专利名称：用于鉴别和制备(R)-特异性ω-转氨酶的方法
用于鉴别和制备(R)-特异性ω-转氨酶的方法
发明内容
本发明涉及用于筛选、表征和制备(R)-特异性ω-转氨酶的方法，由此获得的 ω-转氨酶及其在各种氨基转移过程中的应用。手性胺在制药、农用化学和化学工业中发挥着重要作用。它们常被用作中间体或合成子(synthones)以制备各种生理学，如药学活性物质，如头孢菌素或吡咯烷衍生物。在手性胺的众多应用中，仅有一种特定的光学活性形式((R)或(S)对映体)具有生理学活性。因此，需要提供一种制备光学活性形式的手性胺的方法。这些需求通过以下方法得到部分满足，即通过加入手性羧酸使非对映体盐结晶来制备手性胺(Breuer et al.，Angewandte Chemie (2004) 116，806-843)。其它化学方法使用通过还原含C = N双键的前手性前体的对映选择性合成。在已用于合成光学活性氨基酸和胺的若干酶促方法中，由于其用于光学活性胺的不对称合成的潜力，ω-转氨酶(ω-TAs)最近已得到更多关注，其常被用作多种药物制备的结构单元(building blocks)。ω -转氨酶是PLP (磷酸吡哆醛)依赖性酶，其催化氨基转移反应。当采用ω -转氨酶时，主要可经由两种反应策略来制备所谓的对映体富集和/或纯光学活性胺(i)从酮起始的不对称合成，和(ii)从外消旋胺起始的动力学拆分。虽然ω-转氨酶总体上显示出良好的对映选择性，但它们尚未被频繁地用在不对称合成中，尽管在不对称合成中理论上可能的产率是100%。使用ω-转氨酶的不对称合成的一个特殊要求是平衡向产物侧移动，特别是当使用诸如丙氨酸等氨基酸作为氨基供体时，因为在此情况下平衡状态在底物 (酮、丙氨酸)侧，而不在产物(胺、丙酮酸盐)侧；另一个要求是酶必须具有最佳的对映选择性，而ω-转氨酶并非一向如此。因此，ω-转氨酶主要用于外消旋胺的动力学拆分，其中不需要最佳的对映选择性。因此，虽然已经研究了外消旋胺的动力学拆分，但50%最大产率的限制很大程度上阻碍了其应用。另一方面，不对称合成需要将不利的平衡向合成光学纯胺的单个对映体的方向移动，这是能够在工业规模上使用转氨酶的有效方法的一个重要先决条件。WO 2007/093372公开了这类方法。EP 0 987 332 Al公开了通过微生物酶，特别是源自节杆菌(Arthrobacter sp.) 的(R)-选择性ω-转氨酶来制备光学活性氨基化合物，8卩(R)-氨基化合物的方法。EP 1 038 953 Al公开了另一种(R)-选择性ω-转氨酶，但其源自金色分支杆菌(Mycobacterium aurum)。Iwasaki 等(Biotechnol. Let. 2003 (25) , 1843-1846) , Koszelewski 等 (Adv. Synth. Catal. 2008 (350),2761-2766)禾口 Iwasaki 等(Appl.Microbiol. Biotechnol. 2006 (69), 499-505)公开了源自节杆菌的R-特异性转氨酶。通常通过选择得自于如土壤样品的微生物并在培养中将其富集来完成提供有用(S)-或(R)-选择性转氨酶的微生物的鉴别(Jun 等，App. Microbiol. Biotechnol. 2004(70)，2529-2534 和 Shin 等(Biosc. Biotechnol. Biochem. 2001 (65)，1782-1788))。特别地，全部所述的 R-选择性 ω_转氨酶均通过富集培养获得。此种方法耗时，这是因为对于有效的方法，通常优选在诸如大肠杆菌(Escherichia coli)等异源生物体中过表达酶。这需要从野生型生物体中分离基因序列，但DNA序列的克隆不总能成功并且是极为耗时的过程。特别地，在工艺开发和新型ω-ΤΑ的鉴别期间，酶的纯化及其酶促性质的表征很受人关注。然而，由于通常通过诸如HPLC或毛细管电泳(CE)等低通量方法确定ω-ΤΑ活性，所以在一定程度上，酶性质的确定通常是限速步骤。通常，相比于(S)-选择性ω-转氨酶，可用的(R)-选择性ω-转氨酶的数量更受限制。这与对(R)-选择性ω-转氨酶的高需求形成了鲜明的对比，所述(R)-选择性ω-转氨酶对于各种手性胺的(R)-对映体的不对称合成非常适合。因此，仍需要提供其他(R)-选择性ω-转氨酶以及获得它们的装置和方法，从而产生诸如用于制药或农用化学应用中的 R-对映体，特别是光学活性胺，但这些至今仍根本无法获得或无法以经济上可行的方法，优选以工业规模获得。因此，基于以上技术问题，本发明提供了简单、快速和可靠的装置和方法，以鉴别、 表征和获得(R)-选择性ω-转氨酶，特别是用于生产所需的(R)-对映体，优选光学纯形式，所述装置和方法优选适用于工业规模的鉴别、表征和制备。本发明通过提供独立权利要求中的教导，特别是所要求保护的方法以及由此获得的产品和应用解决了其技术问题。因此，在具体实施方式
