专利名称：灵芝细胞培养液及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种生物技术领域的培养液及其应用，具体是一种灵芝细胞培养液及其应用。
背景技术：
经过对现有技术的检索发现，灵芝(Ganoderma lucidum)为担子菌纲、多孔菌科、灵芝属高等真菌，为我国久负盛名的药用真菌。药理研究表明，灵芝有广泛的药理作用，如抗HIV病毒，免疫调节，抗心肌缺血，调节血脂，降血糖，镇静作用，保肝作用，抗放射和抗化疗，抗缺氧和抗衰老作用等。研究发现，灵芝活性物质中三萜是主要有效成分之一，它具有很多的生理活性，而灵芝酸又是其中最主要的三萜组分。自1982年Kubota等人首次分离得到灵芝酸A，B类化合物以来， 灵芝中已有200多种三萜被分离出来，其中100多种是灵芝酸。研究表明，灵芝酸T具有诱导肺癌细胞凋亡活性(Tang W.，Liu J. -W.，Zhao W. -M.，Wei D. -Z.，Zhong J. -J. Life Sciences, 80 (2006) 205 211.)，而灵芝酸 Me 具有抑制肿瘤扩散(N. H. Chen, J. W. Liu, J. J. Zhong. Journal of Pharmacological Sciences, 108 (2008) 212 216)和增强 IL-2 和 IFN- y 表达以及增加 NK 细胞活性(G. Wang，J. Zhao, J. Liu, Y. Huang, J. -J. Zhong, W. Tang. International Immunopharmaco1ogy,7(2007)864 870.)。经对现有技术的文献检索发现，中国发明专利申请公开说明书CN1375557A披露了如下内容钟建江和汤亚杰公开了生物反应器中灵芝细胞两阶段培养生产灵芝酸的方法，可以高效率生产灵芝酸，产量1066mg/L，细胞内含量达5mg/100mg干重冲国发明专利申请公开说明书CN1264743A披露了一种液体好氧发酵-液体静置培养法生产灵芝酸的工艺，使总灵芝酸的产量较一般液体好氧发酵法产量提高了 2. 3倍；中国发明专利申请公开说明书CN101692772A披露了一种增加诱导剂提高细胞中灵芝酸含量的方法，使得灵芝菌丝体中总灵芝酸含量达到41. %ig/g干细胞，同时单体灵芝酸的含量也提高15% 60%。但是，灵芝酸在灵芝细胞中的含量仍然很低，分离纯化也较难，这限制了灵芝酸的活性及作用机理的研究及广泛应用。如何进一步提高灵芝酸的产量是目前急需解决的技术问题。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种灵芝细胞培养液及其应用，使得灵芝菌丝体中四种灵芝酸单体Mk，Τ, S, Me含量分别提高了 4. 5倍，6. 2倍，33. 1倍和7. 1倍。本发明是通过以下技术方案实现的本发明涉及一种种子培养液，其组分及含量为葡萄糖35g/L、蛋白胨5g/L、酵母粉 2. 5g/L、磷酸二氢钾 1. 0g/L、MgSO4 · 7H20 0. 5g/L、维生素 Bl 0. 05g/L，余量为水。本发明涉及一种氮限制发酵培养液，其组分及含量为糖类20_35g/L、酵母粉 0-2. 5g/L、蛋白胨0-2. 5g/L、谷氨酰胺0-8. 76g/L、磷酸二氢钾lg/L、磷酸氢二钾0_2g/L、氯化钙 0-0. 05g/L、氯化钠 0-0. 2g/L、MgSO4 · 7H200. 5g/L、维生素 BIO. 5g/L，余量为水。所述的糖类为葡萄糖或乳糖；所述的氮限制发酵培养液具体为以下组分中的任一一种1)乳糖 35g/L、蛋白胨 2. 5g/L、酵母粉 2. 5g/L、磷酸二氢钾 1. Og/L、MgSO4 · 7H20 0.5g/L、维生素Bl 0.05g/L，余量为水;2)乳糖 35g/L、蛋白胨 0. 5g/L、酵母粉 0. 5g/L、磷酸二氢钾 1. Og/L、MgSO4 · 7H20 0.5g/L、维生素Bl 0.05g/L，余量为水;3)乳糖 35g/L、磷酸二氢钾 1. 