烘焙产品的初始碎屑柔软和/或保质期期间碎屑固化速率降低。对于面团强化，应用一些不同的合成的极性脂质类似物，例如DATEM、CSL和SSL。它们在面包制造中的作用主要是改进面团稳定性。其他面团特征(例如减小的面团粘性、改进的面团可加工性)和改进的烘焙产品特征(例如增大的条块体积、改进的碎屑结构、改进的碎屑柔软性和保质期)以及改进的面包皮脆性也可得到。DATEM主要在硬皮、条块型面包中用作化学乳化剂，而SSL或CSL则在软面包(例如模制面包、三明治面包和软卷面包(softrollbun))中发现其主要应用。由于使用更为天然的产品来替代化学添加剂的消费者驱使的需要，正在开发取决于特定的烘焙应用情况而具有改进面团和/或烘焙产品性质的若干烘焙酶。消费者对化学添加剂的抵制不断增强，并因而有使用消费者友好的添加剂和/或酶替代乳化剂的持久需要，所述添加剂和/或酶被认为是加工助剂。但是，当省略乳化剂时，面包质量被大大降低，例如，对于没有使用乳化剂(比如SSL或单甘油酯)的非硬皮型面包(例如三明治面包)而言，难以实现3到5天的保质期。对面包陈化的研究已表明，在储存期间面包中的淀粉部分再结晶，因而引起碎屑硬度增加。淀粉酶和半纤维素酶被广泛用在面包改进剂中，以改进碎屑柔软性和条块体积。α-淀粉酶增加碎屑柔软性并在烘焙期间部分降解淀粉部分。半纤维素酶分解小麦面粉的半纤维素部分，因而释放出通常与面粉部分结合在一起的水进入面团中。在面包改进剂中使用半纤维素酶导致在烘焙期间面团的烘烤膨胀性(ovenspring)改进，烘焙的焙烤产品的条块体积、细粒结构改进和更好的保持烘焙的焙烤产品的特性。但是，由淀粉酶和半纤维素酶赋予的组合的改进是有限的，并因而仍需要乳化剂——为了获得可接受的面包特性的保持。DeMaria等人在Appl.Microbiol.Biotechnol.Q007)74:290-300中描述了可用在烘焙工业中的磷脂酶，特别用来在烘焙产品的生产中部分或全部替代乳化剂例如DATEM、SL或SSL。W002/03805描述了具有不同底物特异性的两种脂肪分解酶的组合对面团或从面团制得的烘焙产品产生协同作用并产生了具有改进的体积的烘焙产品和/或在烘焙期间具有更好的形状保持的烘焙产品。EP0585988描述了一种面包改进剂组合物，其包含脂肪酶、半纤维素酶和淀粉酶，所述组合物优选与起酥油组合。所述酶制剂和优选地起酥油的组合可替代乳化剂，比如SSL和单甘油酯。由于在烘焙产品制造中减少使用化学乳化剂(例如SSL或CSL)的新动力，对可在烘焙工艺中替代这些化学乳化剂的备选或改进的烘焙酶组合物有需要。本发明的目标是提供新烘焙酶组合物，其可在面团和因此产生的烘焙产品的生产中部分或全部替代乳化剂特别是SSL或CSL。
发明内容在本发明的第一方面中，公开了包含脂肪分解酶的烘焙酶组合物，所述脂肪分解酶是经分离的多肽，所述多肽包含(a)从根据SEQIDNO2的氨基酸序列得到的成熟多肽的氨基酸序列；或该成熟多肽的功能等同物的氨基酸序列，所述功能等同物具有与根据SEQIDNO:2的氨基酸序列中的成熟多肽至少60、70、80或90%同源的氨基酸序列；或(b)由多核苷酸编码的氨基酸序列，所述多核苷酸包含(a)如在SEQIDNO=I中展示的核苷酸序列；或核苷酸序列功能等同物，其与SEQIDNO1的核苷酸序列具有至少60、70、80或90%的同源性；或(b)核苷酸序列，其与是SEQIDNO1的互补体的多核苷酸杂交，并且其中所述核苷酸序列与SEQIDNO1的核苷酸序列至少60、70、80或90%同源；或(c)核苷酸序列，其编码从根据SEQIDNO:2的氨基酸序列得到的成熟多肽或多肽功能等同物，所述多肽功能等同物与从SEQIDNO:2的氨基酸序列得到的成熟多肽具有至少60、70、80或90%同源性；或(d)作为遗传密码简并的结果，与如在(a)、(b)、(c)的任一中定义的序列简并的序列；或(e)核苷酸序列，其是如在(a)、(b)、(c)或(d)中定义的核苷酸序列的互补体；并且其中组合物还包含三酰基甘油脂肪酶，优选地从lihizopusoryzae得到的脂肪酶。该烘焙酶组合物还可包含纤维素酶或半纤维素酶，和淀粉葡糖苷酶或这些酶的一种或多种的混合物。根据本发明的烘焙组合物还可包含一种或多种其他酶、一种或多种面团改进添加剂和/或面包改进添加剂。在第二方面中，本发明提供了包含根据本发明的第一方面的烘焙酶、面粉和一种或多种面团添加剂或面包添加剂的预混合物。在另一方面中，本发明提供了包含面粉、水、酵母和根据本发明的烘焙酶组合物或预混合物的面团。已令人吃惊地发现，包含根据本发明的烘焙酶组合物的面团具有优异的稳定性、免遭机械损伤的抗冲击性和其他性质例如良好的延展性和低粘性。根据本发明的烘焙组合物的使用消除了面粉可变性的影响，其通过自动缓冲由于季节变化面粉中的不同脂质状况的变化来实现。在第四方面中，本发明提供了通过烘焙根据本发明的面团可获得的烘焙产品。还已令人吃惊地发现，根据本发明的烘焙产品可具有改进的体积和非常良好的碎屑结构(特别是精细的碎屑结构)、碎屑柔软性并因而延长的保质期。在另一方面中，本发明提供了生产根据本发明的面团和烘焙产品的方法。本发明还提供了在面团或因此得到的烘焙产品的生产中使用根据本发明的烘焙酶组合物或预混合物来替代乳化剂的用途，优选替代SSL或CSL的用途。省略SSL和/或CSL形成预混合物，导致在烘焙产品生产期间成分的处理和储存工作量减少并允许花费减少，这是由于本发明的烘焙组合物可以远低于SSL或CSL的剂量使用。发明详述因而，在本发明的第一方面中，公开了包含脂肪分解酶(下文表示为根据本发明的脂解酶)的烘焙组合物，所述脂肪分解酶是经分离的多肽，所述经分离的多肽包含(a)从根据SEQIDNO2的氨基酸序列得到的成熟多肽的氨基酸序列；或该成熟多肽的功能等同物的氨基酸序列，所述功能等同物具有与根据SEQIDNO:2的氨基酸序列中的成熟多肽至少60、70、80或90%同源的氨基酸序列；或(b)由多核苷酸编码的氨基酸序列，所述多核苷酸包含(a)如在SEQIDNO=I中展示的核苷酸序列；或核苷酸序列功能等同物，其与SEQIDNO1的核苷酸序列具有至少60、70、80或90%的同源性；或(b)核苷酸序列，其与是SEQIDNO1的互补体的多核苷酸杂交，并且其中所述核苷酸序列与SEQIDNO1的核苷酸序列至少60、70、80或90%同源；或(c)核苷酸序列，其编码从根据SEQIDNO:2的氨基酸序列得到的成熟多肽或多肽功能等同物，所述多肽功能等同物与从SEQIDNO:2的氨基酸序列得到的成熟多肽具有至少60、70、80或90%同源性；或(d)作为遗传密码简并的结果，与如在(a)、(b)、(c)的任一中定义的序列简并的序列；或(e)核苷酸序列，其是如在(a)、(b)、(c)或(d)中定义的核苷酸序列的互补体；并且其中该组合物还包含三酰基甘油脂肪酶，优选地得自Miizopusoryzae的三酰基甘油脂肪酶。在烘焙酶组合物中使用的根据本发明的脂肪分解酶可在焙烤应用中对若干类型的脂起作用，所述脂范围为甘油酯(例如甘油三酯)、磷脂和糖脂(例如半乳糖脂)。优选地，在焙烤应用中例如在面团条件下，根据本发明的脂肪分解酶具有对甘油三酯、磷脂和半乳糖脂的脂肪分解活性。该脂肪分解酶被与SEQIDNO=I的核苷酸序列具有至少60%，优选至少70%，更优选至少80%或最优选90%同源性的核苷酸序列所编码；或者该脂肪分解酶是从根据SEQIDNO:2的氨基酸序列得到的成熟多肽或与从SEQIDNO:2的氨基酸序列得到的成熟多肽具有至少60%，优选至少70%，更优选至少80%或最优选至少90%同源性的成熟多肽功能等同物。将被用在本发明的烘焙组合物中的优选脂肪分解酶是对应于从根据SEQIDNO2(表示为L01)的氨基酸序列得到的成熟多肽的脂肪分解酶，即在SEQIDNO:2中的氨基酸34-304，并且所述氨基酸序列被SEQIDNO=I的核苷酸序列所编码。更具体地，当在面团中现场使用时，用在根据本发明的烘焙酶组合物中的脂肪分解酶显示了至少一种下述性质，优选地所有下述性质对非极性脂质的相对低的活性。对极性二酰基脂质(例如二酰基半乳糖脂和/或二酰基磷脂)的相对高的活性。对极性单酰基化合物(例如溶血半乳糖脂(lysogalactolipid)和溶血磷脂)的相对低的活性。当在面团中用作化学乳化剂的替代品时，这些意想不到的性质都被发现是极其有益的。甘油酯是甘油和脂肪酸的酯。甘油三酯(也称为三酰基甘油或三酰基甘油酯)主要在植物油和动物脂肪中存在。脂肪酶(也称为三酰基甘油脂肪酶)(EC3.1.1.3)在本文中被定义为这样的酶，其水解在甘油三酯中存在的一种或多种脂肪酸，更具体地，它们水解脂肪酸和甘油部分的羟基之间的酯键。糖脂(例如半乳糖脂)由甘油骨架组成，具有在外部(sn-Ι)和中间(sn-2)位置中的两个酯化的脂肪酸，而第三个羟基与糖残基(例如半乳糖脂的情况下为半乳糖)结合，所述糖脂例如单半乳糖甘油二酯(MGDG)或双半乳糖甘油二酯(DGDG)。半乳糖脂酶(EC3.1.1.26)分别催化来自半乳糖甘油二酯的在sn-Ι和sn-2位置中的一个或两个脂肪酰基的水解。磷脂由甘油骨架组成，具有在外部(sn-Ι)和中间(sn-2)位置中的两个酯化的脂肪酸，而甘油的第三个羟基被磷酸酯化。磷酸可依次被酯化为例如氨基醇比如乙醇胺(磷脂酰乙醇胺)、胆碱(磷脂酰胆碱)。磷脂酶在本文中被定义为参与在磷脂中的一个或多个键的水解的酶。若干类型的磷脂酶活性可被区分，所述磷脂酶水解将脂肪酰基部分连接到甘油骨架上的酯键磷脂酶Al(EC3.1.1.32)和A2(EC3.1.1.4)分别催化来自二酰基甘油磷脂的在sn-Ι和sn-2位置中的一个脂肪酰基脱酰，以产生溶血磷脂。这对于乳化剂替代品而言是期望的活性。參溶血憐月旨Sl(EC3.1.1.5-也被NomenclatureCommitteeoftheInternationalUnionofBiochemistryandMolecularBiology(EnzymeNomenclature,AcademicPress,NewYork,1992)称为磷脂酶B)催化在溶血磷脂中的剩余脂肪酰基的水角军。磷月旨酶B已从Penicilliumnotatum(Saitoetal.,1991,MethodsinEnzymology197:446-456)中报道，其催化来自二酰基甘油磷脂的两种脂肪酸都脱酰并且本质上具有溶血磷脂酶活性。就乳化剂替代而言，较不期望溶血磷脂酶活性，因为其会导致极性头和非极性尾的结合删除，使产生的产物失去影响表面性质的能力。令人吃惊地显示，根据本发明的脂肪分解酶在面团中显示相对低的溶血磷脂酶活性。对甘油三酯、磷脂和半乳糖脂有活性的根据本发明的脂解酶可如此用来在面团中替代乳化剂，优选替代SSL和/或CSL。相对于其中未被掺进多肽的面团或烘焙产品，当脂肪分解酶被以有效量被掺进面团中时，对甘油三酯、磷脂和半乳糖脂有活性的脂肪分解酶可改进面团或因此获得的烘焙产品的一种或多种性质。术语“改进的性质”在本文中被定义为面团和/或从面团获得的产品(特别是烘焙产品)的任何性质，所述性质相对于未被掺进根据本发明的脂肪分解酶或组合物的面团或产品而言，被根据本发明的脂肪分解酶的作用改进或被根据本发明的烘焙酶组合物改进。改进的性质可包括但不限于，增加的面团强度、增加的面团弹性、增加的面团稳定性和增加的面团抗冲击性、减小的面团粘性、改进的面团延展性、改进的面团可加工性、增加的烘焙产品体积、改进的烘焙产品风味、改进的烘焙产品碎屑结构、改进的烘焙产品的碎屑柔软性，减少的烘焙产品起泡和/或改进的烘焙产品的抗陈化性。根据下述的本发明的方法，可将添加和不添加本发明的脂肪分解酶或烘焙酶组合物而制备的面团和/或烘焙产品进行对比来测定改进的性质。感官特性可使用在烘焙工业中明确的流程进行评价，并可包括例如使用一组受过训练的味道测验人员。术语“增加的面团强度”在本文中被定义为一般具有更有弹性的面团性质和/或需要更多的劳动输入来制模并成型的面团性质。术语“增加的面团弹性”在本文中被定义为面团在经受某些物理张力之后，恢复其原始形状的更高趋势的面团性质。术语“增加的面团稳定性”在本文中被定义为对机械损伤更不敏感因而更好地保持其形状和体积的面团性质，其通过正常和/或延长醒发试验后的条块的截面的高度宽度的比率来评价。术语“减小的面团粘性”在本文中被定义为具有更小的与表面(例如在面团生产机器中)粘附的趋势的面团性质，并如本领域所已知的，由熟练的测试烘焙者根据经验评价或通过使用质地分析仪(例如TAXD)测量。术语“改进的面团延展性”在本文中被定义为可经受增加的张力或拉伸而不会破裂的面团性质。术语“改进的面团可加工性”在本文中被定义为一般更不粘和/或更坚实和/或更有弹性的面团性质。术语“增加的面团抗冲击性”在本文中被定义为在经历机械冲击后保持其形状和体积的面团性质。其通过测定获得自经冲击的面团的烘焙产品与获得自没有经历机械冲击的同一面团的烘焙产品相比较的体积变化百分比来评价。如果较之由没经冲击的同一面团获得的烘焙产品，当由冲击的面团获得烘焙产品的体积损失尽可能的小或没有损失时，面团是充分稳定的。