专利名称：氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌及其构建方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及-构建方法。
-株氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌及其
背景技术：
木糖醇为天然的五碳糖醇，是重要的功能性食品添加剂之一。木糖醇的甜度是蔗糖的1.05倍，热量与蔗糖相当，其代谢不需要胰岛素，可替代蔗糖作为糖尿病患者食用的甜味剂。木糖醇不被细菌发酵，用在口香糖中作为甜味剂，具有维持口腔酸碱平衡、预防龋齿的功能。有研究表明，木糖醇可阻止细菌与人体细胞的结合，预防呼吸道感染；木糖醇还有促进肠道对钙质的吸收，减少骨质流失，维持正常骨密度以及降低肝脏转氨酶等作用。随着人们对健康重视程度的增加，木糖醇的需求量将会越来越高。目前木糖醇生产方法主要为化学法即采用玉米芯、甘蔗渣等富含聚戊糖(含36 40%的多缩戊糖)的原料，经酸水解成含木糖的糖液，然后经中和、脱色、离子交换、结晶等复杂的净化过程从水解液中分离纯化出木糖，接着化学加氢使木糖生成木糖醇。化学法制备木糖醇存在两大共同问题(1)资源和环境污染问题严重。研究表明生产1吨木糖醇，会产生6吨酸性玉米芯残渣，而处理这些残渣则需要2吨煤。由于环保问题难以解决，2005年， 全球最大的食品添加剂公司-丹尼斯克关闭了一条1万吨/年木糖醇的生产线。(2)原料价格走高，并存在潜在的原料短缺风险。由于近年来我国玉米芯大量用于生产木糖醇、糠醛和食用菌，原料问题已经凸现，这样导致木糖醇的生产成本增加。为了解决木糖醇生产中的资源和环境问题，许多人致力于开发一种采用来源广泛、价格低廉的淀粉或葡萄糖为原料来生产木糖醇。如Onishi和Suzuki报道了一种从葡萄糖出发制备木糖醇的方法，首先通过高渗酵母D. hansenii将葡萄糖转化为D-阿拉伯糖醇(D-arabitol, D-ara)，然后在Acetobacter suboxydans的作用下氧化为D-木酮糖，最后D-木酮糖在酵母C. guilliermondii作用下还原为木糖醇。如日本味之素株式会社Suzuki等选育到一株将阿拉伯糖醇一步高效生物转化为木糖醇的氧化葡萄糖酸杆菌 (Gluconobacter oxydans)，将木糖醇生物合成路线简化为两菌两步法，第一步利用酵母菌
发酵葡萄糖高效制备D-阿拉伯糖西艺路线如下
权利要求
1.一种氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌，其特征在于该细菌是缺失S-ArDH基因，且在 S-ArDH基因的位置上用)(DH基因增强的氧化葡萄糖酸杆菌(GluconcAacteroxydans)。
2.权利要求1所述的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于该方法包括如下步骤(1)引物设计根据GenBank公布的Gluconobacteroxydans 621H基因为基础设计两对特异引物，引物如下所示s-ardh L-fwd 5' -TATGAATTCCCTCTTGAAAACCTATCATAGC-3‘ EcoR I， s-ardh L-rev :5’ -CTGTTTATGTAAGCCTCGAGAAACTTGAAGTCC-3’ Xho I， s-ardh R-fwd 5' -AATAAACAAATAGCTCGAGAAAATGGCCGGGAAG-3' Xho I， s-ardh R-rev :5’ -ATGAATTCATGGCGACTGTCGAACTCAAG-3' EcoR I ；(2)s-ardh L、s-ardh R 基因的克隆通过 PCR 技术，以 Gluconobacter oxydans 菌株基因组DNA为模板，分别扩增s-ardh L和s-ardh R各800bp序列；(3)抗性片段Km的获得根据GenBank公布的卡纳霉素抗性基因Km序列，设计一对特异性引物km-fwd和km-rev，以pET28a(+)质粒为模板扩增Km的完整⑶s，引物如下km-fwd :5’ -GGACTTCAAGTTTCTCGAGGCTTACATAAACAG-3' Xho I， km-rev :5，-CTTCCCGGCCATTTTCTCGAGCTATTTGTTTATT-3' Xho I， km-fwd和km-rev引物两端加同样的限制性酶切位点B10 I及保护碱基，下划线部分均为酶切位点，扩增出900bp序列；(4)pMD 18-KR的构建将s-ardh R和Km片段通过重叠PCR方法连接，获得大小为 1700bp的片段KR，与pMD18-T载体连接，转化至感受态Ε. coli JM109中，通过含Amp和Km 抗性平板筛选获得含目标基因的重组质粒PMD18-KR ；(5)pMD18-LKR的构建将s-ardhL和KR片段通过重叠PCR方法连接，获得大小为 2500bp的片段LKR，与pMD18-T载体连接，转化至感受态Ε. coli JM109中，通过含Amp和Km 的LB平板筛选获得含目标基因的重组质粒pMDIS-LKR ；(6)s-ardh基因敲除载体pSUP202-s-ardh: :Km的构建将重组质粒pMD18_LKR用EcoR I酶切；载体PSUP202用EcoR I酶切后用CIAP去磷酸化；将酶切后的LKR片段和去磷酸化后的载体PSUP202用"Γ4连接酶连接，转化至感受态E. coli