0g/L、MgS04 ·7Η20 0. 5g/L、维生素 Bl 0. 05g/L，余量为水；4)葡萄糖20g/L、谷氨酰胺8. 76g/L、磷酸二氢钾lg/L、磷酸氢二钾2g/L、氯化钙 0. 05g/L、氯化钠 0. 2g/L、MgSO4 · 7H20 0. 5g/L、维生素 Bl 0. 05g/L，余量为水；5)葡萄糖20g/L、谷氨酰胺4. 38g/L、磷酸二氢钾lg/L、磷酸氢二钾2g/L、氯化钙 0. 05g/L、氯化钠 0. 2g/L、MgSO4 · 7H20 0. 5g/L、维生素 Bl 0. 05g/L，余量为水；6)葡萄糖20g/L、谷氨酰胺1. 46g/L、磷酸二氢钾lg/L、磷酸氢二钾2g/L、氯化钙 0. 05g/L、氯化钠 0. 2g/L、MgSO4 · 7H20 0. 5g/L，余量为水；7)葡萄糖20g/L、谷氨酰胺2. 2g/L、磷酸二氢钾lg/L、磷酸氢二钾2g/L、氯化钙 0. 05g/L、氯化钠 0. 2g/L、MgSO4 · 7H20 0. 5g/L、维生素 Bl 0. 05g/L，余量为水；8)葡萄糖20g/L、谷氨酰胺0. 73g/L、磷酸二氢钾lg/L、磷酸氢二钾2g/L、氯化钙 0. 05g/L、氯化钠 0. 2g/L、MgSO4 · 7H20 0. 5g/L、维生素 Bl 0. 05g/L，余量为水；9)葡萄糖20g/L、谷氨酰胺0. 43g/L、磷酸二氢钾lg/L、磷酸氢二钾2g/L、氯化钙 0. 05g/L、氯化钠 0. 2g/L、MgSO4 · 7H20 0. 5g/L，余量为水；10)葡萄糖20g/L、磷酸二氢钾lg/L、磷酸氢二钾2g/L、氯化钙0. 05g/L、氯化钠 0. 2g/L、MgSO4 · 7H20 0. 5g/L，余量为水；本发明涉及一种灵芝细胞的优化培养方法，包括以下步骤第一步、将灵芝菌丝体接入按照上述组分配比的种子培养液中培养，得一级种子培养液；第二步、取一级种子培养液，接入种子培养液中，培养，得二级种子培养液；所述的培养为在30°C下以120rpm的转速旋转培养5天。所述的接入种子培养液是指按照体积比，培养液的接入量为培养液的10%。第三步、将二级种子细胞分别接入发酵培养液及氮限制发酵培养液中，静止培养至收获期，收取上层细胞。所述的接入发酵培养液及氮限制发酵培养液是指离心收集二级种子细胞后，接入与原种子培养液相同体积的发酵培养液及氮限制发酵培养液中。所述的静止培养是指在30°C下以120rpm的转速旋转培养2天。本发明采用二阶段灵芝菌丝体培养方法(Fang Q.-H.，Zhong, J. -J. Process Biochemistry, 2002，37 (7)，pp. 769 774)，在发酵培养液中进行静止培养至结束，然后采用常规方法从发酵产物中提取收集灵芝酸并进行测定(Tang Y.-J.，et al. ,Enzyme Microb Technol 2002 ；31 :20-8)。与现有技术相比，本发明具有如下优点本发明通过氮限制培养，使灵芝细胞中单体灵芝酸 GA-Mk，GA-T, GA-S, GA-Me 的最高含量分别达 2350. 9，13101. 5，17633. 8， 7774. 6 μ g/g干细胞，分别提高了 1. 5倍，11. 5倍，26. 3倍和43. 1倍。本发明技术方案中涉及的灵芝(Ganoderma lucidum) CGMCC NO. 5. 616，可从中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)购得，中心地址北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所。