中，本发明的教导提供了用于制备(R)-选择性ω-转氨酶 (也称为ω-ΤΑ)的方法，其包括以下步骤a)提供至少一种转氨酶或裂解酶，优选属于折叠IV型的PLP依赖性酶(fold-type IV of PLP-dependent enzymes)的转氨酶或裂解酶的至少一个查询生物分子序列(query biomolecule sequence),禾口至少一个生物分子库，b)用所述查询生物分子序列检索所述生物分子库，以鉴别出第一靶生物分子序列组，其中以氨基酸水平计算，所述第一靶生物分子序列与所述查询生物分子序列具有至少 20%，优选32%的序列相同性，c)在所述第一靶生物分子序列组中选择第二生物分子靶序列组，所述第二生物分子靶序列组在氨基酸水平上不包含以下氨基酸序列基序(Hiotives)Cl)至c3)中的至少一种，其中cl)在95位至97位的氨基酸序列Tyr Xal Xa2，其中Xal为氨基酸Ile、Val、Leu、 Met、Phe，且Xa2为氨基酸Arg或Lys，或者c2)在97位至99位的氨基酸序列Tyr Xaa Gln，其中Xaa为氨基酸，优选为常规氨基酸，和在105位至111位，优选在107位至109位区域中的氨基酸序列Arg Xaa Xa3，其中Xa3为氨基酸，优选为His，或者c3)在38位的Thr、在97位的Lys和在107位至109位的氨基酸序列Arg Xa4Xa5， 其中Xa4为氨基酸，优选为Gly，且Xa5为氨基酸，优选为Tyr，而包含c4)在95位除Tyr、Arg、Lys外的另一种氨基酸，或在95位的Tyr，但在97位无 Arg 或 Lys,且 c5)在 40 位无 Lys 或 Arg，且 c6)在161位至165位区域中，优选在163位的Lys，
以鉴别出第二靶生物分子序列组，和d)提供，优选制备这样的生物分子，其具有在步骤C)中鉴别的第二生物分子靶序列，且为具有(R)-选择性ω-转氨酶活性的蛋白或至少部分编码具有(R)-选择性ω-转氨酶活性的蛋白。术语“为……或至少部分编码蛋白的生物分子”优选是指所述生物分子可为具有 (R)-选择性ω -转氨酶活性的蛋白，或在此生物分子为核苷酸序列的情况下，至少部分的所述核苷酸序列编码所述蛋白，优选全长蛋白。因此，在所提供的生物分子为核苷酸序列分子的情况下，至少部分的所述核苷酸序列编码具有(R)-选择性ω-转氨酶活性的蛋白，因此可能另一部分的所述核苷酸分子具有一些其它功能，如调节或复制功能。因此，术语“提供这样的生物分子，其具有在步骤C)中鉴别的第二生物分子靶序列，且为具有(R)-选择性 ω_转氨酶活性的蛋白或至少部分编码具有(R)-选择性ω-转氨酶活性的蛋白”优选等同于术语“提供这样的生物分子，其具有在步骤c)中鉴别的第二生物分子靶序列，所述生物分子可为具有(R)-选择性ω-转氨酶活性的蛋白，或可为包含编码所述蛋白的序列的核苷酸序列分子，只要所述蛋白具有(R)-选择性ω-转氨酶”。在本发明的一个实施方式中，在步骤c2)中，Arg Xaa Xa3_基序可与107位至109 位相差1-2个氨基酸，即Arg Xaa Xa3-基序可在105位至111位。在本发明的一个实施方式中，在步骤c6)中，Lys的位置可与163位相差1_2个氨基酸，即Lys可在161位至165位。在本发明上下文中，除非另有说明，所给出的每个氨基酸序列，无论使用何者，特别是给出的氨基酸序列基序，或DNA序列或DNA序列基序，都是从氨基端至羧基酸，或5'至 3'方向。优选地，无论使用何者，以给定方向给出的序列均作为连续片段给出，而没有任何插入的核苷酸或氨基酸。在本发明的优选实施方式中，步骤a)中所使用的至少一种转氨酶的至少一个查询生物分子序列优选为(R)-选择性ω-转氨酶。在另一优选实施方式中，步骤a)中所使用的至少一种转氨酶的至少一个查询生物分子序列选自(R)-选择性ω-转氨酶、支链氨基酸氨基转移酶(BCAT)和D-氨基酸转氨酶(DATA)。优选地，所述支链氨基酸氨基转移酶来自大肠杆菌。在本发明的优选实施方式中，步骤a)中所使用的至少一种裂解酶的至少一个查询生物分子序列为氨基脱氧分支酸裂解酶(ADCL)。本发明提供了以快速、有效、简单、可靠且简便的方式制备(R)-选择性ω-转氨酶的方法。因此，本发明能够鉴别并制备(R)-选择性ω-转氨酶，这是以前不知道或无法达到的，由此获得了提供手性胺，优选(R)-对映体的多种途径，特别是非常有效的不对称合成途径。与预期相反，其能够成功地显示，事实上即便是与已知的(R)-选择性ω-转氨酶具有低序列相同性，如仅35%序列相同性的蛋白也为(R)-选择性ω-转氨酶。优选地，本发明能够以特别有利且预想不到的方式提供了来自土曲霉(Aspergillus terreus)和百脉根根瘤菌(Mesorhizobium Ioti)的(R)-选择性ω-转氨酶，其中来自曲霉(Aspergillus) 的转氨酶为第一真核生物ω-转氨酶且以(R)-选择性的方式转化底物。基本上，本发明基于以下教导即便是与已知转氨酶或裂解酶，特别是(R)-选择性ω-转氨酶具有低序列相同性的蛋白或其编码核苷酸序列也能用作潜在来源以鉴别和制备(R)-选择性ω-转氨酶，其中通过区分不希望的蛋白并由此阳性选择在氨基酸序列中显示导致所需酶促活性的特定序列基序的蛋白来筛选和制备推定的(R)-选择性ω-转氨酶。