面团可通过为本领域技术人员已知的方法冲击，例如用在实验部分中报道的方法。术语“改进的烘焙产品的体积”是如下测量的使用如本领域中已知的超声或激光检测法，通过自动面包体积分析仪(例如BVM-3，TexVolInstrumentsAB,Viken,Sweden)测定给定面包条块的体积。术语“减少的烘焙产品的起泡”在本文中被定义为在烘焙面包的面包皮上的起泡可视测定减少。术语“改进的烘焙产品的碎屑结构”在本文中被定义为在碎屑中具有更细小的气囊(cell)和/或更薄的气囊壁和/或在碎屑中具有更均勻/均一的气囊分布的烘焙产品性质，并且如本领域中已知的，其由烘焙者或通过数字图像分析(例如C-cell，CalibreControlInternationalLtd，Appleton，Warrington，UK)可视评价。术语“改进的烘焙产品的柔软性”是“硬度”的反义词，并且其在本文中被定义为更容易压缩的烘焙产品性质，并且如本领域中已知的，其由有技术的测试烘焙者根据经验评价或通过使用质地分析仪(例如来自MableMicroSystemsLtd,surrey,UK的TAXT2或TA-XTPlus)测量。术语“改进的烘焙产品风味”是通过经过训练的测试组评价。术语“改进的烘焙产品的抗陈化性”在本文中被定义为在储存期间烘焙产品具有特性参数(例如柔软性和/或弹性)劣化速率降低的性质。术语“改进的脆性”在本文中被定义为这样的烘焙产品性质如本领域中已知的，给出比参照产品更脆的感觉，以及比参照产品保持更长时间的该更脆感受。可使用例如质地分析仪TA-XTPlus(StableMicroSystemsLtd,Surrey，UK)，通过在压缩实验中测量在固定速度下的力对距离的曲线并从该压缩曲线中获得物理参数来量化该性质，所述参数即(i)第一个峰的力，(ii)第一个峰的距离，(iii)初始斜率，(iv)最高峰的力，(ν)曲线图下的面积和(vi)断裂事件(力降大于某一预定值)的数量。改进脆性的指征是第一个峰的更大的力、第一个峰的更短的距离、更高的初始斜率、最高峰的更大的力、曲线图下的更大的面积和断裂事件的更多的数目。较之参照产品，更脆的产品应在这些参数的至少两个上统计学上显著更好的得分。在本领域中，“脆性”还指脆、松脆(crimchiness)或硬皮(crustiness)，表示具有脆的、松脆的或硬皮的断裂行为的材料。当对甘油酯、磷脂和半乳糖脂有活性的根据本发明的脂肪分解酶被以有效量如此掺进面团中时，面团的若干性质(例如面团的强度)和因此获得烘焙产品的若干性质(例如面包体积)可被改进。但是这些改进可能不是完全充分地，特别是当烘焙产品是软的、非硬皮类型例如模制面包或三明治面包、卷面包(rolls)、圆面包(buns)例如汉堡包圆面包或酵母发酵的圈饼时。因而，SSL或CSL仍需要作为成分被添加至面包，以获得期望的面团特征和烘焙产品特征。已令人吃惊地发现，当三酰基甘油脂肪酶和根据本发明的脂肪分解酶被以有效量添加至用来生产烘焙产品(例如模制面包)的面团时，可获得有良好强度、改进的稳定性和可加工性的面团，而相应的烘焙产品可显示改进的面包体积和细小的碎屑结构。包含有效量的三酰基甘油脂肪酶和根据本发明的脂肪分解酶的面团可具有稳定性质，所述性质类似于其中被掺进SSL或CSL的那些面团。三酰基甘油脂肪酶优选地是真菌脂肪酶，优选地得自lihizopus、Aspergillus、Candida、Penicillum、Thermomyces或Rhizomucor。更优选地，使用得自Rhyzopus的三酉先基甘油脂肪酶，更优选地，使用得自Miyzopusoryzae的三酰基甘油脂肪酶。任选地，可使CN102549150A用两种或多种三酰基甘油脂肪酶的组合。因而，在本发明的另一实施方式中，根据本发明的烘焙酶组合物还包含两种或多种三酰基甘油脂肪酶的组合。在本发明的优选实施方式中，根据本发明的烘焙酶组合物还包含半纤维素酶或纤维素酶，优选包含纤维素酶。任选地，可使用两种或多种半纤维素酶的组合和/或两种或多种纤维素酶的组合和/或一种或多种半纤维素酶与一种或多种纤维素酶的组合。令人吃惊地发现，相对于包含三酰基甘油脂肪酶和根据本发明的脂肪分解酶而没有半纤维素酶或纤维素酶的面团而言，当包含三酰基甘油脂肪酶、半纤维素酶或纤维素酶(优选地纤维素酶)和根据本发明的脂肪分解酶的烘焙组合物被以有效量添加至用来生产烘焙产品(例如模制面包、三明治面包、圆面包例如汉堡包圆面包、卷面包和酵母发酵的圈饼)的面团时，面团和从面团获得的烘焙产品的性质可被进一步改进。特别可获得进一步改进的体积和/或更细小的碎屑结构和/或碎屑柔软性。特别地，使用得自A.niger或得自Trichodermareesei的纤维素酶可获得好的结^ο在本发明的甚至更优选的实施方式中，根据本发明的烘焙酶组合物还包含淀粉葡糖苷酶，优选地，得自Aspergillus(例如得自A.oryzae或A.niger)的淀粉葡糖苷酶，更优选地得自A.niger的淀粉葡糖苷酶。令人吃惊地，相对于包含三酰基甘油脂肪酶、半纤维素酶或纤维素酶和根据本发明的脂肪分解酶而没有淀粉葡糖苷酶的面团而言，当包含三酰基甘油脂肪酶、半纤维素酶或纤维素酶(优选地纤维素酶)、淀粉葡糖苷酶和根据本发明的脂肪分解酶的烘焙酶组合物被以有效量掺进面团时，面团和因此获得的烘焙产品的特性可被进一步改进。产生的面团可具有优越特性例如改进的稳定性和/或增大的抗冲击性，改进的可加工性、良好蓬松性并且相应的产品可具有极好的体积、细小碎屑结构和/或碎屑柔软性，并且因而其可具有延长的保质期。这些改进允许在面团中完全替换SSL或CSL。根据本发明的烘焙酶组合物还可包含额外的酶和/或面团添加剂和/或面包添加剂。额外的酶可以是任何来源，包括哺乳动物和植物，并且优选地是微生物(细菌、酵母或真菌)来源，并可通过本领域中常规使用的技术获得。额外的酶可以是淀粉酶(例如α-淀粉酶(用于通过酵母可发酵地提供糖并延缓陈化)、β-淀粉酶、生麦芽糖淀粉酶或非生麦芽糖淀粉酶)、环糊精葡萄糖基转移酶、蛋白酶、肽酶特别是外肽酶(在风味增强中有用)、转谷氨酰胺酶、半乳糖脂酶、磷脂酶、半纤维素酶(例如特别是戊聚糖酶，例如木糖酶(用于戊聚糖，更具体地阿拉伯木聚糖的部分水解，其增加面团的延展性))、蛋白酶(用于麸质弱化，特别是使用硬面粉时)、蛋白二硫化异构酶(例如在WO95/00636中公开的蛋白二硫化异构酶)、糖基转移酶、过氧化物酶(用于改进面团稠度)、漆酶或氧化酶、己糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶)、醛糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、脂氧合酶或L-氨基酸氧化酶(在改进面团稠度中有用)。当根据本发明的烘焙组合物还包含生麦芽糖淀粉酶(maltogenicamylase)时，将组合物添加至面团导致因此获得的烘焙产品具有改进的碎屑柔软性并因而提高保质期。在面团和面包制造中，根据本发明的烘焙酶组合物可与其他面包或面团成分或添加剂结合使用，所述面包或面团成分或添加剂例如盐、化学加工助剂比如氧化剂(例如抗坏血酸)、还原剂(例如L-半胱氨酸)和/或乳化剂(例如DATEM、SSL和/或CSL)和/或酶加工助剂例如氧化还原酶(例如葡糖氧化酶)、多糖修饰酶(例如α-淀粉酶、半纤维素酶、支链酶等等)和/或蛋白修饰酶(内切蛋白酶、外切蛋白酶、支链酶等等)。优选地，用来制造烘焙产品或面团的添加剂不包含SSL和/或CSL，更优选地，它们不包含选自SSL、CSL、DATEM、GMS的乳化剂，更优选地不包含乳化剂。在第二方面中，本发明提供了包含面粉、一种或多种如本文前文所述的面包或面团添加剂和根据本发明的烘焙酶组合物的预混合物。术语“预混合物”在本文中具有以其常规意思所理解的定义，即烘焙剂的混合物，所述混合物通常包括面粉，其不仅可被用在工业面包烘焙车间/设备中，还被用在零售面包店中。可通过将本发明的烘焙酶组合物与合适的载体例如面粉、淀粉、糖、复合糖(例如麦芽糊精)或盐混合来制备预混合物。预混合物可含有其他面团和/或面包添加剂，例如上述的任何添加剂，包括酶。在另一方面中，本发明公开了制备面团的方法，其包括将根据本发明的烘焙酶组合物或预混合物添加到至少包含面粉、水和酵母的面团成分中。从上述成分和面包或面团添加剂制备面团是本领域熟知的，所述制备包括将所述成分和添加剂混合以及一步或多步制模(moulding)和发酵步骤。在另一方面中，本发明提供了包含面粉、水、酵母和有效量的根据本发明的烘焙酶组合物或预混合物的面团。本发明还涉及制备面团或烘焙产品的方法，其包括将有效量的本发明的烘焙酶组合物掺进面团中，相对于其中未被掺入多肽的面团或烘焙产品而言，所述烘焙酶组合物改进了面团或从面团获得的烘焙产品的一种或多种性质。短语“掺进面团中”在本文中被定义为将根据本发明的烘焙酶组合物添加至面团、面团将从中制备的任何成分和/或面团将从中制备的面团成分的任何混合物。换句话说，本发明的烘焙酶组合物可在面团制备的任何步骤中添加并可在一个、两个或多个步骤中添力口。使用本领域熟知的方法，将组合物添加至被揉捏并被烘焙的面团成分中，以制造烘焙产品。见，例如，美国专利No.4，567，046、EP-A-426,211,JP-A-60-78529,JP-A-62-111629和JP-A-63-258528o术语“有效量”在本文中被定义为根据本发明的烘焙酶组合物的量，所述量足以就面团和/或烘焙产品的感兴趣的至少一种性质提供可测量的作用。术语“面团”在本文中被定义为面粉和其他成分的混合物，其足够坚实，以进行揉捏或卷。面团可以是新鲜的、冷冻的、制备的或预烘焙的。冷冻面团的制备由Kulp和Lorenz在“Frozen禾口RefrigeratedDoughs禾口Batters”，K.Kulp,K.Lorenz,J.Brummer,Editors,AmericanAssociationofCerealChemists，Publisher(1995)中描述。根据本发明的优选实施方式，根据本发明的脂肪分解酶可以每kg面粉至少3.57DLU单位的根据本发明的脂肪分解酶(例如L01)，优选地至少7.15DLU/kg面粉，更优选地至少14.30DLU/kg面粉的量添加至面团。根据本发明的优选的实施方式，根据本发明的脂肪分解酶可以至多143DLU/kg面粉的根据本发明的脂肪分解酶，优选地至多71.50DLU/kg面粉、更优选地至多35.75DLU/kg面粉的量添加至面团。以DLU单位形式表述的根据本发明的脂肪分解酶的活性可如在“材料和方法”中所示的测量。根据本发明，面团还包含三酰基甘油脂肪酶。根据本发明的优选的实施方式，三酰基甘油脂肪酶可以每kg面粉至少80PLI单位的三酰基甘油脂肪酶，优选地至少160PLI/kg面粉，更优选地至少320PLI/kg面粉的量被添加至面团。根据本发明的优选的实施方式，三酰基甘油脂肪酶可以至多3200PLI/kg面粉的三酰基甘油脂肪酶，优选地至多1600PLI/kg面粉、更优选地至多800PLI/kg面粉的量添加至面团。以PLI单位形式表述的三酰基甘油脂肪酶的活性可如在“材料和方法”中所示的测量。根据本发明的面团还可包含纤维素酶。根据本发明的优选的实施方式，纤维素酶可以每kg面粉至少2.34CXU单位的纤维素酶，优选地至少4.68CXU/kg面粉、更优选地至少7.5CXU/kg面粉、甚至更优选地至少9.36CXU/kg面粉、甚至更优选地至少15CXU/kg面粉、最优选地至少23.4CXU/kg面粉的量被添加至面团。根据本发明的优选的实施方式，纤维素酶可以至多300CXU/kg面粉的纤维素酶的量、优选地以至多150CXU/kg面粉、更优选地至多93.6CXU/kg面粉、甚至更优选地至多75CXU/kg面粉、甚至更优选地至多46.8CXU/kg面粉、最优选地至多30CXU/kg面粉的量被添加至面团。以CXU单位形式表述的纤维素酶的活性可如在“材料和方法”中所示的测量。根据本发明，面团还可包含淀粉葡糖苷酶。根据优选的实施方式，淀粉葡糖苷酶可以每kg面粉至少130AGI单位的淀粉葡糖苷酶、优选地至少^OAGI/kg面粉、更优选地至少520AGI/kg面粉的量添加至面团。根据本发明的优选的实施方式，淀粉葡糖苷酶可以至多5200AGI/kg面粉的淀粉葡糖苷酶，优选地至多^00AGI/kg面粉、更优选地至多1300AGI/kg面粉的量被添加至面团。以AGI单位形式的淀粉葡糖苷酶的活性可如在“材料和方法”中所示的测量。在优选的实施方式中，根据本发明的面团基本上不含SSL和/或CSL，优选地，其基本上不含选自SSL、CSL、DATEM、GSM的乳化剂，更优选地，其基本上不含乳化剂。一般而言，在面团中常用的SSL和/或CSL的量为0.1-0.5%w/w，所述量基于面团中存在的面粉。根据本发明的烘焙组合物特别是以上述的量被添加至面团时，所述烘焙组合物可完全替代在面团中存在的上述量的SSL或CSL。在其中SSL主要被用作碎屑软化剂和抗陈化剂而没有其他软化体系被添加至面包制造工艺的应用中，通过根据本发明的烘焙酶组合物与生麦芽糖淀粉酶组合使用，可实现益处，并且对于替代的每0.1%SSL，使用l_2ppm的生麦芽糖淀粉酶可以是有用的。