专利名称：以稻谷加工副产物为原料生产饲用葡萄糖氧化酶的方法
技术领域：
本发明涉及一种饲用葡萄糖氧化酶的生产方法，尤其涉及一种利用稻谷加工副产物节碎米、米糠，通过固体发酵生产饲用葡萄糖氧化酶的方法。
背景技术：
目前，饲用葡萄糖氧化酶的生产采用液体深层发酵法，该方法在具体应用中存在许多不足，例如，发酵设备成本高，液体深层发酵需要专业的发酵设备，如发酵罐等，一个30吨的发酵罐造价达100万；发酵过程能耗高，需要不断搅拌；对发酵工作人员技术素质要求较高；三废(废水，废渣，废气)对环境污染较重等(微生物学杂志2009，1 (29)p86-89 ；食品与发酵工业2003，29 (6) ρ 87-91)。饲用葡萄糖氧化酶的液体发酵法生产还有一个显著缺点发酵过程所用原料主要是优质绵白糖，原料成本高(《饲料与畜牧;^〉2008 (7)p37-39)。
发明内容
本发明的目的是，克服目前所采用生产技术的上述缺点，提供一种原料来源广、设备成本低，工艺简单，对环境无污染的饲用葡萄糖氧化酶的生产方法。本发明的目的是通过以下技术方案实现的，一种饲用葡萄糖氧化酶的生产方法， 包括以下步骤
⑴将高产葡萄糖氧化酶的点青霉接种装有马铃薯琼脂培养基(PDA培养基)的10 cm微生物培养皿，25 30 °C培养36 48 h ；
所述马铃薯琼脂培养基配制去皮马铃薯200 g煮汁30 min，4层纱布过滤，滤液中添加葡萄糖20 g，琼脂15 g，补蒸馏水至1000 ml，115°C灭菌20 min，铺平皿备用；
⑵种子培养液体种子培养基经115 121 °C灭菌2(T30 min后，将步骤(1)培养皿中活化的点青霉转接液体种子培养基，接种量为一个10 cm培养皿接种50(T1000 ml液体种子培养基；接种后于25 3(TC培养6(T72 h ；
所述液体种子培养基配方广6wt%绵白糖，0. 05 0. 2wt% KH2PO4, 0. 05 0. 2wt%NaCl, 0. ΟΓΟ. 06wt%MgS04 ‘ 7H20, 0. Γθ. 4wt% NaNO3 :0. ΟΟΓΟ. 025wt% FeCl3, 0· 05 0· 2wt % CaCl2，余为水，pH自然，115°C灭菌20 min备用；
⑶固体发酵培养基的配制将节碎米与米糠按10: Γ3的重量比混合，9(T10(TC蒸煮 25 40 min ；
⑷接种培养固体发酵培养基摊凉后，接种步骤(2)得到的点青霉种子，接种量为 500^1000 ml种子培养液接种500 kg培养基，混合均勻，装入铺有麻袋的竹筐中，再以麻袋覆盖，直至点青霉孢子萌发后，转入发酵床，25 30 °C，加湿通风条件下培养48飞0 h； ( 固体发酵结束后，将培养基置于100 120 °C干燥2 4 h，粉碎至40 80目，即成。本发明采用廉价的稻谷加工副产物节碎米、米糠为底物，采用固体发酵技术，无需发酵罐等特殊设备，无后提取等复杂工艺，无“三废”产生，对无环境无污染，工艺简单，易操作，降低了葡萄糖氧化酶的原料成本、设备成本和生产过程成本，原料来源广，能实现稻谷加工副产物的高值化利用；既适合农村小作坊发酵，也适合工业化大生产。产品葡萄糖氧化酶活力高，酶活性高达200 U;10(Tl20 °C高温下干燥2 h，酶活损失小于5%。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明作进一步详细说明。实施例1
⑴将高产葡萄糖氧化酶的点青霉接种装有马铃薯琼脂培养基(PDA培养基)的10 cm微生物培养皿，28 °C培养40 h ；
所述马铃薯琼脂培养基配制去皮马铃薯200 g煮汁30 min，4层纱布过滤，滤液中添加葡萄糖20 g，琼脂15 g，补蒸馏水至1000 ml，115°C灭菌20 min，铺平皿备用；
⑵种子培养液体种子培养基配方5wt %优质绵白糖，0.1 wt% KH2P04, 0.1 wt% NaCl，0. 02wt% MgS04 · 7H20, 0. 2 wt% NaN03 :0.0015wt % FeCl3，0. 1 wt% CaCl2，蒸馏水配制，PH自然)，经115 °C灭菌20 min后，将培养皿中活化的点青霉转接液体种子培养基，接种量为一个10 cm培养皿接种500 ml液体种子培养基；接种后于培养至大量形成孢子；
⑶固体发酵培养基的配制将节碎米与米糠按10: 1的比例混合，100°C蒸煮30 min ； ⑷接种培养固体发酵培养基摊凉后，接种点青霉种子，接种量为500 ml种子培养液接种500 kg培养基，混合均勻，装入铺有麻袋的竹筐中，再以麻袋覆盖，当温度上升到45°C 时，倒出培养基，搅拌冷却，再装入原竹筐中，直至培养基表面出现淡绿色的霉点，转入发酵床，28 °C，加湿通风条件下培养60 h ；
⑶固体发酵结束后，将培养基置于115 °C干燥2 h。粉碎至80目，即成。采用下述葡萄糖氧化酶活力测定方法对各实施例产品的酶活力进行检测