因此，本发明具体地使用了特定的结构特征，特别是推定的(R)-选择性ω-ΤΑ中特定氨基酸的缺失和存在，以鉴别和制备(R)-选择性ω-转氨酶。因此，在本发明方法的第一步骤a)中，提供了至少一种转氨酶或裂解酶，如已知的(R)-选择性ω-转氨酶的查询生物分子序列，或至少此类裂解酶或转氨酶，优选(R)-选择性ω-转氨酶的特征序列部分，其特别优选能够鉴别折叠IV型的PLP依赖性酶，以及至少一种生物分子库。优选地，查询生物分子序列为转氨酶或裂解酶，特别为(R)-选择性 ω-ΤΑ的ORF(开放阅读框)，其编码核苷酸序列或其特征部分。在另一实施方式中，查询生物分子序列为ORF-氨基酸序列本身或其特征部分。在本发明的上下文中，至少一种转氨酶或裂解酶，特别是已知的(R)-选择性 ω-转氨酶的查询生物分子序列的特征部分为这样的生物分子序列，其DNA序列分子的形式在以下条件下与全长查询生物分子序列，特别是与ORF的DNA序列杂交。用于诸如DNA等核酸杂交的方法是已知的，且描述在如Molecular Cloning, Third Edition(2001) ；Methods for General and Molecular Bacteriology, ASM Press (1994)； Immunology methods manual, Academic Press (Molecular)禾口许多其它标准教材中。严谨条件下杂交的实例如下。在42°C下，将其上固定有核酸的滤器和用作探针的核酸在包含50%甲酰胺、5XSSC(750mM氯化钠和75mM柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 7. 6)、 5XDenhardt溶液、10%硫酸葡聚糖和20 μ g/Ι变性鲑鱼精子DNA的溶液中孵育过夜。孵育后，将滤器用0.2 X SSC溶液(约65°C)中清洗。可通过调节甲酰胺浓度(随着甲酰胺浓度降低，条件变得较不严谨)以及改变盐浓度和温度条件来修改这些严谨性杂交条件。在较不严谨条件下的杂交通过例如在37°C下，将其上固定有核酸的滤器和用作探针的核酸在包含6XSSCE(20XSSCE :3mol/l氯化钠、0. 2mol/l磷酸二氢钠和0. 02mol/l EDTA, pH 7. 4)、0. 5% SDS.30%甲酰胺和100 μ g/1变性鲑鱼精子DNA的溶液中孵育过夜， 并将滤器用含0. 1% SDS的IX SSC溶液(50°C )清洗来进行。在特别优选的实施方式中，本发明将术语“至少一种转氨酶或裂解酶的至少一个查询生物分子序列”理解为这样的生物分子序列，其适合用于根据本文定义的序列基序Cl) 至c6)的存在或缺失来选择生物分子序列。因此，这类查询生物分子序列为用于筛选和鉴别下述生物分子序列的序列，所述生物分子序列在氨基酸水平上不包含氨基酸序列基序 cl)至c3)中的至少一个，且在氨基酸水平上包含序列基序c4)、c5)和c6)。这类查询生物分子序列可体现为氨基酸序列信息、或DNA序列分子、或DNA序列信息。在优选实施方式中，步骤a)所用的查询生物分子序列的特征部分包含，优选由以下组成转氨酶，优选(R)"选择性ω -转氨酶，或裂解酶的ORF的30位至170位区域，最优选30位至120位。在随后的步骤b)中，使用所述查询生物分子序列检索所述生物分子库以鉴别出第一靶生物分子序列组，基于氨基酸水平，所述第一靶生物分子序列组与所述查询生物分子序列具有至少20%的的序列相同性，优选25%，优选32%，优选至少33%，最优选34%， 至少35 %，至少36 %，至少40 %，至少50 %，至少60 %，至少70 %和至少80 %，至少90 %或至少95%的序列相同性，且其中所述第一靶生物分子组代表从步骤a)中所用生物分子库的第一次选择。所述的序列相同性优选为所述查询生物分子序列的ORF的至少特征部分，优选基本完整，特别是完整ORF的至少特征部分与所筛选生物分子序列的ORF的至少特征部分，优选基本完整，特别是完整ORF的至少特征部分之间的序列相同性。在所述步骤b) 后，在此第一靶生物分子序列组中，在步骤c)中选择那些序列，其不包含95位至97位的作为序列基序cl)的氨基酸序列Tyr Xal Xa2，其中Xal为氨基酸lie、Val、Leu、Met、Phe, 且Xa2为氨基酸Arg或Lys ；或者其不包含97位至99位的作为序列基序c2)的氨基酸序列Tyr Xaa Gln，其中Xaa为氨基酸，优选常规氨基酸，且在105位至111位，优选107位至 109位区域中，且不包含氨基酸序列Arg Xaa Xa3，其中Xa3为氨基酸，优选常规氨基酸，优选His ；或者其不包含序列基序c3) 38位的Thr、97位的Lys和107位至109位的氨基酸序列Arg Xa4Xa5，其中Xa4为氨基酸，优选常规氨基酸，优选Gly，且Xa5为氨基酸，优选常规氨基酸，优选Tyr，以此来区分和排除体现出以上确定的序列基序cl)、c2)或c3)中至少一个的那些序列。