在另外方面中，本发明提供了制备烘焙产品的方法，其包括烘焙根据本发明的面团的步骤。本发明还提供了通过烘焙根据本发明的面团可获得的烘焙产品。从此类面团制备烘焙产品也是本领域熟知的，并且其可包括面团的制模和成型和进一步发酵，随后在需要的温度和烘焙时间下烘焙。在一种实施方式中，本发明提供了制备烘焙产品的方法，其包括烘焙根据本发明的面团的步骤。本发明还提供了根据该方法可获得的烘焙产品。优选地，根据本发明的烘焙产品是面包，更优选地，烘焙产品是软性的烘焙产品，例如模制面包、三明治面包、圆面包或卷面包。术语“烘焙产品”在本文中被定义为从面团制备的任何产品，其或者是软性的产品或者是脆性的产品。优选地，烘焙产品是软性的烘焙产品，优选地是软性的面包，例如模制面包、三明治面包、圆面包或卷面包。可通过本发明有利地进行生产的烘焙产品的其他例子，不论是白色的、浅色的或深色类型，是面包(特别是白面包、粗面粉面包或黑麦面包)——典型地以块或卷的形式、法国棍子面包、油酥面(pastries)、羊角面包、面糊、面条(煮熟的或(炒的)油炸的)、皮塔饼、玉米饼、玉米面豆卷、蛋糕、松饼、薄烤饼、饼干、小甜饼、圈饼、妙脆角(bagles)、派皮(piecrust)、馒头和薄脆饼干(crispbread)等等。本发明还提供了在面团或因此得到的烘焙产品的生产中使用根据本发明的烘焙组合物或预混合物来替代SSL或CSL的用途，优选地替代选自SSL、CSL、DATEM、GMS的乳化剂的用途，优选地替代所有乳化剂的用途。下文还描述了在焙烤应用中对三酰甘油酯、磷脂和半乳糖脂有活性的根据本发明的脂肪分解酶以及编码脂肪分解酶的多核苷酸(下文表示为根据本发明的多核苷酸)。根据本发明的多核苷酸包含选自下述的核苷酸序列(a)如在SEQIDNO1中展示的核苷酸序列或其功能等同物，所述功能等同物与SEQIDNO1的核苷酸序列具有至少60、70、80或90%的同源性；(b)核苷酸序列，其与是SEQIDNO1的互补体的多核苷酸杂交，并且其中所述序列与SEQIDNO1的核苷酸序列至少60、70、80或90%同源；(c)核苷酸序列，其编码根据SEQIDNO2的氨基酸序列中的成熟多肽或多肽功能等同物，所述多肽功能等同物与SEQIDNO:2的氨基酸序列中的成熟多肽至少具有60、70、80或90%的同源性；(d)作为遗传密码简并的结果，与如在(a)、(b)、(c)的任一定义的序列简并的序列；(e)核苷酸序列，是如在(a)、(b)、(c)或(d)中定义的核苷酸序列的互补体。特别地，本发明提供了具有核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列优选在高严格条件下与SEQIDNO1的互补体的多核苷酸杂交，并且其中所述序列与SEQIDNO1的核苷酸序列至少60、70、80或90%同源。因此，本发明提供了与根据SEQIDN0:1的序列至少90%，优选地至少91%，更优选地至少92%、93%、94%、95%，甚至更优选地至少96%、97^^98%或99%同源的多核苷酸。在一种实施方式中，例如通过固相合成或通过为本领域技术人员已知的其他方法合成获得此类经分离的多核苷酸。在另一实施方式中，本发明提供了根据SEQIDNO1的脂肪分解酶基因或仍然编码活性脂肪分解酶的功能等同物。优选地，根据本发明的多核苷酸是DNA序列。本发明还涉及包含根据本发明的多核苷酸序列的载体以及用来扩增或探测根据本发明的DNA的引物、探针和片段。在另外优选的实施方式中，提供了这样的载体，在载体中根据本发明的多核苷酸序列与至少一个调节序列可操作地连接，所述调节序列允许多核苷酸序列在合适的宿主细胞中表达。优选地，所述合适的宿主细胞是丝状真菌，更优选地是Aspergillus物种。合适的菌株属于Aspergillusniger、oryzae或nidulans。优选地，宿主细胞是Aspergillusniger。本发明还涉及重组产生的宿主细胞，所述宿主细胞含有根据本发明的多核苷酸。本发明还提供了用于制备根据本发明的多核苷酸和载体的方法。在另一实施方式中，本发明提供了这样的重组宿主细胞，其中根据本发明的多核苷酸的表达显著增加或其中脂肪分解活性的生产水平被显著改进。在另一实施方式中，本发明提供了重组生产的宿主细胞，所述宿主细胞含有根据本发明的异源或同源DNA并且其中所述细胞能生产根据本发明的功能性脂肪分解酶，即其能表达或优选地过表达编码根据本发明的脂肪分解酶的多核苷酸，所述宿主细胞例如包含增加拷贝数目的根据本发明的基因的Aspergillus菌株。还在本发明的另一方面中，提供了具有脂肪分解活性的经分离的多肽。根据本发明的多肽包含选自下述的氨基酸序列(a)从根据SEQIDNO2的氨基酸序列得到的成熟多肽的氨基酸序列；或该成熟多肽的功能等同物的氨基酸序列，所述功能等同物具有与从根据SEQIDNO:2的氨基酸序列得到的成熟多肽至少60、70、80或90%同源的氨基酸序列。在一种实施方式中，本发明还涉及具有脂肪分解活性的经分离的多肽，其是从SEQIDNO2的氨基酸序列得到的成熟多肽的功能等同物，其与所述成熟多肽至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%同源。包含根据本发明的多肽的融合蛋白也在本发明的范围内。本发明还提供了制造根据本发明的多肽的方法。本发明还涉及在根据本发明的烘焙酶组合物中使用根据本发明的脂肪分解酶。多核苷酸本发明提供了经分离的多核苷酸，其包含选自下述的核苷酸序列(a)如在SEQIDNO1中展示的核苷酸序列或其功能等同物，所述功能等同物与SEQIDNO1的核苷酸序列具有至少60、70、80或90%同源性；(b)核苷酸序列，其与是SEQIDNO1的互补体的多核苷酸杂交，并且其中所述序列与SEQIDNO1的核苷酸序列至少60、70、80或90%同源；(c)核苷酸序列，其编码从根据SEQIDNO:2的氨基酸序列得到的成熟多肽或多肽功能等同物，所述多肽功能等同物与从SEQIDNO:2的氨基酸序列得到的成熟多肽具有至少60、70、80或90%同源性；(d)作为遗传密码简并的结果，与如在(a)、(b)、(c)的任一中定义的序列简并的序列；(e)核苷酸序列，是如在(a)、(b)、(c)或(d)中定义的核苷酸序列的互补体。在一种实施方式中，本发明提供了编码脂肪分解酶的多核苷酸，所述脂肪分解酶具有对应于从根据SEQIDNO:2的氨基酸序列得到的成熟多肽的氨基酸序列或氨基酸序列功能等同物，所述功能等同物与对应于从根据SEQIDNO:2的氨基酸序列得到的成熟多肽的氨基酸序列具有至少60、70、80或90%同源性。在本发明上下文中，“成熟多肽”在本文中被定义为具有脂肪分解酶活性的多肽，所述多肽是翻译和任何翻译后修饰(N末端处理、C末端截短、糖基化、磷酰化等等)后的其最终形式。成熟化工艺可取决于使用的特定表达载体、表达宿主和生产工艺。优选地，成熟多肽是氨基酸序列SEQIDNO:2中的氨基酸34到304。“编码成熟多肽的核苷酸序列”在本文中被定义为编码成熟多肽的多核苷酸序列。优选地，编码成熟多肽的核苷酸序列是SEQIDNO1中的核苷酸100到912。在另一实施方式中，本发明涉及编码具有脂肪分解活性的经分离的下述多肽的经分离的多核苷酸，所述多肽是从SEQIDNO:2的氨基酸序列得到的成熟多肽的功能等同物，其与所述成熟多肽至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%同源。本发明提供了这样的多核苷酸序列，其包含编码脂肪分解酶的基因以及脂肪分解酶编码序列。因此，本发明涉及包含根据SEQIDNO:1的核苷酸序列的经分离的多核苷酸，或涉及与SEQIDN0:1具有至少60、70、80或90%同源性的多核苷酸变体，例如多核苷酸功能等同物。特别地，本发明涉及经分离的多核苷酸，其包含优选地在严格条件下，更优选地在高度严格条件下与根据SEQIDNO:1的多核苷酸的互补体杂交的核苷酸序列，并且其中优选地，所述序列与SEQIDNO1的核苷酸序列至少60、70、80或90%同源。更具体地，本发明涉及经分离的多核苷酸，其包含根据SEQIDNO:1的核苷酸序列或基本上由根据SEQIDNO1的核苷酸序列组成。可用本领域技术人员已知的方法通过合成获得此类经分离的多核苷酸。如本文中使用的，术语“基因”和“重组基因”指可从染色体DNA中分离、包括编码蛋白(例如脂肪分解酶)的开放阅读框的核酸分子。基因可包括编码序列、非编码序列、内含子和调节序列。此外，基因是指如本文所定义的经分离的核酸分子或多核苷酸。可使用标准分子生物学技术和本文提供的序列信息来分离本发明的核酸分子(例如具有SEQIDNO:1的核苷酸序列的核酸分子或其功能等同物)。例如，使用SEQIDNO:1的所有或部分核酸序列作为杂交探针，可使用标准杂交和克隆技术(例如，如在Sambrook,J.,Fritsh,E.F.,andManiatis,Τ.MolecularCloning:ALaboratoryManual.2nd,ed.,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor，NY，1989中描述的)分离根据本发明的核酸分子。另外，可以使用合成的寡核苷酸引物通过聚合酶链式反应(PCR)来分离包括SEQIDNO:1的全部或部分的核酸分子，所述引物以SEQIDNO1中包含的序列信息为基础设计。可使用cDNA、mRNA或基因组DNA作为模板，并使用适当的寡核苷酸引物根据标准PCR扩增技术，来扩增本发明的核酸。这样扩增的核酸可被克隆进适当的载体中并通过DNA序列分析被表征。另外，可通过标准合成技术(例如使用自动DNA合成仪)制备下述寡核苷酸，所述寡核苷酸对应于根据本发明的核苷酸序列的互补体或可与根据本发明的核苷酸序列的互补体杂交。在优选的实施方式中，本发明的经分离的核酸分子包含根据SEQIDNO1的核苷酸序列。SEQIDNO1的序列编码根据SEQIDNO2的多肽和根据SEQIDNO2中的成熟多肽的脂肪分解酶。根据在根据SEQIDNO:2的氨基酸序列中的成熟多肽的脂肪分解酶被表示为LOl。根据SEQIDNO1的核苷酸序列被表示为DNALOl。在另一优选的实施方式中，本发明的经分离的核酸分子包含下述核酸分子，所述核酸分子是在SEQIDNO:1中所示的核苷酸序列的互补体或这些核苷酸序列的功能等同物。与其他核苷酸序列互补的核酸分子是与该其他核苷酸序列足够互补，从而其能够与该其他核苷酸序列杂交形成稳定双链体的核酸分子。本发明的一个方面涉及经分离的核酸分子，其编码本发明的多肽或其变体，例如其功能等同物，例如生物活性片段或结构域，以及涉及足够用作杂交探针(以鉴定编码本发明的多肽的核酸分子)的核酸分子，和适于用作PCR引物(用于扩增或突变核酸分子)的此类核酸分子的片段。“经分离的多核苷酸”或“经分离的核酸”是与DNA或RNA来源的天然存在的生物基因组中紧邻的两条编码序列(一个在5’端，一个在3’端)不是都紧邻的DNA或RNA。因此，在一个实施方式中，经分离的核酸包含与编码序列紧邻的部分或所有5’非编码(例如启动子)序列。该术语因此包括例如被整合进载体、整合进自主复制的制粒或病毒、或整合进原核生物或真核生物的基因组DNA中的重组DNA，或作为不依赖于其它序列的独立分子(例如通过PCR或限制性内切酶处理产生的cDNA或基因组DNA片段)存在的重组DNA。其还包括编码下述额外多肽的杂交基因的一部分的重组DNA，所述额外多肽基本不含细胞材料、病毒材料或培养基(通过重组DNA技术生产时)或化学前体或其它化学品(化学合成时)。另外，“经分离的核酸片段”是天然不作为片段存在并且在天然状态下不被发现的核酸片段。如本文中使用的，术语“多核苷酸”或“核酸分子”旨在包括DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如mRNA)和使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA类似物。核酸分子可以是单链的或双链的，但是优选是双链DNA。可以使用寡核苷酸类似物或衍生物(例如肌苷或硫代膦酸核苷酸)来合成核酸。这类寡核苷酸可被用于例如制备核酸，所述核酸具有改变的碱基配对能力或提高的核酸酶抗性。本发明的另一实施方式提供了经分离的核酸分子，所述核酸分子与根据本发明的核酸分子是反义的，例如根据本发明的核酸分子的编码链。根据本发明的多核苷酸的补体链也包括在本发明的范围内。核酸片段、探针和引物根据本发明的引物核酸分子可仅包含根据SEQIDNO:1的核酸序列的部分或片段，例如可用作探针或引物的片段或编码根据本发明的蛋白的部分的片段。根据本发明的核苷酸序列允许产生探针和引物，所述探针和引物被设计用于鉴定和/或克隆根据本发明的蛋白的功能等同物，所述功能等同物与根据SEQID而2的蛋白具有至少60、70、80或90%同源性。