专利名称：一种筛选PknB抑制剂的反应体系及其筛选方法
技术领域：
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种PknB抑制剂的反应体系及其筛选方法。
背景技术：
结核分枝杆菌(Mycobacteria tuberculosis, Mtb)是人类肺结核(TB)的病原体。肺结核是一种严重威胁人类健康的传染病，在全球范围内每年造成多达三百万人死亡。AIDS的蔓延和多重耐药菌株的出现使肺结核的防控形势异常严峻，传统药物已不能满足需要。因此，必须加紧新型抗结核药物的研发。药物筛选模型的建立及潜在药物的筛选处于药物研发链条的最上游，为了开发出更加有效安全的新型抗结核药物，首先必须建立高效的药物筛选模型。
蛋白激酶PknB是其中的一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可以磷酸化包括其自身在内的多种底物蛋白。已有研究结果显示，PknB参与多种重要生理进程的调控，为结核分枝 杆菌生存所必需，具体包括1.调控生长分裂，细胞形态以及细胞壁合成；2.调控热应激等多种应激反应；3.调控谷氨酸代谢。有关PknB的生理功能仍在进一步的研究中，但其作为潜在药物靶点的地位已得到广泛认同。但采用哪些反应体系、以及如何更快、更有效地筛选PknB抑制剂，是亟待解决的技术问题。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题是开发一种用于筛选PknB抑制剂的反应体系，并建立一种基于蛋白激酶PknB的药物筛选方法。为了解决上述技术问题，本发明提供一种用于筛选PknB抑制剂的反应体系，以及一种筛选PknB抑制剂的方法。本发明的技术方案如下。本发明用于筛选PknB抑制剂的反应体系含有如下浓度的反应物
反应物终浓度
Tris-HCl, pH 7.4 15 35mM MgCl22 8mM
MnCl2I 5mM
ATP80~120^iM
PknB4.5 5.5(ig/50(il。优选地，本发明的反应体系含有如下浓度的反应物反应物终浓度
Tris-HCl, pH 7.4 25mM MgCl25mM
MnCl22mM
ATPI OOpM PknB5(ig/50(il。本发明还提供一种筛选PknB抑制剂的方法，包括如下步骤步骤(I)配置如下反应体系
反应物终浓度
Tris-HCl, pH 7.415 35mM
MgCl22 8mM
MnCl2I 5mM
ATP80~120^iM
PknB4.5~5.5(ig/50(xl 步骤(2)设置如下各反应组i)样品实验组取步骤⑴所述的反应体系，加入I V- L浓度为lmg/mL 10mg/mL的样品溶液；ii)阴性实验组取步骤⑴所述的反应体系，加入I U L DMSO ；iii)阳性对照组取步骤(I)所述的反应体系，加入终浓度为60 u g/ml的星形孢菌素；步骤(3)制备荧光素酶反应液采用Pomega 公司的 Kinase Glo Luminescent Kinase Assay 试剂盒进行活性测定，试剂盒中包括Kinase Glo 缓冲液和Kinase Glo 底物；将Kinase Glo 缓冲液在37°C下溶解，与Kinase Glo 底物充分混合，形成绿色澄清的溶液，即荧光素酶反应液；步骤(4)筛选将步骤(I)的各反应组在酶标仪中分别反应ISOmin后，加入荧光素酶反应液，测定各反应组荧光值，计算反应抑制率，对反应具有抑制作用的即为阳性样品。优选地,所述反应体系为反应物终浓度
Tris-HCl, pH 7.425mM
MgCl25mM
MnCl22mM
ATPI OOpM
PknB5(ig/50(il。优选地，其中步骤⑵中样品为化合物时，向50 ii L反应体系中加入I U L的Img/mL的样品溶液作为样品实验组。优选地，其中步骤(4)为将步骤(2)中各反应组分别混匀后加入同一块96孔板 中，置于酶标仪内，开启温控为37°C进行反应,反应180min后取出，每孔均加入50 y L荧光素酶反应液，置于酶标仪中测定每孔荧光值，每孔测定持续时间ls，测定次数I次；按以下公式计算各孔的抑制率
AF^ - AF^
打剀-IR(%)=X 100%