具体实施例方式下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。实施例1步骤一，配制种子培养液每IL种子培养液的组分及含量为葡萄糖35g、蛋白胨 5g、酵母粉 2. 5g、磷酸二氢钾 1. 0g、MgSO4 · 7H20 0. 5g、维生素 Bl 0. 05g ；配制发酵培养液每IL发酵培养液的组分及含量为乳糖35g、蛋白胨5g、酵母粉 5g、磷酸二氢钾 1. 0g、MgSO4 · 7H20 0. 5g、维生素 Bl 0. 05g ；配制氮限制发酵培养液所述氮限制发酵培养液的组分及含量为氮限制发酵培养液 1 乳糖 35g/L、蛋白胨 2. 5g/L、酵母粉 2. 5g/L、磷酸二氢钾 1. Og/L,MgSO4 ·7Η20 0. 5g/ L、维生素BIO. 05g/L ；氮限制发酵培养液2 乳糖35g/L、蛋白胨0. 5g/L、酵母粉0. 5g/L、磷酸二氢钾1. 0g/L、MgS04 ·7Η20 0. 5g/L、维生素Bl 0. 05g/L ；氮限制发酵培养液3 乳糖35g/ L、磷酸二氢钾 1. 0g/L、MgSO4 · 7H20 0. 5g/L、维生素 Bl 0. 05g/L ；步骤二，在250mL 摇瓶中，将 IOmL 灵芝(Ganoderma lucidum) CGMCC NO. 5. 616 的菌丝体接入40mL种子培养液中，300C、120rpm下培养6天，得一级种子培养液；步骤三，在250mL摇瓶中，将5mL —级种子培养液添加到45mL种子培养液中， 300C、120rpm下培养2天，得二级种子培养液；步骤四，收集四份步骤三得到的种子细胞(每份50ml)，分别接入发酵培养液及氮限制培养液1，2，3中，置于直径IOcm的培养器皿中，进行静止培养；四份发酵细胞均静止培养至第十四天，收取上层细胞。本实施例的实施效果灵芝酸单体分析取IOOmg磨碎细胞，加入IOml无水乙醇，超声提取2小时，50°C 真空蒸干，重新溶解于Iml色谱级甲醇中，用0. 22 μ m滤膜过滤，HPLC分析四个灵芝酸单体
的含量。如表1所示，随培养液中氮源的不断减少，细胞干重也逐渐减少，而细胞中四种灵芝酸单体GA-Mk，GA-T，GA-S，GA-Me的含量逐渐增高，氮限制发酵培养液3使细胞中四个灵芝酸单体含量达到最高，灵芝酸GA-Mk，GA-T, GA-S和GA-Me分别是对照的5. 2倍，5. 1倍， 13. 2倍和2. 7倍，同时产量也达到最高。表 权利要求
1.一种种子培养液，其特征在于，其组分及含量为葡萄糖35g/L、蛋白胨5g/L、酵母粉 2. 5g/L、磷酸二氢钾 1. Og/L、MgSO4 · 7H20 0. 5g/L、维生素 BIO. 05g/L，余量为水。
2.一种氮限制发酵培养液，其特征在于，其组分及含量为糖类20-35g/L、酵母粉 0-2. 5g/L、蛋白胨0-2. 5g/L、谷氨酰胺0-8. 76g/L、磷酸二氢钾lg/L、磷酸氢二钾0_2g/L、氯化钙 0-0. 05g/L、氯化钠 0-0. 2g/L、MgSO4 · 7H200. 5g/L、维生素 BIO. 5g/L，余量为水。
3.根据权利要求1所述的氮限制发酵培养液，其特征是，所述的糖类为葡萄糖或乳糖。
4.根据权利要求1所述的氮限制发酵培养液，其特征是，所述的氮限制发酵培养液具体为以下组分中的任一一种1)乳糖35g/L、蛋白胨 2. 5g/L、酵母粉 2. 5g/L、磷酸二氢钾 1. Og/L,MgSO4 · 7H20 0. 5g/ L、维生素BIO. 05g/L，余量为水；2)乳糖35g/L、蛋白胨 0. 5g/L、酵母粉 0. 5g/L、磷酸二氢钾 1. 0g/L,MgSO4 · 7H20 0. 5g/ L、维生素B10. 05g/L，余量为水；3)乳糖35g/L、磷酸二氢钾 1. 0g/L、MgS04 ·7Η20 0. 5g/L、维生素 B10. 05g/L，余量为水；4)葡萄糖20g/L、谷氨酰胺8.76g/L、磷酸二氢钾lg/L、磷酸氢二钾2g/L、氯化钙 0. 05g/L、氯化钠 0. 2g/L、MgSO4 · 7H20 0. 5g/L、维生素 B10. 