探针/引物典型地包含基本上被纯化的寡核苷酸，所述寡核苷酸典型地包含下述核苷酸序列区域，所述核苷酸序列区域优选地在高度严格条件下与根据本发明的核苷酸序列的至少大约12或15，优选地大约18或20，优选地大约22或25，更优选地大约30、35、40、45、50、55、60、65或75或更多个相邻的核苷酸杂交。以根据本发明的核苷酸序列为基础，更优选地以SEQIDNO1为基础的探针可被用来探测转录本或基因组序列，所述转录本或基因组序列编码例如生物中的相同蛋白或同源蛋白。在优选的实施方式中，探针还包含与之结合的标签基团，例如标签基团可以是放射性同位素、荧光化合物、酶、辅酶因子。此类探针还可被用作诊断测试试剂盒的部分，所述试剂盒用于鉴定表达根据本发明的蛋白的细胞。同一性&同源性术语“同源性”或“百分比同一性”在本文中可互换使用。针对本发明的目的，在CN102549150A这里定义，为测定两个氨基酸序列或两个核酸序列的百分比同源性，为最佳比较目的而比对序列。为了优化两个序列之间的比对，在被比较的两个序列中的任一序列中引入缺口(gap)。此类比对可在将被比较的序列的全长上进行。或者，比对可在较短的长度上进行，例在大约20，大约50，大约100或更多的核酸/碱基或氨基酸上进行。同一性是在报告的比对区域上的两个序列之间的相同匹配的百分比。可以使用数学算法完成两个序列之间的序列比较和同一性百分比测定。技术人员应当明白下述事实可利用若干种不同的计算机程序来比对两条序列并测定两条序列之间的同源性(Kruskal,J.B.(1983)AnoverviewofsquencecomparisonInD.Sankoff禾口J.B.Kruskal,(ed.),Timewarps,stringeditsandmacromolecules:thetheoryandpracticeofsequencecomparison,pp.1-44AddisonWesley)可使用用于两条序列比对的Needleman和Wunsch算法(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.(1970)J.Mol.Biol.48,443-453)，测定两个氨基酸序列或两个核苷酸序列之间的百分比同一性。氨基酸序列和核苷酸序列两者都可通过算法比对。Needleman-Wunsch算法已在计算机程序NEEDLE中实现。针对本发明目的，使用了来自EMBOSS包(版本2.8.O或更高版本，EMBOSSTheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite(2000)Rice,P.Longden,I.禾口Bleasby,A.TrendsinGenetics16,(6)pp276-277,http://emboss,bioinformatics.nl/)的NEEDLE程序。针对蛋白序列，EBL0SUM62被用做替换矩阵。针对核苷酸序列，使用了EDNAFULL。使用的任选参数是缺口空白罚分10和缺口延伸罚分0.5。技术人员会意识至IJ，所有这些不同的参数将产生稍微不同的结果，但是当使用不同的算法时，两个序列的整体百分比同一性不被显著改变。如上述的，通过程序NEEDLE进行比对后，查询序列和本发明的序列之间的同一性的百分比如下计算在两个序列中都显示相同的氨基酸或相同的核苷酸的比对中的对应位置的数目除以减去比对中的总缺口数目后的总比对长度。通过使用N0BRIEF选项，本文中定义的同一性可从NEEDLE中获得并在程序的输出中被标记为“最长的同一性”。本发明的核酸和蛋白序列还可以被用作“查询序列”，针对公开数据库进行搜索，以例如鉴定其它家族成员或相关序列。这类搜索可以使用AltschuLetal.(1990)J.MoI.Biol.215:403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)进行。可以使用NBLAST程序(计分=100，字长=20)进行BLAST核苷酸搜索，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序(计分=50，字长=3)进行BLAST蛋白搜索，以获得与本发明的蛋白分子同源的氨基酸序列。为了获得加缺口的比对用于比较的目的，可以如Altschuletal.,(1997)NucleicAcidsRes.25(17):3389-3402中所述使用GappedBLAST。使用BLAST和GappedBLAST程序时，可以使用各程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。见http://wwwncbi.nlm.nih.gov下的NationalCenterforBiotechnologyInformation的主页。杂交如本文使用的，术语“杂交”旨在描述用于下述杂交和洗涤的条件，典型地，在所述条件下彼此至少大约60%，65%，80%，85%，90%，优选地至少93%，更优选地至少95%和最优选地至少98%同源的核苷酸序列保持与彼此的互补体杂交。这类杂交条件的一个优选的非限制性例子是于约45°C下在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，然后于50°C、优选55°C、优选60°C和甚至更优选65°C下，在IXSSC、0.1%SDS中洗涤一次或多次。高度严格条件包括例如于68°C下在切SSC/5xDenhardt，s溶液/1.0%SDS中杂交并于室温下在0.2xSSC/0.1%SDS中洗涤。或者，洗涤可以在42°C进行。技术人员应当知道对于严格和高度严格的杂交条件而言应用何种条件。涉及这类条件的其它指示在该领域能够容易地获得，例如在Sambrooketal.，1989，MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,N.Y.；禾口Ausubeletal.(eds.),1995,CurrentProtocolsinMolecularBiology,(JohnWiley&Sons,N.Y.)中。当然，仅与多聚A(polyΑ)序列(例如mRNA的3’末端多聚(A))或互补的T(或U)残基段杂交的多核苷酸不应被包括于用来与本发明的核酸部分特异杂交的本发明多核苷酸中，因为这类多核苷酸会与含有多聚(A)段或其补体的任何核酸分子(例如尤其是任何双链cDNA克隆)杂交。从其它生物获得全长DNA以一种典型的途径，来筛选从其它生物(例如丝状真菌，尤其是来自Fusarium的种)构建的cDNA文库。例如，可以通过Northern印迹针对SEQIDNO:1的同源多核苷酸筛选Fusarium菌株。检测到与根据本发明的多核苷酸同源的转录物后，可以利用本领域技术人员公知的标准技术从分离自适当菌株的RNA构建cDNA文库。或者，可以使用能够与根据本发明的多核苷酸杂交的探针来筛选总基因组DNA文库。可以例如通过进行PCR分离同源的基因序列，所述PCR使用以本文所述核苷酸序列为基础设计的两个简并寡核苷酸引物池。用于反应的模板可以是通过反转录mRNA获得的cDNA，所述mRNA从已知或怀疑表达本发明多核苷酸的菌株中制备。可以对PCR产物进行亚克隆和测序，以确保被扩增的序列代表了根据本发明的新核酸序列的序列或其功能等同物。然后可以通过多种已知方法，使用PCR片段来分离全长cDNA克隆。例如，被扩增的片段可以被标记，并用于筛选噬菌体或粘粒cDNA文库。或者，被标记的片段可以被用于筛选基因组文库。也可以用PCR技术来从其它生物中分离全长cDNA序列。例如，可以根据标准步骤从合适的细胞或组织来源中分离RNA。可以使用特异于被扩增片段最5’端的寡核苷酸引物，引导第一链合成，针对RNA进行反转录反应。然后可以使用标准的末端转移酶反应将得到的RNA/DNA杂交体“加尾”(例如用鸟嘌呤)，可以用RNaseH消化所述杂交体，然后(例如用多聚-C引物)引物起始第二链合成。因此，被扩增片段上游的cDNA序列可以容易地被分离。有用的克隆策略的综述，参阅例如上文Sambrooketal.禾口上文的Ausubeletal.。载体本发明的另一方面涉及包括克隆的载体和涉及包含根据本发明的多核苷酸序列的表达载体，所述多核苷酸序列编码根据本发明的具有脂肪分解活性的多肽或其功能等同物。本发明还涉及，例如在其中本发明的多肽的表达发生的情况下，在合适的宿主细胞中培育、转化或转染此类载体的方法。如本文中使用的，术语“载体”指能够转运与之连接的另一核酸的核酸分子。本发明的多核苷酸可被整合进重组可复制载体，例如克隆或表达载体中。载体可用来在适宜的宿主细胞中复制核酸。因而，在其他实施方式中，本发明提供了制造本发明的多核苷酸的方法，其通过将本发明的多核苷酸引进可复制载体、将载体引进适宜的宿主细胞并在致使载体复制的条件下培育宿主细胞来实现。载体可从宿主细胞回收。下文描述了合适的宿主细胞。被表达盒或本发明的多核苷酸插入的载体可以是可方便地经受重组DNA程序的任何载体，并且载体的选择通常取决于其将被引入的宿主细胞。根据本发明的载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于染色体复制，例如质粒。或者，载体可以是这样的载体，当被引进宿主细胞时，其被整合进宿主细胞基因组中并与已被整合进载体的染色体一起复制。一种类型的载体是“质粒”，质粒是指其中可以连接其它DNA区段的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中其它DNA区段可以被连接进病毒基因组中。某些载体在它们被引入的宿主细胞中能够自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加体哺乳动物载体)。其它载体(例如非附加体哺乳动物载体)在引入宿主细胞时被整合进宿主细胞的基因组中，从而随宿主细胞的基因组一起被复制。另外，某些载体能够指导与它们可操作地连接的基因的表达。这类载体在本文中被称作“表达载体”。一般而言，重组DNA技术中使用的表达载体通常是以质粒的形式存在的。术语“质粒”和“载体”在本文中可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明旨在包括这类表达载体的起等同作用的其它形式，例如粘粒(cosmid)、病毒载体(例如复制缺陷反转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)和噬菌体载体。根据本发明的载体可在体外使用，例如用于产生RNA或用来转染或转化宿主细胞。本发明的载体可包含两种或多种，例如三种、四种或五种本发明的多核苷酸，例如用于过表达。本发明的重组表达载体以适合核酸在宿主细胞中表达的形式包含本发明的核酸，这意味着重组表达载体包括一个或多个与待表达的核酸序列可操作地连接的调节序列，以要用于表达的宿主细胞为基础选择所述调节序列。在重组表达载体中，“可操作地连接”旨在表示感兴趣的核苷酸序列与调节序列以允许核苷酸序列表达(例如在体外转录/翻译体系中或当载体被引入宿主细胞中时在宿主细胞中)的方式连接，即术语“可操作地连接”是指这样的结合，其中所述的元件处于以它们期望的方式允许它们发挥作用的关系中。与编码序列“可操作地连接的”调节序列(例如启动子、增强子或其他表达调节信号)以这样的方式放置，使得在与对照序列相容的条件下实现编码序列的表达，或该序列被排列使得它们共同发挥期望的目的，例如在启动子处开始转录并继续进行贯穿编码多肽的整个DNA序列。术语“调节序列”旨在包括启动子、增强子和其它表达控制元件(例如多腺苷酸化信号)。这类调节序列描述于例如Goeddel；GeneExpressionTechnology=MethodsinEnzymology185,AcademicPress,SanDiego,CA(1990)中。术语调节序列包括在许多类型的宿主细胞中指导核苷酸序列组成型表达的那些序列和仅在某种宿主细胞中指导核苷酸序列表达的那些序列(例如组织特异调节序列)。针对给定宿主细胞，载体或表达构建体可因而包含，以相对于编码第一个发明多肽的序列的编码链的从5’-末端到3’-末端的连续顺序彼此可操作地连接的下述元件(1)启动子序列，其能指导编码多肽的核苷酸序列在给定宿主细胞中转录；(任选地，信号序列，其能指导多肽从给定宿主细胞分泌进培养基中；C3)编码成熟多肽并且优选地编码多肽的活性形式的DNA序列，所述多肽具有根据本发明的脂肪分解活性；和优选地(4)转录终止区(终止子)，其能终止编码多肽的下游核苷酸序列转录。根据本发明的下游核苷酸序列可以是含有一个或多个转录终止位点(例如终止子)的3’非翻译区。终止子的来源不太关键。终止子可以是例如编码多肽的DNA序列的天然终止子。但是，优选地，酵母终止子被用在酵母宿主细胞中，丝状真菌终止子被用在丝状真菌宿主细胞中。更优选地，终止子对宿主细胞(其中编码多肽的核苷酸序列将被表达)而言是内源的。在转录区，可存在用于翻译的核糖体结合位点。