专利名称：与hcv病毒非结构蛋白ns2特异结合的核酸适体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及与HCV病毒非结构蛋白NS2特异结合的核酸适体及其应用。
背景技术：
丙型病毒性肝炎潜伏期长，难以早期诊断和治疗，对人体的危害极大。目前的治疗手段单一。核酸适体以其独特的化学抗体特性成为新一代针对特定蛋白的分子药物或靶向载体。但是目前基于核酸适体的针对丙型病毒性肝炎病毒(HCV病毒)药物或诊断试剂还很缺乏。而且，针对HCV非结构蛋白NS2的核酸适体筛选尚未有报道。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种核酸适体。本发明所提供的核酸适体，为SEQ ID NO 2所示DNA分子。上述核酸适体在制备用于诊断和/或预防和/或治疗丙型病毒性肝炎的产品中的应用也属于本发明的保护范围。其中，所述产品为药物或疫苗。本发明的另一个目的是提供一种用于诊断和/或预防和/或治疗丙型病毒性肝炎的产品。本发明所提供的用于诊断和/或预防和/或治疗丙型病毒性肝炎的产品，其活性成分为上述核酸适体。其中，所述产品为药物或疫苗。上述核酸适体在制备用于诊断和/或预防和/或治疗丙型病毒性肝炎的药物载体中的应用也属于本发明的保护范围。本发明的另一个目的是提供一种用于诊断和/或预防和/或治疗丙型病毒性肝炎的药物载体。本发明所提供的用于诊断和/或预防和/或治疗丙型病毒性肝炎的药物载体，其活性成分为上述核酸适体。上述核酸适体在制备抑制丙型病毒性肝炎病毒组装和/或释放的试剂中的应用也属于本发明的保护范围。本发明的另一个目的是提供一种抑制丙型病毒性肝炎病毒组装和/或释放的试剂。本发明所提供的抑制丙型病毒性肝炎病毒组装和/或释放的试剂，其活性成分为上述核酸适体。上述核酸适体在制备与丙型病毒性肝炎病毒非结构蛋白NS2结合的试剂中的应用也属于本发明的保护范围。本发明的另一个目的是提供一种与丙型病毒性肝炎病毒非结构蛋白NS2结合的试齐LU本发明所提供的与丙型病毒性肝炎病毒非结构蛋白NS2结合的试剂，其活性成分为上述核酸适体。
实验证明，本发明的核酸适体能特异性地与HCV病毒非结构蛋白NS2结合，而不与非结构蛋白NS5B和筛选中的对照蛋白PET200结合。因此，本发明的核酸适体可以作为预防和/或治疗丙型病毒性肝炎的分子药物或者靶向载体，在丙型病毒性肝炎的治疗领域具有广阔的应用前景。
图1为固定前后蛋白NS2溶液的UV-Vis光谱。图2为FITC标记的第二次筛选产物与PET(左)和NS2蛋白(右)作用情况，荧光强度100-1000。图3为FITC标记的第五次筛选产物与PET(左)和NS2 (右)作用情况，荧光强度 100-5000。图4为适体序列分别与NS2蛋白的结合情况，荧光强度300-4000。图5为适体序列分别与PET蛋白的结合情况，荧光强度200-400。图6为适体序列分别与NS5B蛋白的结合情况，荧光强度200_400。图7为适体序列抑制HCV的组装或释放。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、相关蛋白和相关溶液的制备一、带组氨酸标签的丙型肝炎病毒NS2(靶标蛋白)的制备1、HCV NS2编码基因的扩增以 SEQ ID NO 4 所示 DNA (即 GENBANK ACCESSION NO. AY605046. 1)为模板，用引物1和引物2组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。 引物 1 (上游引物)5，-CGCGCGAATTCATGCCGCGTGGAAGC-3，；引物 2 (下游引物)5，-CTGCAGGGATCCTTAGGCCAATCCGTT-3，；上、下游引物的5’端分别引入EcoRl酶切位点和BamHl酶切位点。