在随后或同时进行的选择中，选择以下那些生物分子序列，所述生物分子序列根据序列基序c4)在95位显示为除Tyr、Arg、Lys外的其它氨基酸，或在95位显示为 Tyr,但在97位不为Arg和Lys，且根据序列基序c5)在40位不为Lys和Arg，且根据序列基序c6)在161位至165位的区域中具有至少一个Lys，优选为一个Lys，优选在163位为 Lys,以此选择和鉴别出第二生物分子靶序列组。由上述确定的序列基序鉴别和筛选出的第二靶生物分子序列组代表作为具有(R)-选择性ω-转氨酶活性的蛋白或编码具有(R)-选择性ω-转氨酶活性的蛋白的生物分子，从而提供所述具有(R)-选择性ω-转氨酶活性的蛋白。在本发明的上下文中，转氨酶为催化氨基转移的磷酸吡哆醛依赖性酶，其优选属于折叠IV型。转氨酶归类为Ε. C. 2. 6.1. X。在本发明特别优选的实施方式中，转氨酶为 (R)-选择性转氨酶，在优选实施方式中，特别地为ω-转氨酶。在本发明的上下文中，具有 (R)“选择性ω -转氨酶活性的蛋白为下述蛋白，其能够在适合反应条件下催化诸如氨基等含氮基团从供体向受体的转移，例如(R)-选择性ω-转氨酶(β-丙氨酸丙酮酸转氨酶) 即能如此。在本发明的上下文中，(R)-选择性ω-转氨酶优选为分类编号Ε. C. 2. 6. 1. 18的酶。在本发明的上下文中，术语“光学活性的手性胺”与术语“对映体活性的手性胺”涉及相同的主题。这些术语特别是指基本上不含不良对映体的制备物，且在更优选的实施方式中是指不含不良对映体的制备物。因此，光学活性的手性胺基本上包含过量的一种对映体，或甚至仅由一种对映体组成。特别地，在本发明的上下文中，光学活性的手性胺具有至少70%、80%、90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99· 5%、99· 6%、99· 7%、99· 8%和特别是至少99. 9%的光学纯度。在本发明中，光学纯度表示为一种对映体超过另一种对映体的过量％。因此，光学纯度％为(R)对映体和(S)对映体浓度之差除以两种对映体浓度之和(Α的光学纯度％ = ([A]-[B]) ([Α] + [Β])χ 100，其中A和B代表(R)对映体和⑶对映体的浓度，反之亦然)。在本发明的上下文中，生物分子库为生物分子本身的来源或生物分子序列数据的集合，特别是多核苷酸或多肽序列数据的集合。在本发明的上下文中，生物分子优选为携带遗传信息的多核苷酸分子，特别是DNA分子。在本发明另一优选实施方式中，生物分子为包含大量氨基酸的多肽，特别是蛋白。因此，生物分子库可为生物分子的物理来源，特别地可为基因库，特别是cDNA或基因组文库， 或为有关所述生物分子的信息集合，特别是序列数据的集合，特别是氨基酸序列或多核苷酸序列数据的集合，特别是DNA序列数据的集合。本发明也涉及生物分子序列、氨基酸序列、多核苷酸序列或核苷酸序列，特别是 DNA序列，因此，所述措辞一方面是指物理物质本身，即蛋白、多肽或DNA分子，另一方面是指所述化学物质的信息内容，其中在多核苷酸的情况下，所述信息内容是指其核苷酸的类型、顺序和数量，且在多肽的情况下，所述信息内容是指形成所述多肽的单个氨基酸的类型、顺序和数量。在本发明的上下文中，术语“生物分子”、“DNA分子”、“多核苷酸分子”、“多肽”或 “蛋白”是指化学物质本身。在此情况下，本发明特别是指氨基酸序列信息、DNA序列信息、 多核苷酸序列信息或生物分子序列信息，其不是指生物分子的物理形式，而是指其中所含的信息，即其组成物(即，氨基酸或核苷酸)的类型、顺序和数量。在一个优选实施方式A)中，在其步骤a)至c)中，本发明适用于作为序列数据集合的生物分子库，在一个实施方式中，所述生物分子库为多核苷酸序列，特别是DNA序列的序列数据集合，或在另一个实施方式中，所述生物分子库为氨基酸序列的序列数据集合，两种序列数据集合均在步骤b)中用序列比对工具，优选如BLAST (基本的局部比对检索工具) 进行检索，以鉴别出第一靶生物分子序列组(Altschul,S. F. et al. 1990. J. Mol. Biol. 215 403 ；Altschul, S. F. et al. 1997. Nucleic Acid Res. 25 :3389_3402)。其它适合的程序包括威斯康辛遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG)，Madison, WI, USA)中的 GAP、BESTFIT 和 FASTA。在进一步的步骤 c)中，对所鉴别的第一生物分子序列组进行进一步的选择步骤，在此期间，使用所鉴别的序列基序由序列基序cl)至c3)进行否定地鉴别和选择，且由序列基序c4)至c6)来肯定地选择所希望的生物分子序列。一旦鉴别出第二组生物分子序列，本发明使用所述序列信息来制备对应的寡核苷酸或多核苷酸分子，如杂交引物，以在物理形式的生物分子库中筛选和选择编码在第二组中所鉴别的酶的DNA序列分子。因此，在优选实施方式中，步骤c)中所得的序列信息可用于从基因组DNA或cDNA文库中克隆对应的基因，以及在诸如大肠杆菌、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、毕赤酵母(Pichia pastoris)等中表达所述蛋白。