构建体表达的成熟转录本的编码部分应包含位于起点的翻译起始AUG和适当地位于待翻译多肽末端的终止密码子。可通过选择异源性调节区(例如启动子、分泌前导区和/或终止子区)来实现本发明的多核苷酸的增强表达，所述异源性调节区可用来增加表达并且必要时来增加感兴趣的蛋白从表达宿主中的分泌水平和/或用作提供对本发明的多肽的表达的可诱导的控制。本领域技术人员应当知道对表达载体的设计可取决于下述因素待转化的宿主细胞的选择、期望的蛋白表达水平等。本发明的表达载体可以被引入宿主细胞中，从而生产由本文所述的核酸编码的蛋白或肽(例如具有根据本发明的脂肪分解活性的多肽、蛋白的突变体形式，其片段、变体或功能等同物、融合蛋白等)。本发明的重组表达载体可以被设计，以用于根据本发明的多肽在原核细胞或真核细胞中的表达。例如根据本发明的多肽可以在细菌细胞如E.coli和Bacilli、昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、真菌细胞、酵母细胞或哺乳动物细胞中生产。合适的宿主细胞在Goeddel，GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress，SanDiego,CA(1990)中进一步讨论。或者，可以例如使用T7启动子调节序列和T7聚合酶体外转录和翻译重组表达载体。对于大多数丝状真菌和酵母而言，载体或表达构建体优选地被整合进宿主细胞的基因组中，以获得稳定的转化体。但是，对于某些酵母而言，表达构建体可被整合进的用于稳定和高水平表达的同样合适的游离型载体是可获得的，其例子包括分别得自Saccharomyces和Kluyveromyces的2μ和pKDl质粒，或含有AMA序列(例如来自Aspergillus的AMA1)的载体。在表达构建体被整合进宿主细胞基因组的情况下，构建体在基因组中的随机基因座上或使用同源重组在预定的靶基因座(在这样的情况下，靶基因座优选地包含高表达基因)上整合。因此，用于本发明中的表达载体包括得自染色体、附加体和病毒的载体，例如得自细菌质粒、噬菌体、酵母附加体、酵母染色体元件、病毒(如杆状病毒、乳多空病毒、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病病毒和反转录病毒)的载体和得自其组合的载体，如得自质粒和噬菌体遗传元件的载体(如粘粒和噬菌粒)。核苷酸插入物应与合适的启动子可操作地连接，除了编码本发明的多肽的基因的天然的启动子，其他启动子可用来指导本发明的多肽的表达。在指导本发明的多肽在期望的表达宿主中表达中，针对其效率，可选择启动子。可在本发明中有用的启动子的例子包括噬菌体λPL启动子，Ε.colilac、trp和tac启动子，SV40早期和晚期启动子和反转录病毒LTR的启动子，但不限于这些。其它合适的启动子是技术人员应当知道的。在一个特定的实施方式中，能够在真菌或酵母中指导根据本发明的多肽的高水平表达的启动子是优选的。这类启动子是本领域已知的。可使用能够指导在本发明的宿主细胞中转录的各种启动子。优选地，启动子序列得自高表达基因。启动子优选得自和/或包含在优选的预定靶基因座中用于表达构建体的整合的优选的高表达基因的的例子是，包括但不限于，编码糖酵解酶的基因，所述糖酵解酶例如磷酸丙糖异构酶(TPI)、磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、磷酸甘油酸酯激酶(PGK)、丙酮酸激酶(PI或H(I)、醇脱氢酶(ADH)；以及编码淀粉酶(例如葡糖淀粉酶)、蛋白酶、木聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-半乳糖苷酶、乙醇(甲醇)氧化酶、延伸因子和核糖体蛋白的基因。合适的高表达基因的具体例子包括例如来自Kluyveromycessp.的LAC4基因、分别来自Hansenula和Pichia的甲醇氧化酶基因(Α0Χ和Μ0Χ)、来自A.niger和A.awamori的葡糖淀粉酶(glaA)基因、A.oryzaeTAKA-淀粉酶基因、A.nidulansgpdA基因和Τ.reesei纤维二糖水解酶基因。用在真菌表达宿主中的优选的强组成型和/或诱导型启动子的例子是从针对木聚糖酶(xlnA)、植酸酶、ATP-合成酶、亚基9(oliC)、磷酸丙糖异构酶(tpi)、醇脱氢酶(AdhA)、a-淀粉酶(amy)、淀粉葡糖苷酶(AG-来自glaA基因)、乙酰胺酶(amdS)和3_磷酸甘油醛脱氢酶(gpd)启动子的真菌基因可获得的那些。强酵母启动子的例子是从针对醇脱氢酶、乳糖酶、3-磷酸甘油酸酯酶和磷酸丙糖异构酶的基因可获得的那些。强细菌启动子的例子是α-淀粉酶和SPo2启动子以及来自胞外蛋白酶基因的启动子。适于植物细胞的启动子包括胭脂碱合成酶(nos)、章鱼碱合成酶(ocs)、甘露碱合成酶(mas)、核酮糖小亚基(rubisco大小亚基)、组蛋白、水稻肌动蛋白、菜豆蛋白、花椰菜花叶病毒(CMV)35S以及19S和圆环病毒启动子。所有上述启动子是本领域内容易得到的。载体还可包括引起RNA的多核苷酸侧翼的序列，其包含与真核基因组序列或病毒基因组序列同源的序列。这将允许本发明的多核苷酸引进宿主细胞基因组中。载体可含有以反义方向定向的本发明的多核苷酸，以提供反义RNA的生产。可以通过常规的转化或转染技术将载体DNA引入原核或真核细胞中。本文使用的术语“转化”和“转染”旨在表示用于向宿主细胞中引入外源核酸(例如DNA)的多种本领域公知的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖-介导的转染、转导、感染、脂质转染、阳离子脂质介导的转染或电穿孔。用于转化或转染宿主细胞的合适方法可见于Sambrook，etal.(MolecularCloning:ALaboratoryManual,2nd,ed·ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989)，Davisetal.,BasicMethodsinMolecularBiology(1986)和其它实验室手册中。对于哺乳动物细胞的稳定转染而言，下述是已知的取决于使用的表达载体和转染技术，只有非常小部分的细胞可以将外源DNA整合进它们的基因组中。为了鉴定并选择这些整合体，通常将编码可选择标记(例如抗性或抗生素)的基因与感兴趣的基因一起引入宿主细胞中。优选的可选择标记包括，但不限于，赋予药物或在宿主细胞中补充缺陷的那些。(例如G418、潮霉素和甲氨喋呤)抗性的基因。优选的选择标记包括但不限于，赋予抗药性或补充宿主细胞缺陷的那些。它们包括，例如用于转化大部分丝状真菌和酵母的通用标记基因，例如，乙酰胺酶基因或cDNA(来自A.nidulans，A.oryzae或A.niger的amdS，niaD,facA基因或cDNA)，或提供抗抗生素样G418、潮霉素、博来霉素、卡那霉素、甲氨蝶呤、腐草霉素或苯菌灵抗性(benA)基因。可选择地，可使用具体的选择标记，例如需要对应的突变宿主菌的营养缺陷型标记例如URA3(来自S.cerevisiae或来自其他酵母的类似基因),pyrG或pyrA(来自A.nidulans或A.niger),argB(来自A.nidulans或A.niger)或trpC.在优选的实施方式中，在引入表达构建体之后，从转化的宿主细胞中删除选择标记，以便获得没有选择标记基因的能够生产多肽的转化宿主细胞。其他标记包括ATP合成酶，亚基9(oliC)，乳清苷-5’-磷酸脱羧酶(pvrA)，细菌G418抗性基因(这也可用在酵母中，但不能用在真菌中)，氨苄青霉素抗性基因(E.coli),新霉素抗性基因(Bacillus)和编码β-葡萄糖甘酸酶(⑶S)的Ε.coliuidA基因。载体可在体外使用，例如用于生产RNA或用于转染或转化宿主细胞。用指导融合蛋白或非融合蛋白表达的包含组成型或诱导型启动子的载体，通常在E.coli中进行原核生物中的蛋白的表达。融合载体添加许多氨基酸至其中编码的蛋白质，例如至重组蛋白的氨基末端。这种融合载体典型地用作三个目的1)增加重组蛋白的表达；2)增加重组蛋白的溶解性；和幻通过用作亲和纯化的配体帮助重组蛋白纯化。通常，在融合表达载体中，溶蛋白性位点被引入在融合部分和重组蛋白的结合处，以使得重组蛋白能够从融合部分分开，随后纯化融合蛋白。如所示的，表达载体可优选地含有选择标记。这种标记包括用于真核细胞培养的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性和用于在E.coli中和其他细菌中培养的四环素或氨苄青霉素抗性。合适宿主的代表性例子包括细菌细胞，例如E.coli，StreptomycesSalmonellatyphimurium禾口某些Bacillus种；真菌细胞，例如Aspergillus种，例如A.niger,A.oryzae禾口A.nidulans,例如酵母，例如Kluyveromyces，例如K.Iactis禾口/或Puchia,例如P.pastoris；昆虫细胞例如DrosophilaS2和SpodopteraSf9；动物细胞例如CHO、COS和Bowesmelanoma；和植物细胞。用于上述宿主细胞的合适的培养基和条件在本领域是已知的。优选在细菌中使用的载体是，例如在W0-A1-2004/074468所公开的，其通过引用包括在本文中。其他合适的载体对技术人员是显而易见的。适合在本发明中使用的已知细菌启动子包括在W0-A1-2004/074468中公开的启动子，其通过引用包括在本文中。可以通过向载体中插入增强子序列，来提高高等真核生物对编码本发明多肽的DNA的转录。增强子是DNA的顺式作用元件，通常约10到300bp，其作用于提高启动子在给定的宿主细胞类型中的转录活性。增强子的例子包括SV40增强子(其位于复制起点下游的bp100到270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点下游的多瘤增强子和腺病毒增强子。为了将翻译的蛋白分泌进入内质网腔中、进入壁膜间隙中或进入细胞外环境中，可以向被表达的多肽中整合进适当的分泌信号。所述信号对多肽可以是同源的或它们可以是异源信号。多肽可以以经修饰的方式被表达，例如融合蛋白，并可不仅含有分泌信号而且含有额外的异源功能区。因此，例如额外氨基酸区(尤其是带电荷的氨基酸)可被添加至多肽的N端，以改进纯化期间或随后的操作和储存期间在宿主细胞中的稳定性和持久性。还可向多肽添加肽基元，以便于纯化。根据本发明的多肽本发明提供了具有脂肪分解活性的经分离的多肽，其包含(a)得自根据SEQIDNO:2的氨基酸序列的成熟多肽或其功能等同物，所述多肽功能等同物具有与得自根据SEQIDNO:2的氨基酸序列的成熟多肽至少60，70，80或90%同源的氨基酸序列；(b)由根据本发明的多核苷酸编码的氨基酸序列。因而，发明提供了具有脂肪分解活性的经分离的多肽，其包含得自根据SEQIDNO2的氨基酸序列的成熟多肽，优选地包含SEQIDNO2的氨基酸34-304，和通过在合适的宿主细胞中表达SEQIDNO:1的多核苷酸可获得的氨基酸序列。本发明还包含是功能等同物并与根据SEQIDNO2的氨基酸序列中的成熟多肽至少60，70，80或90%同源的肽或多肽。在另一实施方式中，本发明还涉及具有脂肪分解活性的经分离的多肽，其是得自SEQIDNO:2的氨基酸序列的成熟多肽的功能等同物，其与所述多肽至少60%，65%，70%，75%，80%，85%，90%，95%同源。上述多肽一同包含在术语“根据本发明的多肽”中。术语“肽”和“寡肽”被认为是同义的(如其通常被认为的那样)，且当上下文需要表示通过肽键偶合的至少两个氨基酸链时，每个术语可以互换使用。词语“多肽”(或蛋白)在本文中使用时表示含有多于七个氨基酸残基的链。所有的寡肽和多肽表达式或序列在本文中从左到右且从氨基端到羧基端的方向书写。本文使用的单字母氨基酸代码是本领域普遍已知的，并可见于Sambrook,etal.(MolecularCloning:ALaboratoryManual,2nd,ed.ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989)。“经分离的”多肽或蛋白表示被从其天然环境中取出的多肽或蛋白。例如，就本发明的目的而言，在宿主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白被认为是经分离的，与通过任何合适的技术已基本纯化的天然或重组多肽一样，所述合适的技术例如SmithandJohnson,Gene67:31-40(1988)中公开的单步骤纯化方法。为本领域技术人员已知的是，因为在成熟化期间的加工错误，SEQIDNO2的N末端或在根据SEQIDNO:2的氨基酸序列中的成熟多肽的N末端以及SEQIDNO:2的C末端或在根据SEQIDNO:2的氨基酸序列中的成熟多肽的C末端可以是异源的。特别地，此类加工错误可在多肽过表达时发生。