PCR 扩增条件:95V 2min ；95°C 30s，66°C 30s, 72V lmin, 35 个循环；72°C 7min。2、原核表达载体的构建①用限制性酶EcoRl和BamHl双酶切步骤1的PCR扩增产物，得到酶切产物。②用限制性酶EcoRl和BamHl双酶切原核表达载体pEI^8a，回收载体骨架。③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接，得到连接产物。④将连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，用含氨苄青霉素(Amp)的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒依次进行酶切鉴定和测序鉴定。测序结果表明，得到了重组质粒pET28a_NS2(骨架质粒为原核表达载体pEI^Sa， 在EcoRl和BamHl酶切位点之间插入了编码丙型肝炎病毒NS2的DNA序列，表达的NS2蛋白与载体上的组氨酸标签的编码基因融合，表达带组氨酸标签的丙型肝炎病毒NS2蛋白)。3、带组氨酸标签的丙型肝炎病毒NS2蛋白的原核表达鉴定①将重组质粒pET28a_NS2转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，用含氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆。②挑取阳性克隆于LB液体培养基，37°C振摇过夜，加入IPTG (终浓度lmmol/L)继续培养诱导10h。③13000rpm 离心 lmin，收集菌体进行 SDS-PAGE 电泳和 Western blot。 Westernblot的一抗为anti-his (购自Sigma公司)。结果表明，菌体中含有带组氨酸标签的丙型肝炎病毒核心蛋白。4、带组氨酸标签的丙型肝炎病毒核心蛋白的大量表达、纯化及检测①将重组质粒pET28a_NS2转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，得到重组菌。②将步骤①得到的重组菌接种LB培养基，37°C振荡培养过夜，按1 50的体积比转接到含50ug/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37°C振摇培养约2h (使0D600为0. 6-0. 8)， 加入IPTG (终浓度lmmol/L)继续培养诱导12h。③:3500rpm离心收集菌体，在含100ug/ml溶菌酶的start buffer (0. 02M磷酸钠， 0. 5M NaCl，pH7. 4)中超声破碎(频率120w，每个循环内超声3s停3s，400个循环，在冰浴上进行)，4°C、IOOOOrpm离心lOmin，收集裂解上清。④将裂解上清上样于Ni-NTA偶联的琼脂糖黏附柱(购自GE公司)，用washing buffer (0. 02M 磷酸钠，0. 5M NaCl,0. 05M 咪唑，pH7. 4)洗涤去除杂蛋白，用 elution buffer (0.02M磷酸钠，0.5M NaCl，0.5M咪唑，ρΗ7· 4)洗脱目的蛋白，得到带组氨酸标签的丙型肝炎病毒NS2蛋白。二、带组氨酸标签的PET蛋白的(对照蛋白)制备1、将 SEQ ID NO 5 所示的 DNA (即 GENBANK ACCESSION NO. U46489. 1)插入原核表达载体pET28a的EcoRl和BamHl位点之间，得到重组质粒pET28a_PET (PET蛋白的编码基因与载体上的组氨酸标签的编码基因融合，表达带组氨酸标签的PET蛋白)。