05g/L，余量为水；5)葡萄糖20g/L、谷氨酰胺4.38g/L、磷酸二氢钾lg/L、磷酸氢二钾2g/L、氯化钙 0. 05g/L、氯化钠 0. 2g/L、MgSO4 · 7H20 0. 5g/L、维生素 B10. 05g/L，余量为水；6)葡萄糖20g/L、谷氨酰胺1.46g/L、磷酸二氢钾lg/L、磷酸氢二钾2g/L、氯化钙 0. 05g/L、氯化钠 0. 2g/L、MgSO4 · 7H20 0. 5g/L，余量为水；7)葡萄糖20g/L、谷氨酰胺2.2g/L、磷酸二氢钾lg/L、磷酸氢二钾2g/L、氯化钙0. 05g/ L、氯化钠 0. 2g/L、MgSO4 · 7H20 0. 5g/L、维生素 B10. 05g/L，余量为水；8)葡萄糖20g/L、谷氨酰胺0.73g/L、磷酸二氢钾lg/L、磷酸氢二钾2g/L、氯化钙 0. 05g/L、氯化钠 0. 2g/L、MgSO4 · 7H20 0. 5g/L、维生素 B10. 05g/L，余量为水；9)葡萄糖20g/L、谷氨酰胺0.43g/L、磷酸二氢钾lg/L、磷酸氢二钾2g/L、氯化钙 0. 05g/L、氯化钠 0. 2g/L、MgSO4 · 7H20 0. 5g/L，余量为水；10)葡萄糖20g/L、磷酸二氢钾lg/L、磷酸氢二钾2g/L、氯化钙0.05g/L、氯化钠0. 2g/ L、MgSO4 · 7H20 0. 5g/L，余量为水。
5.一种灵芝细胞的优化培养方法，其特征在于，包括以下步骤第一步、将灵芝菌丝体接入种子培养液中培养，得一级种子培养液；第二步、取一级种子培养液，接入种子培养液中，培养，得二级种子培养液；第三步、将二级种子细胞分别接入发酵培养液及氮限制发酵培养液中，静止培养至收获期，收取上层细胞。
6.根据权利要求5所述的灵芝细胞的优化培养方法，其特征是，所述的种子培养液的组分及含量为葡萄糖35g/L、蛋白胨5g/L、酵母粉2. 5g/L、磷酸二氢钾1. 0g/L、 MgSO4 · 7H200. 5g/L、维生素 Β10· 05g/L，余量为水。
7.根据权利要求5所述的灵芝细胞的优化培养方法，其特征是，所述的氮限制发酵培养液的组分及含量为糖类20-35g/L、酵母粉0-2. 5g/L、蛋白胨0-2. 5g/L、谷氨酰胺 0-8. 76g/L、磷酸二氢钾 lg/L、磷酸氢二钾 0-2g/L、氯化钙 0-0. 05g/L、氯化钠 0-0. 2g/L、MgSO4 · 7Η200· 5g/L、维生素 BIO. 5g/L，余量为水。
8.根据权利要求5所述的灵芝细胞的优化培养方法，其特征是，第一步中所述的种子培养液中培养是指在30°C下以120rpm的转速旋转培养5天；所述的接入种子培养液是指按照体积比，培养液的接入量为培养液的10%。
9.根据权利要求5所述的灵芝细胞的优化培养方法，其特征是，所述的接入发酵培养液及氮限制发酵培养液是指离心收集二级种子细胞后，接入与原种子培养液相同体积的发酵培养液及氮限制发酵培养液中。
10.根据权利要求5所述的灵芝细胞的优化培养方法，其特征是，所述的静止培养是指在30°C下以120rpm的转速旋转培养2天。
全文摘要
一种生物技术技术领域的灵芝细胞培养液及其应用，包括种子培养液、氮限制发酵培养液以及灵芝细胞的优化培养方法，其中种子培养液的组分为葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、磷酸二氢钾、MgSO4·7H2O、维生素B1，氮限制发酵培养液的组分为糖类、酵母粉、蛋白胨、谷氨酰胺、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化钙、氯化钠、MgSO4·7H2O、维生素B1，本发明使得灵芝菌丝体中四种灵芝酸单体Mk，T，S，Me含量分别提高了4.5倍，6.2倍，33.1倍和7.1倍。
文档编号C12N1/14GK102174415SQ20111000972
公开日2011年9月7日 申请日期2011年1月18日 优先权日2011年1月18日
发明者赵蔚, 钟建江 申请人:上海交通大学