此外，外蛋白酶活性可引起异源性。异源性发生的程度取决于使用的宿主和发酵方案。此类C末端加工产物可导致如用SEQIDNO:2所表示的或在根据SEQIDNO:2的氨基酸序列中的成熟多肽所表示的更短的多肽或更长的多肽。作为CN102549150A此类错误的结果，N末端也可以是异源的。在其他实施方式中，本发明提供了经分离的多核苷酸，其编码根据SEQIDNO:2的多肽的至少一个功能结构域或在根据SEQIDNO:2的氨基酸序列中的成熟多肽的至少一个功能结构域，其含有额外的残基并在-1、"2或-3等位置上开始。或者，其可缺少某些残基并因而在2或3或4等位置上开始。额外的残基还可在C末端，例如在347、348等位置上存在。或者，C末端可缺少某些残基并因而在345或344位置上结束。可通过本领域中已知的方法，从重组细胞培养基中回收并纯化根据本发明的脂肪分角军酶(ProteinPurificationProtocols，MethodsinMolecularBiologyseriesbyPaulCutler，HumanaPress，2004)。本发明的多肽包括天然纯化的产物、化学合成步骤的产物，和通过重组技术从原核或真核宿主生产的产物，所述宿主包括例如细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞。取决于重组生产步骤中使用的宿主，可以将本发明的多肽糖基化或不糖基化。另外，本发明的多肽也可以包含初始被修饰的甲硫氨酸残基——在一些情况下由宿主介导的过程产生。多肽片段本发明还包括根据本发明的多肽的生物活性片段。本发明的多肽的生物活性片段包括包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与根据本发明的氨基酸序列(例如，得自SEQIDNO2的氨基酸序列的成熟多肽)足够同一或得自后者，其包括比全长蛋白更少的氨基酸但其表现对应的全长蛋白的至少一种生物活性，优选地其表现脂肪分解活性。典型地，生物活性片段包含具有根据本发明的蛋白的至少一种活性的结构域或基序(motif)。本发明的蛋白的生物活性片段可以是多肽，所述多肽的长度比SEQIDNO:2中的成熟多肽短5、10、15、20、25或更多个氨基酸，并且其与SEQIDN0:2中的成熟多肽具有至少60、70、80或90%同源性。另外，其它生物活性部分(其中蛋白的其它区域被删除)可以通过重组技术被制备，并针对本发明多肽的天然形式的一种或多种生物活性做出评价。本发明还包括编码根据本发明的蛋白的上述生物活性片段的核酸片段。融合蛋白根据本发明的多肽或其功能等同物，例如其生物活性部分，可被可操作地连接到并非根据本发明的多肽(例如，异源氨基酸序列)上，以形成融合蛋白。“并非根据本发明的多肽”指一种多肽，其具有对应于与根据本发明的蛋白不基本同源的蛋白的氨基酸序列。此类“并非根据本发明的多肽”可得自相同或不同的生物体。在融合蛋白内，本发明的多肽可对应于根据本发明脂肪分解酶的全部或生物活性片段。在优选的实施方式中，融合蛋白包含根据本发明的蛋白的至少两个生物活性部分。在融合蛋白中，术语“可操作地连接”用来表示根据本发明的多肽和并非根据本发明的多肽以符合读码框的方式相互融合。并非根据本发明的多肽可以被融合到多肽的N-末端或C-末端上。例如，在一种实施方式中，融合蛋白是这样的融合蛋白，其中，氨基酸序列被融合到GST序列的C-末端上。此类融合蛋白可以协助对根据本发明的重组蛋白的纯化。在另一种实施方式中，根据本发明的融合蛋白是在其N-末端含有异源信号序列的蛋白。可以通过使用异源信号序列，来增加根据本发明的蛋白在某些宿主细胞(例如，哺乳动物宿主细胞和酵母宿主细胞)中的表达和/或分泌。在另一个例子中，杆状病毒包膜蛋白的gp67分泌序列可被用作异源信号序列(CurrentProtocolsinMolecularBiology，Ausubeletal.，eds.，JohnWiley&Sons，1992)。真核异源信号序列的其它例子包括蜂毒肽的分泌序列和人类胎盘碱性磷酸酶的分泌序列(Stratagene;LaJolla，California)。在又一个例子中，有用的原核异源信号序列包括PhoA分泌信号(前述的Sambrooketal.)和蛋白A分泌信号(PharmaciaBiotech；Piscataway,NewJersey)。信号序列可被用于协助本发明的蛋白或多肽的分泌及分离。典型地，信号序列的特征为具有疏水氨基酸核心，分泌期间，在一次或多次切割事件中，通常可将所述信号序列从成熟蛋白上切割掉。此类信号肽含有加工位点，允许信号序列在通过分泌途径之时被从成熟蛋白上切割掉。信号序列指导蛋白的分泌，例如从转化进表达载体的真核宿主中分泌，信号序列随后或同时被切割掉。然后通过本领域已知的方法，可以容易地从胞外培养基中纯化出多肽。或者，可以用能协助纯化的序列，例如用GST结构域将信号序列连接到人们感兴趣的蛋白上。因此，例如，编码多肽的序列可与标记物序列(例如编码能促进融合多肽的纯化的肽的序列)融合。在本发明这一方面的某些优选的实施方式中，标记物序列是六组氨酸肽，例如PQE载体Oiiagendnc.)中提供的标签；很多标记物序列都是可以购买到的。例如，如Gentzetal,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:821-824(1989)中所述，例如，六组氨酸为融合蛋白提供了方便的纯化。HA标签是另一种有利于纯化的肽，其对应于来自流感血凝素蛋白的表位，这已例如被Wilsonetal.,Cell37:767(1984)进行了描述。优选地，根据本发明的融合蛋白可通过标准的重组DNA技术来产生。例如，按照传统技术，将编码不同多肽序列的DNA片段以符合读码框的方式连接到一起，例如，通过采用平末端或交错切口末端用于连接；采用限制性酶消化以提供合适的末端，或根据需要填平粘末端；采用碱性磷酸酶处理，以避免人们不想要的结合或酶连接。在另一种实施方式中，可以通过传统技术(包括自动DNA合成仪)来合成融合基因。或者，可以使用锚定引物(anchorprimer)来对基因片段进行PCR扩增，所述引物能在两段连续的基因片段之间产生互补突出端(overhang)，随后可以进行退火和再次扩增，以产生出嵌合基因序列(例如，见CurrentProtocolsinMolecularBiology,eds.Ausubeletal.JohnWiley&Sons1992)。此外，还可以商业途径获得很多已经编码有融合部分(例如，GST多肽)的表达载体。编码根据本发明的多肽的核酸可被克隆进此类表达载体，以使得融合部分以符合读码框的方式与根据本发明的蛋白连接起来。功能等同物术语“功能等同物”和“功能变体”在本文可互换使用。根据本发明的多核苷酸的功能等同物是下述经分离的多核苷酸，其与SEQIDNO1的核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、优选地至少90%同源性并且编码下述多肽，所述多肽至少表现根据本发明的脂肪分解酶的一种特定功能，优选地，所述多肽具有脂肪分解活性。优选地，在烘焙应用中，例如在面团条件下，根据本发明的脂肪分解酶或具有脂肪分解活性的多肽具有对甘油三酯、磷脂和半乳糖脂的脂肪分解活性。根据本发明的多肽的功能等同物是下述多肽，所述多肽与得自SEQIDNO:2的氨基酸序列的成熟多肽具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、优选地至少90%同源性，并且在烘焙应用中，例如在面团条件下，其表现根据本发明的脂肪分解酶的至少一种功能，优选地，其表现脂肪分解活性，更优选地，其表现对甘油三酯、磷脂和半乳糖脂的脂肪分解活性。因此，所述的功能等同物还包括具有如上所述的脂肪分解活性的生物活性片段。根据本发明的多肽的功能等同物可含有与得自根据SEQIDNO:2的氨基酸序列的成熟多肽相比的一个或多个氨基酸取代或不会影响酶的特定功能的氨基酸取代、插入或缺失。功能上无作用的氨基酸取代是在根据SEQIDNO:2的氨基酸序列的成熟多肽中的取代，其本质上不会改变其特定功能性。例如，在本发明的蛋白间保守的氨基酸残基被预测为尤其对改变不敏感。另外，在根据本发明的蛋白和其它脂肪分解酶中的保守氨基酸可能对改变不敏感。典型地，根据本发明的多核苷酸的功能等同物可含有沉默突变或不改变所编码的多肽的生物功能的突变。因此，本发明提供了编码根据本发明的下述多肽的核酸分子，所述多肽含有对于具体生物活性并非必需的氨基酸残基改变。这类蛋白在氨基酸序列上与得自根据SEQIDNO:2的氨基酸序列的成熟多肽不同，但仍保留其至少一种生物活性，优选地，它们保留脂肪分解活性。在一种实施方式中，根据本发明的多核苷酸的功能等同物包含编码根据本发明的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽包含与根据SEQIDNO:2的氨基酸序列中成熟多肽至少约60%、65%、70%、75%、80%、85%、优选地至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更同源的基本同源的氨基酸序列。在一种实施方式中，具有至少90%同源性的在根据SEQIDNO:2的氨基酸序列中的成熟多肽的功能等同物，是具有根据从根据SEQIDN0:4(下文表示为⑶幻的氨基酸序列得到的成熟多肽的氨基酸序列的多肽。在另一实施方式中，所述功能等同物是具有根据下述成熟多肽的氨基酸序列的多肽，所述成熟多肽得自根据SEQIDNO:6(下文表示为L(XB)的氨基酸序列，并且还在另一实施方式中，所述功能等同物是具有根据下述成熟多肽的氨基酸的多肽，所述成熟多肽得自根据SEQIDN0:8(下位表示为L04)的氨基酸序列。在优选的实施方式中，得自分别根据SEQIDNO4,SEQIDNO:6或SEQIDNO:8的氨基酸序列的成熟多肽是分别根据SEQIDNO:4、SEQIDNO6或SEQIDNO8的氨基酸序列中的氨基酸序列34到304。编码根据本发明的多肽的根据本发明的多核苷酸的功能等同物将包含与根据SEQIDNO1的核酸序列至少约60%、65%、70%、75%、80%、85%，优选地至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源或更同源的多核苷酸序列。在一种实施方式中，根据SEQIDNO1的多核苷酸的功能等同物(其具有根据SEQIDNO:1的多核苷酸的至少90%同源性)是具有根据SEQIDN0:3(表示为DNAL02)的多核苷酸序列的多肽，在另一实施方式中，所述功能等同物是具有根据SEQIDN0:5(表示为DNAL03)的核苷酸序列的多核苷酸，还在另一实施方式中，所述功能等同物是具有根据SEQIDN0:7(表示为DNAL04)的核苷酸序列的多核苷酸。根据SEQIDNO:3的多核苷酸序列编码根据SEQIDNO4的多肽，根据SEQIDNO5的多核苷酸序列编码根据SEQIDNO6的多肽，根据SEQIDNO:7的多核苷酸序列编码根据SEQIDNO:8的多肽。在优选的实施方式中，在SEQIDNO:3、5、7中的多核苷酸100-912分别编码在SEQIDNO:4、6、8中的成熟多肽。可以如下文所述来制造编码与得自根据SEQIDNO2的氨基酸序列的成熟多肽同源的蛋白的经分离的核酸分子向根据SEQIDNO1的编码核苷酸序列中引入一个或多个核苷酸取代、添加或缺失，使得一个或多个氨基酸取代、缺失或插入被引入所编码的蛋白中。这类突变可以通过标准技术引入，如定点诱变和PCR-介导的诱变。编码其它具有脂肪分解活性的家族成员的核酸，其因而具有与SEQIDN0:l、3、5、7不同的核苷酸序列但其满足上述的条件，其也在本发明的范围内。另外，编码具有脂肪分解酶活性的下述蛋白的核酸，也在本发明的范围内，所述蛋白具有与氨基酸序列SEQIDNO:2、4、6、8中的成熟多肽不同的氨基酸序列但其满足上述的条件。根据本发明的多核苷酸可在其密码子使用方面被优化，优选地根据W02006/077258和/或W02008/000632中描述的方法。W02008/000632提出了密码对优化。密码对优化是这样的方法，其中编码多肽的核苷酸序列就其密码使用特别是被使用的密码对而被修饰，以获得编码多肽的核苷酸序列的表达改进和/或所编码的多肽的生产改进。密码对被定义为在编码序列中的一组两个连续的三联体(密码子)。可以根据它们与本文公开的核酸的同源性，使用本文公开的cDNA或其合适的片段作为杂交探针，根据标准的杂交技术，优选地在高度严格的杂交条件下，来分离对应于根据本发明的多核苷酸的变体(例如天然等位基因变体)或同源物的核酸分子。在本发明的另一方面中，提供了经改进的蛋白。如果与具有根据SEQIDN0:2的氨基酸序列的多肽的生物活性比较，经改进的蛋白是其中至少一种生物活性被改进的蛋白。这类蛋白可以如下获得沿全部或部分编码序列SEQIDNO:1随机地引入突变，例如通过饱和诱变，并且重组表达得到的突变体并针对生物活性进行筛选。