2、带组氨酸标签的PET蛋白的原核表达鉴定①将重组质粒pET28a_PET转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，用含氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆。②挑取阳性克隆于LB液体培养基，37°C振摇过夜，加入IPTG (终浓度lmmol/L)继续培养诱导10h。③13000rpm 离心 lmin，收集菌体进行 SDS-PAGE 电泳和 Western blot。 Westernblot 的一抗为 anti-his (购自 Sigma 公司)。3、用重组质粒pET28a_PET代替重组质粒pET28a_NS2，其它同实验一的步骤4，得到带组氨酸标签的PET蛋白。三、带组氨酸标签的HCV病毒非结构蛋白NS5B制备将SEQ ID NO 6 所示的 DNA(即 GENBANK ACCESSION NO. JF51107. 1)插入原核表达载体pET28a的EcoRl和BamHl位点之间，得到重组质粒pET28a_NS5B (NS5B蛋白的编码基因与载体上的组氨酸标签的编码基因融合，表达带组氨酸标签的NS5B蛋白)。2、带组氨酸标签的PET蛋白的原核表达鉴定①将重组质粒pET28a_NS5B转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，用含氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆。②挑取阳性克隆于LB液体培养基，37°C振摇过夜，加入IPTG (终浓度lmmol/L)继续培养诱导10h。③13000rpm 离心 lmin，收集菌体进行 SDS-PAGE 电泳和 Western blot。Western blot的一抗为anti-his (购自Sigma公司)。3、用重组质粒pET28a_NS5B代替重组质粒pET28a_NS2，其它同实验一的步骤4，得到带组氨酸标签的NS5B蛋白。四、相关溶液的制备PBS缓冲液pH为7.4，由水和溶质组成；溶质及其浓度为39mM NaH2PO4,6ImM Na2HPO4,150mM NaCl。结合缓冲液pH为7. 4，由PBS缓冲液和溶质组成；溶质及其浓度为lmM MgCl2, 0. 2mg/ml酵母转移RNA。洗涤液pH为7. 4，由水和溶质组成；溶质及其浓度为25mM Tris, 150mM NaCl, 0. 1% (质量百分含量)牛血清白蛋白(BSA)，0.05% (体积百分含量)Tween-20。将实施例1制备的带组氨酸标签的丙型肝炎病毒NS2蛋白(靶标蛋白，为溶液形式，靶标蛋白的浓度为lOOug/mL)、实施例1制备的带组氨酸标签的PET蛋白(对照蛋白，为溶液形式，对照蛋白的浓度为lOOug/mL)和实施例1制备的各种相关溶液用于实施例2至实施例4。实施例2、筛选核酸适体1.丙型肝炎病毒NS2蛋白核酸适体筛选过程1.1蛋白的固定取300微升Ni-NTA琼脂微珠洗涤三次后，分散于3毫升浓度为1. 5微克/毫升带组氨酸标签的HCV蛋白(或PET蛋白)溶液中，然后置于摇床中孵育lh(100rpm，25°C )。 PBS离心洗涤三次，将微珠重新分散于Iml PBS中，加入少量蛋白酶抑制剂，置于4°C备用。吸附前后的蛋白溶液紫外可见吸收(UV-Vis)光谱证实了蛋白通过Ni-组氨酸螯合作用固定在微珠上(图1)。图1中，1表示固定之前蛋白NS2溶液的UV-ViS光谱，2表示固定之后蛋白NS2溶液的UV-Vis光谱。1. 2筛选过程1) DNA文库的预处理5nmol DNA 文库(5，-ACG CTC GGA TGC CAC TAC AG (40N) CTC ATG GAC GTG CTG GTG AC-3’ )溶解后，经94°C加热和冰上冷却处理，置于37°C待用。2)反筛取200微升已固定PET蛋白的微珠，加入已预处理的DNA文库，于37°C摇床中(转速IOOrpm)孵育1小时，通过超滤离心。