JM109中，通过含Amp和Km的 LB平板筛选获得含目标基因的重组质粒pSUP202-S-ardh: :Km ；(7)s-ardh 基因敲除突变体 G. oxydans s-ardh: :Km mutant NSA18 的获得将含敲除突变载体pSUP202-s-ardh: :Km的Ε. coli JM109作为供体菌用于三亲接合，受体菌为 G. oxydans ；敲除突变载体在帮助菌pRK2013的帮助下进入G. oxydans，将含Km基因的目标基因片段整合到G. oxydans的染色体上，通过Cefotaxime、Km来筛选三亲接合子；(8)引物设计根据GenBank公布的Gluconobacteroxydans 621H基因为基础设计两对特异引物，引物如下所示xdh-fwd :5’ -AGGCTCGAGTCGAAGAAGTTTAAG-3’ Xho I， xdh-rev :5’ -ATTCTCGAGTCAACCGCCAGCAAT-3’ Xho I ；(9)xdh基因的克隆通过PCR技术，以Gluconobacter oxydans菌株基因组DNA为模板，扩增800bpxdh序列；(10)xdh基因增强载体pSUP202-S-ardh: xdh的构建将含目标基因的质粒pMD18-xdh用Β ο I酶切，胶回收目的片段；载体pSUP202-s-ardh: :Km用)(ho I酶切后用CIAP去磷酸化；将酶切后的目的片段和去磷酸化后的载体用T4连接酶连接，转化至感受态E. coli JM109中，通过含Amp和Km抗性平板筛选获得含目标基因的重组质粒 pSUP202-s-ardh::xdh ；(11) xdh基因增强突变体G. oxydans s-ardh xdh NSAX31的获得将含敲除突变载体pSUP202-s-ardh::xdh的Ε. coli JM109作为供体菌用于三亲接合，受体菌为 G. oxydanss-ardh: :Km mutant NSA18 ；敲除突变载体在帮助菌pRK2013的帮助下进入 G. oxydansNSA18，将含xdh基因的目标基因片段整合到G. oxydans NSA18的染色体上；通过 Cefotaxime、Km来筛选三亲接合子。
3.根据权利要求2所述的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于步骤 (9)中，xdh基因克隆的方法为采用PCR技术，以Gluconobacter oxydans菌株基因组DNA 为模板，用引物xdh-fwd、xdh-rev进行PCR扩增，PCR反应条件为=IOXPCR buffer5 μ L, Mg2+ 2 μ L，dNTP 5 μ L，弓 |物 xdh-fwd 禾口 xdh—rev 各 2 μ L，exTaq DNA polymerase 1 μ L，基因组模板1 μ L，加(MH2O至反应总体积为50 μ L ；PCR程序为94°C预变性^iiin ；94°C变性 30s, 53. 6°C退火 30s，72°C延伸 lmin，循环 30 次；72°C延长 lOmin。
4.根据权利要求2所述的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于步骤(11)中，三亲接合增强的方法为将供体菌E. coli JM109/pSUP202-S-ardh::Xdh、帮助菌JM109/pRK2013分别接种在加有氨苄青霉素和卡纳霉素的LB培养基中培养过夜，受体菌 G. oxydans s-ardh: :Km mutant NSA18 接种在 G-Ara 培养 15 20h，A660 值为 0. 6 1. O 时进行接合实验；按受体亲本菌帮助菌供体菌=3:1:3的菌液体积比收集菌体，转移到不加抗生素的固体G-Ara培养基上，倒置30°C培养过夜；用G. oxydans具有的抗性加上重组质粒上带有的抗性，来筛选相应的转化子；将培养过夜的三亲接合菌体用无菌双蒸水从固体G-Ara培养基上洗下，涂到加入头孢噻肟酸的G-Ara平板上，培养2 4天，长出接合子进行PCR验证。
全文摘要
本发明公开了一种氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌，该细菌是缺失s-ArDH基因的氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)。本发明还公开了一种氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌，该细菌是缺失s-ArDH基因，且在s-ArDH基因的位置上用XDH基因增强的氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)。本发明同时公开了上述两种基因工程菌的构建方法。本发明的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌可以阻断生物法转化D-阿拉伯糖醇制备木糖醇过程中木酮糖逆反应生成D-阿拉伯糖醇，进而从根本上解决木糖醇生产过程中副产物伴生的问题，此外，XDH增强菌株提高了木糖醇脱氢酶活力，提高了木糖醇的转化率。
文档编号C12P19/02GK102250820SQ20111013841
公开日2011年11月23日 申请日期2010年6月3日 优先权日2010年6月3日
发明者冯小海, 徐虹, 朱宏阳, 李莎 申请人:南京工业大学