例如，本领域提供了用于测量脂肪分解酶的酶活性的标准检验，因而经改进的蛋白可以容易地被选择。在一个优选的实施方式中，根据本发明的多肽具有根据SEQIDNO2中的氨基酸34到304的氨基酸序列。在另一实施方式中，多肽与得自根据SEQIDNO:2的氨基酸序列的成熟多肽至少90%同源，并且在烘焙应用中，例如在面团条件下，其保留得自根据SEQIDNO2的氨基酸序列的成熟多肽的至少一种生物活性，优选地，其保留脂肪分解活性，更优选地，其保留对甘油三酯、磷脂和半乳糖脂的脂肪分解活性，但是由于如上所述的天然变异或诱变而在氨基酸序列上有差异。在又一个优选的实施方式中，根据本发明的蛋白具有由下述经分离的核酸片段编码的氨基酸序列，所述经分离的核酸片段与为SEQIDNO:1的互补体的多核苷酸优选地在高度严格的杂交条件下杂交，并且其中根据所述核苷酸序列与SEQIDNO:1的核苷酸序列至少90%同源。因而，根据本发明的蛋白优选地是下述蛋白，其包含与得自根据SEQIDNO2的氨基酸序列的成熟多肽至少约90%、91%92%93%94%、95%、96%、97%、98%、99%同源或更同源的氨基酸序列，并且其保留在根据SEQIDNO:2的氨基酸序列中的成熟多肽的至少一种功能活性，优选地，其保留脂肪分解活性，更优选地，在烘焙应用中，例如在面团条件下，其保留对甘油三酯、磷脂和半乳糖脂的脂肪分解活性。也可以如下文所述来鉴定根据本发明的蛋白的功能等同物例如，针对脂肪分解酶活性，筛选本发明蛋白的突变体(例如截短突变体)的组合文库。在一个实施方式中，通过核酸水平上的组合诱变产生多样性文库(variegatedlibrary)。可以通过例如将合成的寡核苷酸混合物酶连接为基因序列来产生变体的多样性文库，从而可能的蛋白序列的简并集合(degenerateset)可作为个体多肽或者作为一组较大的融合蛋白(例如噬菌体展示)表达。存在可用于从简并寡核苷酸生产本发明多肽的可能变体文库的多种方法。用于合成简并寡核苷酸的方法是本领域已知的(见例如Narang(1983)Tetrahedron393；Itakuraetal.(1984)Annu.Rev.Biochem.53323；ltakuraetal.(1984)Science1981056；Ikeetal.(1983)NucleicAcidRes.11:477)。另外，本发明多肽的编码序列的片段文库可以被用于产生多样性的多肽群，用于筛选随后的变体选择。例如，可以如下产生编码序列片段的文库在每个分子仅发生约一次切割的条件下用核酸酶处理感兴趣的编码序列的双链PCR片段，变性双链DNA，将DNA复性形成双链DNA(其可包含来自被不同切割的产物的有义/反义对)，通过用Sl核酸酶处理从再形成的双链体上去除单链部分，并将得到的片段文库连接进表达载体中。通过该方法，可以得到下述表达文库，所述表达文库编码感兴趣的蛋白的不同大小的N-末端和内部片段。本领域已知有若干种技术可用于筛选组合文库(其通过截短的点突变制造)的基因产物，和用于筛选cDNA文库以获得具有选定特性的基因产物。用于筛选大基因文库的、适用于高通量分析的、最广泛使用的技术典型地包括将基因文库克隆进可复制的表达载体中，用得到的载体文库转化合适的细胞，和在下述条件下表达组合基因，所述条件下想要的活性的检测简化了编码基因(其产物被检测)的载体的分离。循环总体诱变(Recursiveensemblemutagenesis,REM)，一种增强文库中功能突变体频率的技术，可以与筛选检验组合使用以鉴定本发明蛋白的变体(ArkinandYourvan(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:7811-7815；Delgraveetal.(1993)ProteinEngineering6(3):327-331)。根据本发明的多核苷酸的片段也可包括不编码功能多肽的多核苷酸。这类多核苷酸可作为PCR反应的探针或引物作用。根据本发明的核酸无论是编码功能多肽还是无功能的多肽，均可被用作杂交探针或聚合酶链式反应(PCR)引物。不编码具有根据本发明的脂肪分解活性的多肽的本发明核酸分子的用途尤其包括(1)从cDNA文库分离编码蛋白的基因或其等位基因变体(2)与中期染色体涂片原位杂交(例如FISH)以提供基因的精确染色体定位，如Vermaetal.,HumanChromosomes:aManualofBasicTechniques，PergamonPress，NewYork(1988)所述；(3)Northern印迹分析，用于检测mRNA在特定组织和/或细胞中的表达；和4)能够被用作诊断工具来分析给定的生物(例如组织)样品中核酸存在的探针和引物，所述核酸能与跟定生物(例如组织)样品中的探针杂交。本发明还包括获得根据本发明的基因的功能等同物的方法。这类方法需要获得被标记的含有被分离的核酸的探针，所述被分离的核酸编码下述蛋白序列的全部或部分，所述蛋白序列是根据在根据SEQIDNO:2的氨基酸序列中的成熟多肽或它们的任何的变体的蛋白序列；在允许探针与文库中的核酸片段杂交从而形成核酸双链体的条件下，用被标记的探针筛选核酸片段文库，和从任何被标记的双链体中的核酸片段制备全长的基因序列，以获得与根据本发明的基因相关的基因。宿主细胞在另一实施方式中，本发明包括细胞，例如含有根据本发明的多核苷酸或含有根据本发明的载体的经转化的宿主细胞或重组宿主细胞。“经转化的细胞”或“重组细胞”是其中(或其祖先中)已经借助于重组DNA技术引入了本发明核酸的细胞。原核和真核细胞均包括在内，例如细菌、真菌、酵母等等。宿主细胞还包括，但不限于哺乳动物细胞系如CH0、VER0、BHK、HeLa、C0S、MDCK、293、3T3、WI38和脉络丛细胞系。公众可获得多种适用于稳定转染哺乳动物细胞的载体，用于构建这类细胞系的方法也是公众已知的，例如Ausubeletal.(上文)中。特别优选的是来自丝状真菌的细胞，特别是Aspergillus禾中，例如Aspergillusniger或oryzaeorawamori。可选用调控插入序列表达并以特异的、期望的方式修饰或加工基因产物的宿主细胞。蛋白产物的这类修饰(例如糖基化)和加工(例如切割)可促进蛋白发挥最佳功能。多种宿主细胞具有用于翻译前加工和修饰蛋白和基因产物的特性和特异机制。可选用分子生物学和/或微生物学领域技术人员熟悉的适当细胞系或宿主系统，以确保对所表达的外源蛋白的想要的和正确的修饰与加工。为此，可以使用具有下述细胞机制的真核宿主细胞，所述细胞机制用于适当地加工原始转录本、糖基化和磷酸化基因产物。这类宿主细胞是本领域公知的。如果想要的话，如上述的细胞可被用在根据本发明的多肽的制备中。典型地，此种方法包括在以提供编码多肽的编码序列表达(通过载体)的条件下培养重组宿主细胞(例如用上述的表达载体转化或转染)；和任选地，从细胞或培养基中回收，更优选地回收并纯化产生的多肽。本发明的多核苷酸可被整合进重组可复制载体，例如表达载体中。载体可被用来在适宜的宿主细胞中复制核酸。因而，在另外的实施方式中，本发明提供了制造本发明的多核苷酸的方法，其通过将本发明的多核苷酸引进可复制载体中，将载体引进适宜的宿主细胞中并在致使载体复制的条件下培育宿主细胞。载体可从宿主细胞中回收。优选地，多肽是作为分泌蛋白产生的，在这种情况下，在表达构建体中的编码多肽成熟形式的核苷酸序列可操作地与编码信号序列的核苷酸序列连接。优选地，信号序列对编码多肽的核苷酸而言是天然的(同源的)。或者，信号序列对编码多肽的核苷酸而言是夕卜来(异源的)，在这种情况下，信号序列优选地对其中根据本发明的核苷酸序列被表达的宿主细胞而言是内源的。针对酵母宿主细胞的合适的信号序列的例子是得自酵母α因子基因的信号序列。类似地，针对丝状真菌的合适的信号序列是例如得自丝状真菌淀粉葡糖苷酶(AG)基因的信号序列，例如A.nigerglaA基因。这可结合淀粉葡糖苷酶(还被称为葡萄糖淀粉酶)自身，以及结合其他启动子使用。就本发明上下文，还可使用杂交信号序列。优选的异源分泌前导序列是源于真菌淀粉葡糖苷酶(AG)基因(18和M个氨基酸的两个版本的glaA，例如来自Aspergillus)、α因子基因(酵母，例如Saccharomyces和Kluyveromyces)或α淀粉酶基因(Bacillus)的那些。载体可被转化或转染进如上述的合适的宿主细胞中，以提供对本发明的多肽的表达。该方法可包括在以提供通过编码多肽的编码序列的载体表达的条件下，培育用上述的表达载体转化的宿主细胞。本发明因而提供了下述宿主细胞，所述宿主细胞用本发明的多核苷酸或载体转化或转染或者包含本发明的多核苷酸或载体。优选地，多核苷酸被带进载体，用于多核苷酸的复制和表达。选择与所述载体适宜的细胞，所述细胞是例如原核(例如细菌)、真菌、酵母或植物细胞。还可选择异源宿主，其中本发明的多肽以基本不含可能干扰应用的酶活性(例如无淀粉降解、纤维素降解或半纤维素降解酶)的方式生产。这可通过选择不会正常生产此类酶的宿主实现。本发明包括生产本发明的多肽的方法，其通过重组表达编码多肽的DNA序列的方式实现。针对该目的，本发明的DNA序列可用于基因扩增和/或表达信号的交换，例如启动子、分泌信号序列，以允许多肽在合适的同源或异源宿主细胞中经济的生产。同源宿主细胞是这样的宿主细胞，其是与DNA序列所源自的物种相同的物种或是相同物种内的变种。合适的宿主细胞优选地是原核微生物例如细菌，或更优选地是真核生物，例如真菌，例如酵母或丝状真菌或植物细胞。总之，酵母细胞比真菌细胞更优选，因为它们更易于操作。但是，一些蛋白或者从酵母中分泌贫乏或者在一些情况下不被正确处理(例如酵母中的过糖基化)。在这些情况下，应选择真菌宿主生物。宿主细胞可过表达多肽，用于设计过表达的技术是熟知的。宿主可因而具有编码的多核苷酸的两个或多个拷贝(并且载体可因而具有相应的两个或多个拷贝)。因而，在本发明的一个实施方式中，根据本发明的重组宿主细胞能表达或过表达根据本发明的多核苷酸或载体。根据本发明，可通过在常规营养发酵培养基中培养根据本发明的宿主细胞，来实现本发明的多肽的生产，所述宿主细胞已用本发明的一个或多个多核苷酸转化。根据本发明的重组宿主细胞可使用本领域已知的程序培养。针对启动子和宿主细胞的每个组合，有益于编码多肽的DNA序列的表达的培养条件是可获得的。在达到期望的细胞密度或多肽效价后，使用已知的程序停止培养并回收多肽。发酵培养基可包含已知的培养基，所述培养基含有碳源(例如葡萄糖、麦芽糖、糖蜜等等)、氮源(例如硫酸铵、硝酸铵、氯化铵等等)和有机氮源(例如酵母提取物、麦芽提取物、蛋白胨等等)和无机养分源(例如磷酸盐、镁、钾、锌、铁等等)。适当的培养基的选择可基于表达宿主的选择和/或基于表达构建体的调节需求。此类培养基是为本领域技术人员已知的。如果需要的话，培养基可含有其他成分，所述成分对于其他潜在的污染微生物而言利于经转化的表达宿主。发酵可在0.5-30天的时间上进行。其可以是合适地在例如从大约0到45°C的范围内的温度下和/或在例如从大约2到大约10的pH下的分批、连续或补料分批工艺。优选的发酵条件是在从大约20°C到大约37°C的范围内的温度和/或从大约3到大约9的pH。选择适当的条件通常基于表达宿主的选择和将被生产的蛋白。发酵后，必要时，可通过离心或过滤手段从发酵液中去除细胞。在发酵已停止后或细胞去除后，可接着回收本发明的多肽，并且必要的话，通过常规手段纯化并分离所述多肽。本发明现将通过实施例的方式进一步阐释，但不应理解为限制本发明。实施例材料和方法體脂肪分解活性(DLU)单位定义一个DLU被定义为在测试条件(pH8.5，37°C)下每分钟释出1微摩尔对硝基苯酚的酶的量。检验用发色底物棕榈酸对硝基苯酯(pNPP)在检验中测定脂肪分解活性。将底物(SigmaN2752)溶解在2-丙醇(3mg/mL)中。剧烈搅拌同时，将3.5mL的该溶液逐滴添加至含有TritonX-100的pH8.5的46.5mL100毫摩尔/1TRIS缓冲液中。在t=0的时亥IJ，将50μL样品与ImL底物溶液混合。当在37°C下孵育时，对照样品空白，在405nm下测量吸收改变。曲线的线性部分的斜率(ΔOD/时间)用作活性的测量。以DLU(DSMLipaseUnits)表示活性。脂肪酶活性(PLI)单位定义一个PLI脂肪酶单位是在37°C和pH7.5下每分钟从经中和的橄榄油乳液中释放Iymol游离脂肪酸的酶的量。_在酶孵育期间，产生的游离脂肪酸用氢氧化钠滴定至7.5的恒定pH。使用的氢氧化钠的量与形成的游离脂肪酸的量成正比并因而与脂肪酶活性成正比。为获得可靠数据，应使用低酸度的橄榄油(Sigmacatnr01514)并且橄榄油乳液应满足特定的液滴大小需求。利用UltraTurrax通过将50ml的橄榄油与50ml的聚乙烯醇溶液(来自Iihone-Poulenc的Rhodoviol25/140/Prolabocatnr20954295)和25ml的水混合获得乳液。不应该存在超过10微米直径的油滴，10到20%的液滴应具有在4到9微米之间的直径并且80%的液滴应具有小于4微米的直径。