3)正筛取100微升已固定HCV NS2蛋白的微珠，加入反筛后超滤离心的溶液，于37°C摇床中(转速IOOrpm)孵育1小时。超滤离心洗涤后，将微珠转移到离心管中，同时加入600微升的灭菌水。将微珠经95°C加热洗脱DNA后，收集上清液用于PCR扩增的模板。为了获得高亲和性和特异性结合HCV蛋白的核酸适体，在筛选的过程中逐步改变反筛和正筛蛋白的微珠用量、筛选时间、筛选溶液中tRNA含量以及正筛洗涤次数增加筛选压力；同时用共聚焦荧光显微镜对每轮的筛选结果进行了初步考察。
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4) PCR 及 ssDNA 分离PCR 反应体系组成10μ L IOX PCR 缓冲溶液(IOOmM Tris-HCl, pH 8. 3 ；15mM MgCl2) ,3 μ L ImM dNTPs,3y L 25 μ M FITC 标记的上游引物(5，_ACG CTC GGA TGC CACTAC AG-3，)和生物素标记的下游引物(5，-GTC ACCAGC ACG TCC ATG AG-3，)、0.25yLTaq 热启动聚合酶，5-15 μ L筛选产物、和69-79 μ L灭菌蒸馏水。热循环条件94°C变性30s，60°C 退火30s，72°C延伸30s。在扩增之前用琼脂凝胶电泳考察不同循环扩增产物，选取适当的循环次数。ssDNA分离利用亲和素包被的葡聚糖微珠亲和吸附，0. 2M的氢氧化钠分离双链， 使FITC标记的ssDNA与生物素标记的ssDNA分离。再将FITC标记的ssDNA过NAP-5柱子进行脱盐，并收集0. 5-1. 5mL之间的滤液。用UV-vis光谱测定收集溶液中的DNA浓度。DNA 经冻存低温干燥后于-20°C保存或用于下轮筛选。2.克隆测序经过多轮筛选后，观察随实验的即时表征，当荧光强度不再增强时，取最后一次筛选产物为模板和无标记的上下游引物按照上述PCR反应条件和步骤进行PCR扩增，将获得的无标记DNA双链产物按照pMDIS-T Vector试剂盒手册操作，然后随机测序。3.序列分析通过分析ssDNA的一级结构，然后根据随机序列中是否存在共同保守序列将所得序列进行分类。对HCV结构蛋白和非结构蛋白进行核酸适体筛选，由于蛋白纯度、浓度等原因，得出较好结果是针对核心蛋白和NS2的筛选。4、NS2的核酸适体筛选一共进行了 5个循环。从第二个循环开始，随实验进行适体富集表征。结果见图2，图3。5、结果通过克隆，选取104个样本进行测序，并按照DNA—级结构进行分类，得到针对NS2高度富集的适体序列，见表1。通过荧光共聚焦表征发现，三条序列与NS2蛋白的结合效果大致相同。表 1
序列信息重复次数 (样本总数 104)ACG GGG CAG GAT TGT CCC CGC GCC TGG TTG AAG GTA GTC GC (S 14) (SEQ ID NO 1)42CAG GTA CCA CCT TCA TGG GCG CGG AAG ACG ATG GTG TAC TC (S6) (SEQ ID NO 2)21CTG GAT CGA AAA GTA TCC ACG TTT GTC TGA AAA TAG TGG CC (S5) (SEQ ID NO 3)15 实施例3、核酸适体的性能检测