在本发明另一优选实施方式中，步骤c)中所得的序列信息用于从头(de novo)合成所希望的 (R)-选择性ω-转氨酶。在此类优选实施方式中，可以使用步骤c)中所得的序列信息，通过诸如优化的密码子应用和mRNA稳定性来合成基因，以及克隆和表达此基因。根据此类优选实施方式，可将包含DNA序列信息或氨基酸序列信息的生物分子库用作步骤a)中的至少一个生物分子库。在这种情况下，生物分子库包含DNA序列信息，所述信息或者已被翻译为氨基酸序列信息以根据步骤b)至c)来处理，其中氨基酸序列被用作查询生物分子序列和氨基酸序列基序，或者使用查询生物分子序列和被翻译回DNA序列信息的序列基序cl)至 c6)在DNA序列库中实施所述步骤b)至c)。在本发明的另一优选实施方式中，本发明的教导适用于实施方式B)的步骤a)中的生物分子库，所述生物分子库以物理形式的基因库存在，特别是以诸如cDNA、宏基因组或基因组文库等基因文库存在，使用编码至少一种(R)-选择性ω-转氨酶的全部或至少特征部分的DNA分子，以检索、鉴别和选择第一生物分子序列组，特别是DNA序列分子，其基于氨基酸水平计算与所述查询DNA序列分子具有至少20%，优选32%的序列相同性。随后的步骤c)优选在所述第一组DNA分子中进行，使用核苷酸分子引物来鉴别以及肯定和否定选择所希望序列基序cl)至c6)。在本发明的上下文中，术语“序列基序”是指所要求保护的方法的步骤c)中具体鉴别的推定(R)-选择性ω-转氨酶的氨基酸序列的特异选择性特征。特别地，第一序列基序cl)为在95位至97位中鉴别的序列基序，其为此顺序的氨基酸序列Tyr Xal Xa2，其中 Xal为氨基酸lie、Val, Leu、Met、Phe，且Xa2为氨基酸Arg或Lys，且其根据本发明，其不应存在于最终选择的生物分子序列中。第二序列基序c2)为在97位至99位鉴别的序列基序，其为此顺序的氨基酸序列Tyr Xaa Gln，其中Xaa为氨基酸，和在105位至111位，优选在107位至109位区域的为此顺序的氨基酸序列Arg Xaa Xa3，其中Xaa为氨基酸，且Xa3 为氨基酸，优选为His，且其也不应存在于最终选择的生物分子序列中。第三序列基序c3) 为这样的序列基序，其表征为在38位存在Thr、在97位存在Lys以及在107位至109位存在氨基酸序列Arg Xa4Xa5，其中Xa4为氨基酸，优选为Gly，且Xa5为氨基酸，优选为Tyr，基序c3)不应存在于最终选择的生物分子序列中。第四序列基序c4)要求在95位为除Tyr、Arg、Lys外的另一种氨基酸，或在95位为Tyr，但在97位无Arg或Lys存在，从而使其适合充当本发明制备的推定的(R)-选择性 ω-转氨酶。第五序列基序c5)要求在最终制备并鉴别的推定的(R)-选择性ω-转氨酶的 40位不存在Lys和Arg。第六序列基序c6)要求在最终制备并鉴别的推定的(R)-选择性 ω-TA的161位至165位存在至少一个Lys，优选存在一个Lys，优选在163位为Lys。在本发明的上下文中，氨基酸位置的鉴别和定位确定如下所述。将第一靶生物分子序列彼此和与查询生物分子序列比对，优选多比对。比对可使用常规比对软件，如STRAP， 特别是ClustalW，优选ClustalW3D完成。在另一个实施方式中，也可将序列成对地比对，即每个第一靶生物分子序列与查询生物分子序列比对。在优选实施方式中，将第一靶生物分子序列与大肠杆菌的BCAT比对。在另一优选实施方式中，将第一靶生物分子序列与本发明所用的另一查询生物分子序列，如(R)-选择性ω-转氨酶比对。本发明中给出的氨基酸位置的注释通过对应序列基序在用作位置标准的查询生物分子序列中的位置来确定。上述比对将第一靶生物分子序列的对应氨基酸位置与存在于查询生物分子序列中的序列基序进行比对。例如，使用大肠杆菌BCAT作为位置注释的标准，使用大肠杆菌BCAT的92位至100 位的已知氨基酸序列，即TSAYIRPLI (SEQ ID no. 9)来鉴别推定的ω -转氨酶中95位至99 位，对所述推定的《-转氨酶的序列基序(1)、(32)、(33)的缺失和c4)的存在进行分析。大肠杆菌BCAT的35位至42位的已知氨基酸序列，即VFEGIRCY(SEQ ID no. 10)标记出用于序列基序c3)和c5)的位于38位的G的位置。大肠杆菌BCAT的氨基酸序列中的氨基酸序列DVGMGVNP(SEQ ID no. 11)标记出用于105位至111位的序列基序c3)的104位至111 位。已知大肠杆菌BCAT的159位至167位的氨基酸序列PTAAKAGGN(SEQ ID no. 12)标记出用于序列基序c6)的163位的K。因此，在本发明的优选实施方式中，生物分子为蛋白，且生物分子序列为氨基酸序列。因此，在一个优选实施方式中，生物分子库为库，特别是数据库，所述库是具有各种蛋白信息，特别是氨基酸序列信息的集合的库。优选的数据资料库为NCBI蛋白数据库， UniProtKB/SwissProt 和 Uni-ProtKB/TrEMBL 数据库。在优选实施方式中，生物分子也可为DNA分子，且生物分子序列也可为DNA序列。 