2.5 ml邻联茴香胺缓冲液(0. 1 g邻联茴香胺，溶于10 ml pH6. 0磷酸缓冲液，实验前取0.1 ml邻联茴香胺溶液，加入到12 ml缓冲液中使用)，加入0.3 ml 18%葡萄糖溶液(称取D-无水葡萄糖18g，溶于IOOml蒸馏水中)，加入0. 1 ml 0. 03%过氧化物酶溶液(称取辣根过氧化物酶10 mg溶于30 ml蒸馏水)，25°C保温3 min加入稀释好的酶液读出OD46tl在1 min的变化值。1个单位的葡萄糖氧化酶的活性(1 U)定义为在25°C，pH 6.0的测定条件下葡萄糖氧化酶催化葡萄糖每分钟生成ι μ mol H2O2的酶量为一个单位。经检测，本实施例产品的酶活力为203 U。实施例2
⑴将高产葡萄糖氧化酶的点青霉接种装有马铃薯琼脂培养基(PDA培养基)的10 cm微生物培养皿，30 °C培养36 h ；
所述马铃薯琼脂培养基配制去皮马铃薯200 g煮汁30 min，4层纱布过滤，滤液中添加葡萄糖20 g，琼脂15 g，补蒸馏水至1000 ml，115°C灭菌20 min，铺平皿备用；
⑵种子培养液体种子培养基配方10 wt%优质绵白糖，0. 15wt% KH2P04, 0. 15wt% NaCl, 0. 03 wt% MgS04 · 7H20, 0. 3wt% NaN03 :0. 003wt% FeC13, 0. 15wt% CaCl2,余为水，pH自然，经115 °C灭菌30 min后，将培养皿中活化的点青霉转接液体种子培养基，接种量为一个10 cm培养皿接种1000 ml液体种子培养基；接种后于30°C培养至大量形成孢子；
⑶固体发酵培养基的配制节碎米、米糠按10: 3的比例混合，100°C蒸煮40 min ；⑷接种培养固体发酵培养基摊凉后，接种点青霉种子，接种量为600 ml种子培养液接种500 kg培养基，混合均勻，装入铺有麻袋的竹筐中，再以麻袋覆盖，当温度上升到45°C 左右时，倒出培养基，搅拌冷却，再装入原竹筐中，直至培养基表面出现淡绿色的霉点，转入发酵床，30 °C，加湿通风条件下培养50 h；
( 固体发酵结束后，将培养基置于120 °C干燥3 h。粉碎至80目即成。经检测，本实施例产品的酶活力为221 U。以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，均仍属于本发明的保护范围。
权利要求
1. 一种饲用葡萄糖氧化酶的生产方法，其特征在于，包括以下步骤(1)将高产葡萄糖氧化酶的点青霉接种装有马铃薯琼脂培养基的10cm微生物培养皿，25 30 °C培养36 48 h ；所述马铃薯琼脂培养基配制去皮马铃薯200 g煮汁30 min，4层纱布过滤，滤液中添加葡萄糖20 g，琼脂15 g，补蒸馏水至1000 ml，115°C灭菌20 min，铺平皿备用；(2)种子培养液体种子培养基经115 121 °C灭菌20 30 min后，将步骤(1)培养皿中活化的点青霉转接液体种子培养基，接种量为一个10 cm培养皿接种500 1000 ml 液体种子培养基；接种后于25 30°C培养60 72 h ；所述液体种子培养基配制1 6wt%绵白糖，0. 05 0. 2wt% KH2PO4, 0. 05 0. 2wt%NaCl, 0. 01 0. 06wt%MgS04 ·7Η20，0· 1 0. 4wt% NaNO3 :0. 001 0. 025wt% FeCl3, 0. 05 0. 2wt % CaCl2，余为水，pH 自然，115°C灭菌 20 min 备用；(3)固体发酵培养基的配制将节碎米与米糠按10:1 3的重量比混合，90 100°C 蒸煮25 40 min ；(4)接种培养固体发酵培养基摊凉后，接种步骤(2)得到的点青霉种子，接种量为 500 1000 ml种子培养液接种500 kg培养基，混合均勻，装入铺有麻袋的竹筐中，再以麻袋覆盖，直至点青霉孢子萌发后，转入发酵床，25 30 °C，加湿通风条件下培养48 60 h；(5)固体发酵结束后，将培养基置于100 120°C干燥2 4 h，粉碎至40 80目， 即成。
全文摘要
以稻谷加工副产物为原料生产饲用葡萄糖氧化酶的方法，其包括以下步骤(1)将高产葡萄糖氧化酶的点青霉接种装有PDA培养基的10cm微生物培养皿进行培养；(2)种子培养液体种子培养基经115～121℃灭菌20～30min后，将步骤(1)培养皿中活化的点青霉转接液体种子培养基；(3)固体发酵培养基的配制将节碎米与米糠按10∶1～3的重量比混合，90～100℃蒸煮25～40min；(4)接种培养固体发酵培养基摊凉后，接种点青霉种子进行培养；(5)固体发酵结束后，将培养基置于100～120℃干燥2～4h，粉碎至40～80目。本发明原料来源广，无“三废”产生，工艺简单，产品葡萄糖氧化酶活力高达200U。
文档编号C12R1/80GK102220295SQ20111013857
公开日2011年10月19日 申请日期2011年5月26日 优先权日2011年5月26日
发明者刘俊文, 周慧, 杨涛, 林亲录 申请人:长沙理工大学