1、原料人工合成核酸适体S14、核酸适体S6、核酸适体S5、以及随机文库序列，每条5个 0D,核酸适体及文库的5’端均标记FITC (异硫氰酸荧光素)。随机文库序列5' -ACG CTC GGA TGC CAC TAC AG-(MO)-C TCA TGG ACG TGC TGG TGA C-3'。固定有目标蛋白的微珠的制备如实施例2中所示。带组氨酸标签的HCV病毒非结构蛋白NS2蛋白、和带组氨酸标签的PET蛋白、带组氨酸标签的NS5B蛋白的制备如实施例1所示。PBS缓冲液pH为7.4，由水和溶质组成；溶质及其浓度为39mM NaH2PO4,6ImM Na2HPO4,150mM NaCl。结合缓冲液pH为7. 4，由PBS缓冲液和溶质组成；溶质及其浓度为lmM MgCl2, 0. ang/ml酵母转移RNA。酵母转移RNA购自Invitrogen，产品目录号为15401-011。2、条件37度水浴中，将核酸适体与目标蛋白孵育，孵育后，均用PBS缓冲液洗涤3 次，最后用结合缓冲液重悬，再进行荧光检测。第1组将Iul IOuM FITC标记的各核酸适体或随机文库用结合缓冲液溶解(各核酸适体或随机文库终浓度为IOOnM)，与70ul固定有HCV病毒非结构蛋白NS2的微珠孵育 lh；第2组将Iul IOuM FITC标记的各核酸适体或随机文库用结合缓冲液溶解(各核酸适体或随机文库终浓度为IOOnM)，与70ul固定有PET对照蛋白的微珠孵育Ih ；第3组将Iul IOuM FITC标记的各核酸适体或随机文库用结合缓冲液溶解(各核酸适体或随机文库终浓度为IOOnM)，与70ul固定有NS5B蛋白的微珠孵育Ih ；3、结果如下第一组，三种核酸适体与HCV病毒非结构蛋白NS2的结合结果如图4所示。结果显示，与随机文库相比，三条适体序列与NS2蛋白的结合显著，在结合NS2蛋白的琼脂糖珠子表面形成明亮的荧光，表明筛选得到的三条适体序列特异性很好；第二组，三种核酸适体与对照蛋白PET的结合结果如图5所示。结果显示，与随机文库类似，三条适体序列与PET蛋白没有结合，珠子表面不呈现荧光，表明筛选得到的三条序列与PET蛋白不结合；第三组，三种核酸适体与HCV病毒非结构蛋白NS5B的结合结果如图6所示。结果显示，与随机文库类似，三条适体序列与NS5B蛋白没有结合，珠子表面不呈现荧光，表明筛选得到的三条序列与NS5B蛋白不结合。综合以上检测结果，表明核三种核酸适体对NS2蛋白有很好的特异性。图中，lib表示随机文库序列.实施例4、核酸适体的应用1、实验材料1)随机文库5' -ACG CTC GGA TGC CAC TAC AG-(MO)-C TCA TGG ACG TGC TGG TGA C-3'。于大连宝生物公司合成如下DNA 随机文库、核酸适体S14、核酸适体S6、核酸适体 S5 ；
2) Huh7. 5 细胞在文献“Journal of virology, 2002, 76 :13001-13004. ”中公开过， HCV病毒在文献“PNAS，2011，108 :4991_4996”中公开过，公众可从中国科学院化学研究所获得。3)Huh7. 5. 5细胞来源于Huh7. 5细胞，是将HCV病毒基因组由电击的方法转染进 Huh7. 5细胞中得到的新型细胞。可表达HCV病毒。具体实验方法如下A 将含有HCV病毒基因组的质粒pJFHl (Nat. Med. 2005. 11 :791-796.)用限制性内切酶)(ba I单酶切，使其线性化。B 常规方法提取上述酶切体系A中的质粒加入0. 5M乙二胺二乙酸，3M醋酸钠和两倍体积的无水乙醇，混勻后零下20度放置过夜；高速离心，13000转/分钟，去掉上清；再用70%乙醇洗涤，自然风干，最后加入无核酸酶的水溶解。C 转录在提取的线性质粒pJFHl中加入核糖核酸三磷酸混合物，转录反应缓冲液，转录酶，混勻后于37度放置4小时。D 收集RNA 在转录混合体系中加入氯化锂溶液，零下20度放置过夜；高速离心， 13000转/分钟，去掉上清；用70%乙醇洗涤，自然风干，最后加入无核酸酶的水溶解。E^R:·培养Huh7. 5至适宜细胞状态。·用胰酶将Huh7. 5细胞消化下来，并用不含血清的Opti-MEM培养液洗涤两次。·将细胞沉淀用Opti-MEM重悬至密度为1 X IO7个/mL。·把IOmg JFHl RNA和0. 