因此，在一个优选实施方式中，所述生物分子库是具有各种多核苷酸序列信息，特别是DNA 序列信息的集合的库，特别是数据库。在优选实施方式中，本发明使用上述方法，其中所述生物分子库为生物分子数据库，且在步骤b)中使用生物分子序列比对程序，特别是BLAST检索所述生物分子数据库。在优选实施方式中，可预期如果生物分子库为生物分子数据库，则在步骤b)中使用氨基酸序列(如果生物分子数据库为氨基酸序列数据库)，或使用DNA序列(如果生物分子数据库为 DNA序列数据库)检索所述生物分子数据库。本发明预期通过转氨酶的从头合成，或借助引物(在第二生物分子序列的基础上定义)从物理基因库中分离编码所希望转氨酶的多核苷酸，以最终在步骤d)中提供生物分子，优选DNA分子或氨基酸序列分子，即蛋白。将所得多核苷酸，特别是DNA序列分子用于在合适条件下，在合适培养基中表达所希望的转氨酶。本发明还涉及筛选和鉴别(R)-选择性ω-转氨酶的方法，包括以上确定的步骤a) 至c)，特别是提供至少一种(R)-选择性ω-转氨酶的至少一个查询生物分子序列和至少一个生物分子库，用所述查询生物分子序列检索所述生物分子库以鉴别出第一靶生物分子序列组，其中以氨基酸水平计算，第一生物分子序列与所述查询生物分子序列具有至少20%、 优选25%、优选32%的序列相同性，在第一靶生物分子序列组中选择以下生物分子序列， 所述生物分子序列在氨基酸水平上不包含Cl)至c3)中的任一个序列基序，其中cl)为在 95位至97位的氨基酸序列Tyr Xal Xa2，其中Xal为氨基酸Ile、Val、Leu、Met、Phe，且Xa2 为氨基酸Arg或Lys，或者c2)为在97位至99位的氨基酸序列Tyr Xaa Gln，其中Xaa为氨基酸，和在105位至111位，优选在107位至109位区域的氨基酸序列Arg Xaa Xa3，其中优选Xa3为氨基酸，优选为His，或者c3)为在38位的Thr、在97位的Lys和在107位至 109位的氨基酸序列Arg Xa4Xa5，其中Xa4为氨基酸，优选为Gly，且Xa5为氨基酸，优选为 Tyr,且所述生物分子序列务必包含序列基序c4)、c5)和c6)，其中c4)为在95位除Tyr、 Arg、Lys外的氨基酸，或在95位为Tyr，但在97位无Arg或Lys，且c5)在40位无Lys或 Arg，且c6)为在161位至165位区域，优选在163位的Lys，以鉴别出第二靶生物分子序列组，所述第二靶生物分子序列组为(R)-选择性ω-TA的生物分子序列。在本发明的进一步的优选实施方式中，本发明的教导提供了可根据本发明制备方法获得的(R)-选择性ω-转氨酶。特别地，本发明提供了蛋白和DNA序列，特别是DNA分子，其编码来自百脉根根瘤菌(Mesorhizobium Ioti)和土曲霉(Aspergillus terreus)的所述蛋白，如SEQ ID no. 1和2所确定百脉根根瘤菌的蛋白以及SEQ ID no. 3和4所确定的土曲霉的蛋白。在特别的和最优选的实施方式中，本发明提供了这样的教导，即可根据本发明获得或制备的(R)-选择性ω-转氨酶，如SEQ ID no. 1和3中确定的那些，可用在转氨反应中，特别是可用在制备光学活性的手性胺，优选手性胺的(R)-对映体的方法中，包括将至少一个氨基受体和至少一个氨基供体与本发明的(R)-选择性ω-转氨酶(特别是 SEQ ID no. 1或3)反应，并获得光学活性的手性胺。在优选的实施方式中，用于制备光学活性的手性胺的方法为使用的含酮基的化合物，优选酮，和氨基供体的不对称合成。在另一优选实施方式中，所述制备方法使用动力学拆分反应。氨基供体优选为外消旋胺的混合物，而氨基受体优选作为离析物(educts)的酮。在本发明的优选实施方式中，通过使用本发明的(R)-选择性ω-转氨酶，在从酮起始的不对称合成中合成光学活性的手性胺，向所希望的光学活性的手性胺，即(R)-对映体的优选转化率为至少70%、80%、90%、95%、98%、99%、99. 5%和最优选100%。在本发明的另一优选实施方式中，将本发明的(R)-选择性ω-转氨酶用在从外消旋胺起始的动力学拆分反应中，向光学活性的手性胺，优选(S)-对映体的优选转化率为至少 30%、40%、45%、46%、47%、48%、49%，特别是 50%。用于分析光学纯度和转化率的浓度可通过使用诸如HPLC、毛细管电泳(CE)、气相色谱(GC)或光度测定或荧光测定法来测定。因此，在优选实施方式中，本发明涉及用于制备光学活性手性胺的方法，所述方法包括在转氨酶，特别是(R)-选择性ω-转氨酶，优选根据本发明的(R)-选择性ω-转氨酶存在下，将包含酮基的氨基受体化合物与胺的外消旋混合物反应，以获得手性胺的(S)-对映体。在本发明的另一优选实施方式中，提供了制备光学活性的手性胺，特别是所述胺的(R)-对映体的方法，所述方法包括在(R)-选择性ω-转氨酶，特别是可根据本发明获得的(R)-选择性ω-转氨酶存在下，将包含酮基的氨基受体化合物和氨基供体反应，以获得胺的(R)-对映体。在本发明的上下文中，氨基受体为这样的分子，其能够接受由转氨酶，特别是 ω _转氨酶从氨基供体转移的氨基。在本发明特别优选的实施方式中，氨基受体包含酮官能团(ketone functionality)。