AFn 一 AFp其中A Fn是阴性对照孔荧光值，A Fp是阳性对照孔荧光值，A Fs是样品实验孔荧光值。优选地，抑制率大于30%的样品为阳性样品。本发明的有益效果如下。本发明选择的蛋白激酶PknB作为药物筛选的靶点具有其独特的优点。PknB与其它蛋白激酶在结构以及催化特性方面的差异将有利于避免交叉耐药的问题。另外，PknB在不同细菌中的序列比较保守，而且与真核生物的同种功能的蛋白之间不具有相关性，有利于筛选到对结核分枝杆菌有效的抗生素，而且所筛选到的化合物对人体的毒性也会很小。因此用PknB筛选抗结核的药物的靶点，建立崭新、低毒、高效的筛选模型。因此，本发明筛选PknB抑制剂的方法所选择的靶点特异性高，并通过分子生物学技术和细胞生物学技术建立体外高通量筛选模型。本发明的PknB酶活测定体系与传统的方法相比，简单可靠，方便易行。本发明PknB抑制剂的筛选方法简单可靠，效率高，成本低，是一种理想的抗生素筛选方法。
具体实施方案以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例I样品筛选本发明中以结核分枝杆菌PknB酶为例，说明抗菌药物的筛选方法。一、重组PknB蛋白的制备I、pET28ab/pknB 质粒的构建以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板，通过PCR方法扩增pknB基因N端序列。引物序列为上游引物5’ TAACATATGACCACCCCTTCCCA3’ ;下游引物5 ATAAGCTTCTAACCGTTGTGCACGCGGA 3’。斜体部分分别是 Nde I 和 Hind III 的酶切位点。PCR反应体系包括
权利要求
1.一种用于筛选PknB抑制剂的反应体系，其特征在于，含有如下浓度的反应物反应物终浓度 Tris-HCl, pH 7.4 15 35mM MgCl22 8mM MnCl2I 5mM ATP80~120^iMPknB4.5 5.5(ig/50(il。
2.根据权利要求I所述的反应体系，其特征在于，含有如下浓度的反应物反应物终浓度 Tris-HCl, pH 7.4 25mM MgCl25mM MnCl22mMATPI OOpMPknB5(ig/50(il。
3.一种筛选PknB抑制剂的方法，包括如下步骤 (1)配置如下反应体系反应物终浓度 Tris-HCl, pH 7.4 15 35mM MgCl22 8mM MnCl2I 5mM ATP80~120^iMPknB4.5~5.5(ig/50(xl; (2)设置如下各反应组 i)样品实验组取步骤⑴所述的反应体系，加入IU L浓度为lmg/mL 10mg/mL的样品溶液； ii)阴性实验组取步骤(I)所述的反应体系，加入Iu L DMSO ；iii)阳性对照组取步骤⑴所述的反应体系，加入终浓度为60yg/ml的星形孢菌素； (3)制备荧光素酶反应液 取Kinase Glo 缓冲液在37°C下溶解，与Kinase Glo 底物充分混合，形成绿色澄清的溶液，即荧光素酶反应液； (4)筛选 将步骤(I)的各反应组在酶标仪中分别反应ISOmin后，加入步骤(3)配制的所述荧光素酶反应液，测定各反应组荧光值，计算反应抑制率，对反应具有抑制作用的即为阳性样品O
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述反应体系为
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，其中步骤(2)中样品为化合物时，向50 u L反应体系中加入I U L的lmg/mL的样品溶液作为样品实验组。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，其中步骤(4)为将步骤(2)中各反应组分别混匀后加入同一块96孔板中，置于酶标仪内，开启温控为37°C进行反应，反应ISOmin后取出，每孔均加入50 y L荧光素酶反应液，置于酶标仪中测定每孔荧光值，每孔测定持续时间ls，测定次数I次；按以下公式计算各孔的抑制率 其中AFn是阴性对照孔荧光值，AFp是阳性对照孔荧光值，AFs是样品实验孔荧光值。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，抑制率大于30%的样品为阳性样品。
全文摘要
本发明提供一种用于筛选PknB抑制剂的反应体系，以及利用该体系筛选PknB抑制剂的方法。本发明的筛选方法包括配置反应体系、设置反应组、制备荧光素酶反应液和筛选。本发明PknB抑制剂的筛选方法简单可靠，效率高，成本低，是一种理想的抗生素筛选方法。
文档编号C12Q1/66GK102796807SQ20111013845
公开日2012年11月28日 申请日期2011年5月25日 优先权日2011年5月25日
发明者余利岩, 黄彬, 赵莉莉, 苏静, 李秋萍, 魏玉珍, 张玉琴 申请人:中国医学科学院医药生物技术研究所