4mL的细胞充分混合，加入到4mm的电转杯中。·电转仪参数设置为0. 271 ν、100ο1ιπι8、960μΡ，然后进行电击。·培养转染后的细胞，做免疫荧光检测细胞的阳性率。得到表达HCV病毒的 Huh7. 5. 5 细胞。4)月旨质体 2000、DMEM、二抗 goat anti-mouse IgG-FITC 禾口 DAPI 均购自 Invitrogen ；6孔细胞培养板购自Costar ；5)抗HCV NS5A蛋白抗体的制备方法将NS5A序列(如SEQ ID NO :7，即见GENBANK ACCESSION NO. AF529366. 1)，插入真核表达载体pcDNA3. 1中，构建成为真核表达重组质粒 pcDNA3. 1-NS5A。在大肠杆菌中大量扩增重组质粒后，用生理盐水稀释，使重组质粒的浓度为lug/ul。用IOOug的重组质粒接种小鼠，小腿肌肉三点式注射。一周后再加强一次。两次接种后，第三周收集接种小鼠的血清，用作NS5A的多抗血清。真核表达载体pcDNA3. 1购自hvitrogen。2、实验条件 1) Huh7. 5. 5细胞培养在6孔细胞培养板(20万/孔)中，24h后用Lipofectamine 2000转染随机文库或NS2核酸适体(浓度IOOnM)进入Huh7. 5. 5细胞，继续培养4 后回收细胞上清待用。2) Huh7. 5细胞培养在6孔细胞培养板QO万/孔)中，24h后用上述回收的细胞上清感染对应孔的Huh7. 5细胞，感染7 后做免疫荧光，检测HCV感染Huh7. 5细胞的阳性面积。一抗为NS5A的多抗血清，二抗为goat anti-mouse IgG-FITC0细胞培养的培养基为DMEM+10%胎牛血清。3、实验结果
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如图7所示与随机文库相比，核酸适体S6处理组Huh7. 5. 5细胞上清液感染Huh7. 5细胞后， 其阳性面积(绿色荧光)显著性减少。S14处理组、S5处理组与随机文库处理组结果相同。结果表明，核酸适体S6能高效地抑制Huh7. 5. 5细胞中HCV的组装或释放。
权利要求
1.一种核酸适体，为SEQ ID NO 2所示DNA分子。
2.权利要求1所述的核酸适体在制备用于诊断和/或预防和/或治疗丙型病毒性肝炎的产品中的应用。
3.一种用于诊断和/或预防和/或治疗丙型病毒性肝炎的产品，其活性成分为权利要求1所述的核酸适体。
4.权利要求1所述的核酸适体在制备用于诊断和/或预防和/或治疗丙型病毒性肝炎的药物载体中的应用。
5.一种用于诊断和/或预防和/或治疗丙型病毒性肝炎的药物载体，其活性成分为权利要求1所述的核酸适体。
6.权利要求1所述的核酸适体在制备抑制丙型病毒性肝炎病毒组装和/或释放的试剂中的应用。
7.一种抑制丙型病毒性肝炎病毒组装和/或释放的试剂，其活性成分为权利要求1所述的核酸适体。
8.权利要求1所述的核酸适体在制备与丙型病毒性肝炎病毒非结构蛋白NS2结合的试剂中的应用。
9.一种与丙型病毒性肝炎病毒非结构蛋白NS2结合的试剂，其活性成分为权利要求1 所述的核酸适体。
全文摘要
本发明公开了与HCV病毒非结构蛋白NS2特异结合的核酸适体及其应用。本发明的核酸适体，为SEQ ID NO2所示DNA分子。实验证明，本发明的核酸适体能特异性地与HCV病毒非结构蛋白NS2结合，而不与非结构蛋白NS5B和结构蛋白PET结合。因此，本发明的核酸适体可以作为预防和/或治疗丙型病毒性肝炎的分子药物或者靶向载体，在丙型病毒性肝炎的治疗领域具有广阔的应用前景。
文档编号C12Q1/68GK102242122SQ201110113660
公开日2011年11月16日 申请日期2011年5月4日 优先权日2011年5月4日
发明者徐丽, 方晓红, 朱海珍, 李楠 申请人:中国科学院化学研究所