在本发明特别优选的实施方式中，氨基受体选自苯丙酮酸或其盐、丙酮酸或其盐、 苯乙酮、2-酮戊二酸盐、3-氧代丁酸盐、2- 丁酮、3-氧代吡咯烷(3-0P)、3_吡啶基甲基酮 (3-PMK)、3_氧代丁酸乙酯(3-0BEE)、3_氧代戊酸甲酯(3-0PME)、N-1-boc-氧代哌啶酮、 N-l-boc-3-氧代吡咯烷(B30P)、3-氧代-哌啶、N-l-boc-3 氧代哌啶(B30Pi)、l_Cbz_3-氧代哌啶(C30Pi)、l-Cbz-3氧代吡咯烷(C30P)、烷基-3-氧代-丁酸酯(butonoates)、甲氧基丙酮和1-氧代四氢萘酮组成的组。在本发明的上下文中，氨基供体为这样的分子，其能够使用转氨酶，特别是ω-转氨酶向氨基受体提供氨基。在特别优选的实施方式中，氨基供体为胺或氨基酸。在特别优选的实施方式中，氨基供体选自β-丙氨酸、丙氨酸、α-甲基苄胺 (α -MBA)、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、3-氨基丁酸、异丙胺、2-氨基丁烷和Y -氨基丁酸或其中任意一种的盐，如氯化物。在特别优选的实施方式中，所得的酮产物可为苯丙酮酸或其盐、丙酮酸或其盐、乙醛酸或其盐、苯乙酮、2-酮戊二酸盐、丙酮、3-氧代丁酸、2-丁酮、 氧代丁酸盐、2-丁酮、3-氧代吡咯烷(3-0P)、3-吡啶基甲基酮(3-PMK)、3-氧代丁酸乙酯 (3-0BEE)、3-氧代戊酸甲酯(3-0PME)、N-1-boc-氧代哌啶酮和N-l-boc-3-氧代吡咯烷 (B30P)或其中任意一种的盐，如氯化物。在另一优选实施方式中，本发明涉及制备光学活性手性胺的方法，所述光学活性手性胺选自具有光学活性氨基的胺的组，特别是具有烷基、支链烷基或芳基烷基的胺。特别地，这些胺，特别是单环或二环胺为5元或6元环的胺，或S-、0-或N-取代的杂环烃或芳胺，特别是烷基或烷氧基取代的芳胺。在优选实施方式中，所得的手性胺选自苯丙氨酸、丙氨酸、3-氨基哌啶、烷基-3-氨基-丁酸盐、3-氨基吡咯烷(3-AP)、3_吡啶基-1-乙胺(3-PEA)、N-l-boc-3-氨基吡咯烷(B3AP)、N-l-boc-3-氨基哌啶(B3APi)、l_Cbz_3-氨基哌啶(C3APi)、l-Cbz-3-氨基吡咯烷(C3AP)、3-氨基丁酸乙酯(3-ABEE)、3_氨基戊酸甲酯(3APME)、α-甲基苄胺(α-ΜΒΑ)、1_氨基四氢化萘、3，4_ 二甲氧基苯基丙酮、α-甲基-4-(3-吡啶基)-丁胺、Y-氨基丁酸盐、谷氨酸盐、异丙胺、β-氨基丁酸盐、仲丁胺、甲氧基异丙胺、3-氨基吡咯烷的衍生物、l-N-Boc-3-氨基哌啶、头孢菌素和头孢菌素的衍生物组成的组。在特别优选的实施方式中，本发明由此预见到将30P与(R)-选择性ω-转氨酶和氨基供体反应以提供光学活性的(R)_3AP。在另一优选的实施方式中，本发明预见到将3-PMK与(R)-选择性ω-转氨酶和氨基供体反应以提供光学活性的(R)3_PEA。在本发明的另一优选实施方式中，本发明预见到将3-0BEE与(R)-选择性ω-转氨酶和氨基供体反应以提供光学活性的(R) 3-ΑΒΕΕ。在另一优选的实施方式中，本发明预见到将3-0ΡΜΕ与(R)-选择性ω-转氨酶和氨基供体反应以提供光学活性的(R)3-APME。在另一优选的实施方式中，本发明预见到将B30P与(R)-选择性ω-转氨酶和氨基供体反应以提供光学活性的(R)_B3AP。在另一优选的实施方式中，本发明预见到将B30Pi与(R)-选择性ω-转氨酶和氨基供体反应以提供光学活性的(R)_B3APi。在另一优选的实施方式中，本发明预见到将C30Pi与(R)-选择性ω-转氨酶和氨基供体反应以提供光学活性的(R)_C3APi。在另一优选的实施方式中，本发明预见到将C30P与(R)-选择性ω-转氨酶和氨基供体反应以提供光学活性的(R)_C3AP。在另一优选的实施方式中，本发明预见到将苯乙酮与(R)-选择性ω-转氨酶和氨基供体反应以提供光学活性的(R) α-ΜΒΑ。在另一优选实施方式中，本发明预见到将氨基受体，特别是单环或二环、含氧代基团的5元或6元环，或S-、0-或N-取代的杂环烃或芳香族化合物，特别是烷基或烷氧基取代的芳香族化合物作为氨基受体与氨基供体和(R)-选择性ω-转氨酶反应，以获得胺，特别是单环或二环胺，特别是5元或6元环的胺，或S-、0_或N-取代的杂环烃或芳胺，特别是烷基或烷氧基取代的芳胺，特别是(R)形式。在本发明特别优选的实施方式中，在诸如生理缓冲液等水性介质中将氨基受体和氨基供体与转氨酶反应。在特别优选的实施方式中，转氨反应在pH5-9，特别是在pH 7-8.5 范围内的PH下进行。在特别优选的实施方式中，反应在10°C至65°C，优选20°C至50°C，特别是18°C至25°C，优选室温或34°C至39°C，特别在37°C下进行。在本发明的另一优选实施方式中，以1 1至1 5，特别为1 1至1 2的的摩尔比提供氨基受体和氨基供体。 在本发明的优选实施方式中，酶促活性为1至20. OOOymol/min。本发明还涉及用于分析转氨酶，特别是用于表征转氨酶性质的方法，其包括以下步骤