最终孵育混合物含有7.5ml橄榄油乳液、5.OmlCaCl2溶液(3.675gCacl2.2H20/250ml)、1.Oml白蛋白溶液O00g/1)和11.5ml水。在pH-恒定计装置(Radiometer,Copenhagen,Denmark)中方便地进行测量。纤维素酶活性(CXU)单位定义一个CXU是在给出还原糖的量相当于0.5mg葡萄糖的测试条件下，每小时水解一个羧甲基纤维素(CMC)的量的酶的量。■用二硝基水杨酸定量测定形成的还原糖的量。通过将18g的CMC(BlanoseR.110，NovacelParis,France)在加有IOOml的pH4.6乙酸盐缓冲液的900ml水中悬浮1小时来制备CMC底物，随后过滤颗粒物。二硝基水杨酸溶液如下制备。(A)将13.5g的NaOH颗粒溶解在300ml水中。(B)将8.8g的二硝基水杨酸在60°C下溶解在400ml水中，添加溶解在400ml水中的225g的KNa-酒石酸盐并混合。(C)然后将300mlNaOH溶液与二硝基水杨酸/KNa-酒石酸盐溶液混合。(D)制备溶液使2.2gNaOH颗粒和IOg100%苯酚掺在IOOml的水中，并且另外制备亚硫酸盐溶液使37.5gNaHSO3掺在IOOml的水中。为制备二硝基水杨酸工作溶液，将69ml的溶液(D)与溶液(C)混合并添加23.2ml的NaHSO3溶液。制备后5天可使用该混合物。通过将Iml的CMC溶液添加到ImL的样品溶液中进行酶孵育并在37°C下孵育60分钟。通过将Iml的lmol/1NaOH添加至Iml的孵育混合物来终止反应。然后添加3ml的二硝基水杨酸工作溶液，混合并在沸水中加热5分钟，在自己冷却后，将19ml的水添加至混合物中。最后，在MOnm下在分光光度计中测量吸光度。淀粉葡糖苷酶活性(AGI)CN102549150A单位定义一个淀粉葡糖苷酶单位(AGI)是在测试条件下每分钟释出1微摩尔葡萄糖的酶的量。_为测定淀粉葡糖苷酶的活性，制备了下述试剂。淀粉底物1.6g的淀粉(Merckcat.No.1252)悬浮在IOmL的冷水中。随后，其被倒进50mL的沸水中。煮沸2分钟后冷却至室温，添加2mL的乙酸缓冲液Omol/L，pH4.3)。检查PH并且必要的话，用4mol/L乙酸或4mol/L的NaOH调至pH4.3。邻甲氧基苯胺溶液将660mg邻甲氧基苯胺盐酸盐(SigmaB3252)溶解在IOOmL水中。葡萄糖氧化酶-过氧化物酶试剂5000单位葡萄糖氧化酶(SigmaG6125)和1200单位过氧化物酶(SigmaP8125)溶解在900mL的水中。连续添加并溶解13.8g的磷酸氢二钠(hq)、6.42g磷酸二氢钠(Iaq)和6.IOg三(羟甲基)氨基甲烷。通过添加100g/L磷酸，将溶液的pH调至7.0。在用水将体积配至IOOOmL后，再次混合溶液。显饩试布丨将99份的葡萄糖氧化酶-过氧化物酶试剂与1份的邻甲氧基苯胺溶液混合。检验混有2mL淀粉底物的2mL样品在60°C下孵育15分钟。通过添加20mL0.005mol/LNaOH溶液停止反应。通过ImL的孵育物与4mL的显色试剂混合，测定葡萄糖含量。在37°C下孵育10分钟后，通过添加5mL的5mol/L硫酸停止反应。在540nm下测量吸光度。用在25-150μg/mL范围内的标准溶液使用葡萄糖标定线来计算葡萄糖含量。标准溶液直接用用显色试剂显色。实施例1生产本发明的脂肪酶通过构建构建含有DNA序列的表达质粒，用该质粒转化Aspergillusniger菌株并以下述方式培育A.niger菌株，来获得由本文中提供的核苷酸序列SEQIDN0:1(DNAL01)、SEQIDNO:3(DNAL02)、SEQIDNO:5(DNAL03)、SEQIDNO:7(DNAL04)编码的月旨肪分解酶L01、L02、L03、L04。将A.niger菌株的新鲜孢子(IO6-IO7)在20mlCSL-培养基(100ml长颈瓶，隔板)中接种并在34°C和170rpm下培育20-小时。将5_10mlCSL预培养基在IOOml的CSM培养基(500ml长颈瓶，隔板)中孵育后，将菌株在34°C和170rpm下发酵3_5天。通过在4°C下在5000xg下离心发酵液30分钟获得无细胞的上清液。无细胞的上清液在_20°C下存储直到使用。任选地，将上清液在GF/AWhatmarm玻璃纤维滤纸(150mm0)上进一步过滤，以去除较大的微粒物。如果必要的话，用4NKOH将上清液的pH调至pH为5并用抽吸在0.2μm(真空(bottle-top))过滤器上无菌过滤，以去除真菌材料。CSL培养基由(每升的量)100gCornSteepSolids(Roquette)UgNaH2P04*H20、0.5gMgS04*7H20、IOg葡萄糖*H20和0.25gBasildon(消泡剂)组成。将各成分溶解在去矿物水中并用妝0!1或压504将？!1调至pH5.8；将具有隔板和泡沫球的100ml长颈瓶用20ml发酵液装填并在120°C下灭菌20分钟，之后将含有5000IU/ml青霉素和5mg/ml链霉素的200μ1无菌溶液添加至冷却至室温后的每个长颈瓶。CSM培养基由(每升的量)150g麦芽糖*H20、60gSoytone(蛋白胨)、IgNaH2P04*H20、15gMgS04*7H20、0.08gTween80、0·02gBasildon(消泡剂)、20gMESUgL-精氨酸组成。将各成分溶解在去矿物水中并用NaOH或将pH调至pH为6.2；将具有隔板和泡沫球的500ml长颈瓶用IOOml发酵液装填并在120°C下灭菌20分钟，之后将含有5000IU/ml青霉素和5mg/ml链霉素的Iml无菌溶液添加至冷却至室温后的每个长颈瓶。实施例2纯化本发明的脂肪分解酶实施例1中获得的冷冻的无细胞上清液融化后，上清液在4°C下彻底离心以去除任何固体。为去除低分子量污染物，使用装备有具有IOkDa截留分子量(cut-off)的过滤器的MilliporeLabscaleTFF系统超滤上清液。用40ml体积的包含0.5mMCaCl2,pH为6.0的冷的IOOmM磷酸缓冲液洗涤3-5次样品。酶溶液的最终体积为30ml并且其还被称为“超滤液”。为进一步纯化，可将超滤液应用至MonoQ阴离子交换柱。在20个柱体积上盐梯度被设为IMNaCL0缓冲液是70mMBis-TRIS和50mMTRIS的混合物。pH用0.IMHCl设定。令人吃惊地，观察到，当在pH=9下进行纯化，获得最佳结果，其中在35mS/cm的电导率下洗脱脂肪酶。使用Bradford方法(TheProteinProtocolsHandbook,2ndedition,EditedbyJ.M.Walker,HumanaPressInc,Totowa2002，pl5_21)测定样品的总蛋白含量。实施例3烘焙实骀——荷S樽制面何L01、三酰基甘油H旨肪_、乡千维素Sl禾苷Sl的組合4勿对面团禾ng^V件质的作用荷兰模制面包如下制备。将3500g的面粉Q800gKolibri+700gIbis)、基于面粉的58%w/w的水、80g压缩酵母、90g的面包改进剂(包含35%酶活化豆粉、30%面粉、18%乳清粉、7%油、10%右旋糖)、70g的盐(NaCl)、40ppm抗坏血酸(基于面粉重量)、7ppm(基于面粉重量)BakezymeP500(真菌α-淀粉酶)、20ppm(基于面粉重量)BakezymeHSP6000(真菌半纤维素酶)和各种如在表1中示出的酶或SSL在Diosna混合器上在速度1下混合2分钟并在速度2下125kWh，达到最终面团温度为约^°C。将880g的面团块弄成圆形并在34°C和85%的相对湿度下发面(proof)40分钟。随后在38°C和85%相对湿度(R.H.)下将面团制模、成型、放入平底锅并发面75分钟。将完全发面的面团在下的烤箱中烘焙30分钟。在冷却至室温后，通过自动面包体积分析仪(BVM-3，TexVolInstruments)测定条块的体积。空白面包的条块体积被定义为100%。如在表2中示出的，由有经验的烘焙者用手和在视觉上评价其他效果。表1在实验中使用的其他酶或SSL的量权利要求1.一种烘焙酶组合物，其包含脂肪分解酶，所述脂肪分解酶是经分离的多肽，所述多肽包含(a)从根据SEQIDNO:2的氨基酸序列得到的成熟多肽的氨基酸序列；或该成熟多肽的功能等同物的氨基酸序列，所述功能等同物具有与从根据SEQIDNO:2的氨基酸序列得到的成熟多肽至少80或90%同源的氨基酸序列；或(b)由多核苷酸编码的氨基酸序列，所述多核苷酸包含(a)如在SEQIDNO1中展示的核苷酸序列；或其功能等同物，所述功能等同物与SEQIDNO1的核苷酸序列具有至少80或90%的同源性；或(b)核苷酸序列，其与SEQIDNO:1的互补体的多核苷酸杂交，并且其中所述核苷酸序列与SEQIDNO1的核苷酸序列至少80或90%同源；或(c)核苷酸序列，其编码从根据SEQIDNO:2的氨基酸序列得到的成熟多肽或多肽功能等同物，所述多肽功能等同物与SEQIDNO:2的氨基酸序列中的成熟多肽具有至少80或90%的同源性；或(d)作为遗传密码简并的结果，与如在(a)、(b)、(c)的任一中定义的序列简并的序列；或(e)核苷酸序列，其是如在(a)、(b)、(c)或(d)中定义的核苷酸序列的互补体；并且其中所述组合物还包含三酰基甘油脂肪酶。2.根据权利要求1的烘焙酶组合物，其还包含半纤维素酶或纤维素酶，优选地包含纤维素酶。3.根据权利要求1或2的任一项的烘焙酶组合物，其还包含淀粉葡糖苷酶。4.根据权利要求1至3的任一项的烘焙酶组合物，其还包含两种或多种三酰基甘油脂肪酶的组合物。5.包含根据权利要求1至4的任一项的烘焙酶组合物、面粉和一种或多种面团添加剂或面包添加剂的预混合物。6.制备面团的方法，其包括将根据权利要求1至5的任一项的烘焙组合物或预混合物添加到至少包含面粉、水和酵母的面团成分中。7.包含面粉、水、酵母和有效量的根据权利要求1至6的任一项的烘焙酶组合物或预混合物的面团。8.根据权利要求7的面团，其包含相对于每kg面粉至少3.57DLU单位的脂肪分解酶，优选地至少7.15DLU/kg面粉，更优选地至少14.30DLU/kg面粉，并优选地包含至多143DLU/kg面粉的脂肪分解酶，更优选地至多71.50DLU/kg面粉，最优选地至多35.75DLU/kg面粉的脂肪分解酶。9.根据权利要求7或8的任一项的面团，其包含相对于每kg面粉至少80PLI单位的三酰基甘油脂肪酶，优选地至少160PLI/kg面粉，更优选地至少320PLI/kg面粉，并优选地包含至多3200PLI/kg面粉的三酰基甘油脂肪酶，更优选地至多1600PLI/kg面粉，最优选地至多800PLI/kg面粉的三酰基甘油脂肪酶。10.根据权利7至9的任一项的面团，其包含相对于每kg面粉至少2.34CXU单位的纤维素酶，优选地至少4.68CXU/kg面粉，更优选地至少7.5CXU/kg面粉，甚至更优选地至少9.36CXU/kg面粉，甚至更优选地至少15CXU/kg面粉，最优选地至少23.4CXU/kg面粉，并优选地包含至多300CXU/kg面粉的纤维素酶，优选地至多150CXU/kg面粉，更优选地至多93.6CXU/kg面粉，甚至更优选地至多75CXU/kg面粉，甚至更优选地至多46.8CXU/kg面粉，最优选地至多30CXU/kg面粉的纤维素酶。11.根据权利要求7至10的任一项的面团，其包含相对于每kg面粉至少130AGI单位的淀粉葡糖苷酶，优选地至少^OAGI/kg面粉，更优选地至少520AGI/kg面粉，并优选地包含至多5200AGI/kg面粉的淀粉葡糖苷酶，更优选地至多^00AGI/kg面粉，最优选地至多1300AGI/kg面粉的淀粉葡糖苷酶。12.根据权利要求7至10的任一项的面团，其基本不含SSL和/或CSL。13.制备烘焙产品的方法，其包括烘焙根据权利要求7至12的任一项的面团的步骤。14.通过烘焙根据权利要求7至13的任一项的面团可获得的烘焙产品。15.根据权利要求1至5的任一项的烘焙组合物或预混合物在面团或因此得到的烘焙产品的生产中替代乳化剂的用途，优选地替代SSL的用途。全文摘要本发明涉及烘焙酶组合物，所述烘焙酶组合物包含对甘油三酯、磷脂和半乳糖脂具有活性的脂肪分解酶、三酰基甘油脂肪酶和优选地选自半纤维素酶或纤维素酶和淀粉葡糖苷酶的至少另一种酶，所述烘焙酶组合物可被用来完全替代面团和烘焙产品中的SSL和/或CSL或其他乳化剂。其中该烘焙酶组合物被以有效量添加的面团和因此获得的烘焙产品具有改进的性质(例如极好的面团稳定性和抗冲击性)和烘焙产品的改进的体积、碎屑结构和碎屑柔软性以及改进的抗陈化性。文档编号C12N9/20GK102549150SQ201080039562公开日2012年7月4日申请日期2010年9月2日优先权日2009年9月3日发明者卡罗琳·汉德林·玛丽亚·本斯朝珀·范,简·德克·雷内·希勒,阿利亚·格瑞特·特鲁申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司