i.提供带电的氨基受体、带电的氨基供体和转氨酶，优选ω-转氨酶，最优选可根据本发明获得的(R)-选择性ω-转氨酶，ii.在反应介质中将氨基受体和氨基供体与转氨酶反应，和由此iii.在第一反应条件设定下测定反应介质的电导率，和iv.在步骤iii)后，在第二反应条件设定下测定反应介质的电导率，以获得反映转氨酶性质的至少两个电导率值。在转氨酶(优选ω-ΤΑ)催化的，带电的底物氨基供体(优选胺)与氨基受体(优选酮酸，如丙酮酸盐)的反应期间，电导率降低，这是因为形成不带电的酮和两性离子的氨基组分，优选氨基酸，如丙氨酸。
权利要求
1.用于制备(R)-选择性ω-转氨酶的方法，其包括以下步骤a)提供至少一种转氨酶或裂解酶的至少一个查询生物分子序列，和至少一个生物分子库；b)用所述查询生物分子序列检索所述生物分子库，以鉴别出第一靶生物分子序列组， 其中以氨基酸水平计算，所述第一靶生物分子序列与所述查询生物分子序列具有至少20% 的序列相同性；c)在所述第一靶生物分子序列组中选择第二生物分子靶序列组，所述第二生物分子靶序列组在氨基酸水平上不包含以下氨基酸序列基序Cl)至c3)中的至少一种，其中cl)在95位至97位的氨基酸序列Tyr Xal Xa2，其中Xal为氨基酸Ile、Val、Leu、Met、 Phe,且Xa2为氨基酸Arg或Lys，或者c2)在97位至99位的氨基酸序列Tyr Xaa Gln，其中Xaa为氨基酸，和在105位至111 位的氨基酸序列Arg Xaa Xa3，其中Xa3为氨基酸，优选为His，或者c3)在38位的Thr、在97位的Lys和在107位至109位的氨基酸序列Arg Xa4 Xa5，其中Xa4为氨基酸，优选为Gly，且Xa5为氨基酸，优选为Tyr ； 而包含c4)在95位除Tyr、Arg、Lys外的另一种氨基酸，或在95位的Tyr，但在97位无Arg或 Lys,且c5)在40位无Lys或Arg,且c6)在161位至165位区域中的Lys，以鉴别出第二靶生物分子序列组，和d)提供生物分子，其具有在步骤c)中鉴别的第二生物分子靶序列，且为具有(R)-选择性ω-转氨酶活性的蛋白或至少部分编码具有(R)-选择性ω-转氨酶活性的蛋白。
2.用于筛选(R)-选择性ω-转氨酶的方法，其包括权利要求1的步骤a)至c)。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述生物分子为蛋白，且所述生物分子序列为氨基酸序列。
4.如权利要求1或2所述的方法，其中所述生物分子为DNA分子，且所述生物分子序列为DNA序列。
5.如前述任一项权利要求所述的方法，其中所述生物分子库为生物分子数据库，且在步骤b)中使用生物分子序列比对工具，特别是BLAST检索所述生物分子数据库。
6.如权利要求1、3、4和5所述的方法，其中通过从头合成提供步骤d)中所提供的蛋白质或DNA分子。
7.如权利要求1、2和4中任一项所述的方法，其中所述生物分子库为基因库，且在步骤 b)中使用查询DNA序列分子检索所述基因库。
8.如权利要求7所述的方法，其中在步骤c)中使用DNA序列引物选择所述第二生物分子序列组。
9.如前述任一项权利要求所述的方法，其中所述查询生物分子序列是代表全部或部分的功能性(R)“选择性ω -转氨酶的序列。
10.可通过权利要求1和3 9中任一项所述方法获得的(R)-选择性ω-转氨酶，其优选选自SEQ ID no. 1、2、3和4组成的生物分子序列组。
11.用于分析转氨酶，特别是表征转氨酶性质的方法，其包括以下步骤 i)提供带电的氨基受体、带电的氨基供体和转氨酶， )在反应介质中将氨基受体和氨基供体与转氨酶反应，和由此iii)在第一反应条件设定下测定所述反应介质的电导率，和iv)在步骤iii)后，在第二反应条件设定下测定所述反应介质的电导率，以获得反映转氨酶性质的至少两个电导率值。
12.如权利要求11所述的方法，其中至少在第三反应条件设定下测定所述反应介质的电导率至少三次。
13.如权利要求11或12所述的方法，其中所述反应条件的设定相同。
14.如权利要求11至13中任一项所述的方法，其中所述反应介质是低电导率缓冲剂。
15.如权利要求11或14中任一项所述的方法，其中所述带电的氨基受体是丙酮酸盐。
16.如权利要求1 9中任一项所述的用于筛选或制备(R)-选择性ω-转氨酶的方法，其中在筛选或制备(R)-选择性ω-转氨酶后，实施权利要求11 15中任一项所述的分析转氨酶的方法。
17.制备光学活性手性胺的方法，其包括使至少一种氨基受体和至少一种氨基供体与权利要求10所述的(R)-选择性ω-转氨酶反应，并获得所述光学活性手性胺。
全文摘要
本发明涉及用于筛选、制备和表征(R)-选择性ω-转氨酶的方法，由此获得的ω-转氨酶及其在各种氨基转移过程中的应用。
文档编号C12P13/00GK102482650SQ201080039297
公开日2012年5月30日 申请日期2010年8月13日 优先权日2009年9月2日
发明者乌韦·博恩朔伊尔, 卡伦·罗宾斯, 塞巴斯蒂安·舍茨勒, 马蒂亚斯·赫内 申请人:罗扎股份公司