专利名称：一种利用离子束生物工程诱变微藻生产二十二碳六烯酸的方法
技术领域：
本发明涉及生物工程技术领域，尤其是微藻发酵法生产多不饱和脂肪酸的方法。
背景技术：
二十二碳六烯酸(DHA)属于多不饱和脂肪酸(PUFAs)的一种，是动物细胞膜磷脂的重要组成成分，决定了细胞膜的流动性和变形性。对多种疾病和某些癌症的预防和治疗有重要作用，足量的PUFAs的摄入对胎儿和幼儿视觉和神经的发育至关重要。欧美国家现在对于DHA的应用较为广泛，主要应用于食品和保健药品中。在食品中的应用包括婴儿奶粉、牛奶、奶酪、食用植物油脂、烘焙油脂等，消费者对于DHA的认知度和认可度也比较高。 DHA的配方奶粉在很多国家已经上市，形成DHA在婴幼儿配方食品中的应用热潮。我国DHA 在食品中的应用还处于起步阶段，DHA在国内的主要应用集中在婴幼儿配方奶粉中，国内一些著名企业陆续推出添加DHA的产品，目前大多数消费者对DHA的认识仅停留在对婴幼儿的脑部发育作用，而忽略了或根本就未意识到DHA在人的一生中的作用。基于DHA的摄取应长期通过膳食中的低摄入量逐步的累积的观点，食用植物油作为人们日常膳食中不可缺少的物质，是人们通过膳食中低量摄人逐步的累积DHA最好的载体。当前食品工业上使用的二十二碳六烯酸多属于从海洋捕捞的鱼类的鱼油中获得， 此法成本高昂，消耗海洋资源，且原料品质受环境因素影响较大。有少量来自海洋微藻，多数为国外公司垄断，未见其藻种选育方法。我们选用采用的微藻隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)为异养型微藻，无需光照培养，工程化培养实现简单，培养方式接近常规工业发酵， 便于利用原有设备和技术工艺。而其DHA积累含量高，一般能达到总脂的30-50%，而且其他多不饱和脂肪酸的含量在以下，特别是不含EPA，使用安全。目前国际上已有利用的先例，如美国MARTECK公司推出的孕产妇用DHA胶囊已获美国FDA食品认证，其生产上使用的藻种即隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)。业界有利用微藻的自养作用在光培养反应器中合成多不饱和脂肪酸，但自养培养设备复杂，产出率低。且藻液内含有效成分浓度低，不利于下游分离纯化。
发明内容
本发明的目的是提供一种选育方法简单，成本较低，选育周期短的菌株的诱变筛选方法。本发明采用如下技术方案a)以隐甲藻为诱变出发藻，本发明所用出发藻种可以购自藻种保藏中心，也可以常规方法从海洋水体中筛选。使用亚硝基胍作为化学诱变剂进行预处理；b)以隐甲藻为诱变出发藻，按一般方法制涂平板，并放入离子注入机靶室内进行离子注入，靶室内真空度为1 X 10_2乇-1χ10_3乇，注入离子为N+，离子注入能量为5-lOKev， 注入剂量为2. 5X1014-5X1014N7cm2，离子注入完成后，进行单菌落筛选，以摇瓶培养的二是二碳六烯酸产率为标准，以高出对照组10%的摇瓶中挑选高产藻种，反复多次进行离子注入诱变和选育，以二十二碳六烯酸产率大于2g/L，即获得用离子束生物工程诱变的高产藻种。本发明的有益效果为，DHA菌种选育方法简单，成本较低，选育周期短，利用微藻生产DHA具有大规模生产的潜力，具有良好的经济效益和社会效益，也有利于维持生态平衡和保护自然资源。DHA后续提取制备简单，得率高使用范围广，能够为食品、保健品及其相关的疾病治疗提供新的原料来源。并且，使用该藻种总油脂含量可提高1-3倍；使用此藻种油脂中二十二碳六烯酸含量可提高1-3倍；发酵设备条件简单，发酵原料便宜。
具体实施例方式下面根据实施例对本发明作进一步详细说明。实施例1一种利用离子束生物工程诱变微藻生产二十二碳六烯酸的方法，包括如下步骤1)化学诱变选择隐甲藻作为出发藻种，按照常规方法经过斜面培养，接种子瓶在25°C培养室培养，把培养三天左右的种液中的微藻用人造海水溶液稀释，稀释度控制在 100倍以内。然后将稀释所得到的微藻悬浮液按照特定比例与化学诱变剂溶液亚硝基胍溶液混合。25°C以下，处理20分钟；然后在离心机中离心5分钟，丢掉上清液，再加入人造海水。其中，本发明所用到的亚硝基胍溶液的浓度为0. lg/L化学诱变剂与微藻悬浮液的体积比例为1 10。2)离子束诱变把经上述处理过的藻液均勻涂布在无菌空白培养基上，加20%甘油保护，用无菌风风干。再将涂布有微藻的平板放置入离子注入机靶室内进行离子注入， 靶室内的真空度大概在1χ10_2乇。以N+为注入离子，离子注入能量为5Kev，注入剂量为 2. 5 X IO14NVcm203)离子注入完成后，使用固体培养基进行单藻筛选，以摇瓶培养的二十二碳六烯酸产率为标准，以高出对照组10%的摇瓶中挑选高产藻种，反复多次进行离子注入诱变和选育，以二十二碳六烯酸产率大于2g/L，即获得用离子束生物工程诱变的高产藻种。实施例2一种利用离子束生物工程诱变微藻生产二十二碳六烯酸的方法，包括如下步骤1)化学诱变选择隐甲藻作为出发藻种，按照常规方法经过斜面培养，接种子瓶在25°C培养室培养，把培养三天左右的种液中的微藻用人造海水溶液稀释，稀释度控制在 100倍以内。然后将稀释所得到的微藻悬浮液按照特定比例与化学诱变剂溶液亚硝基胍溶液混合。27°C以下，处理25分钟；然后在离心机中离心5分钟，丢掉上清液，再加入人造海水。其中，本发明所用到的亚硝基胍溶液的浓度为0. 2g/L化学诱变剂与微藻悬浮液的体积比例为1 10。2)离子束诱变把经上述处理过的藻液均勻涂布在无菌空白培养基上，加 20-30%甘油保护，用无菌风风干。再将涂布有微藻的平板放置入离子注入机靶室内进行离子注入，靶室内的真空度大概在lxlO—2乇。以N+为注入离子，离子注入能量为7Kev，注入剂
4量为 3 X IO14NVcm203)离子注入完成后，使用固体培养基进行单藻筛选，以摇瓶培养的二是二碳六烯酸产率为标准，以高出对照组15%的摇瓶中挑选高产藻种，反复多次进行离子注入诱变和选育，以二十二碳六烯酸产率大于2g/L，即获得用离子束生物工程诱变的高产藻种。实施例3一种利用离子束生物工程诱变微藻生产二十二碳六烯酸的方法，包括如下步骤1)化学诱变选择隐甲藻作为出发藻种，按照常规方法经过斜面培养，接种子瓶在25°C培养室培养，把培养三天左右的种液中的微藻用人造海水溶液稀释，稀释度控制在 100倍以内。然后将稀释所得到的微藻悬浮液按照特定比例与化学诱变剂溶液亚硝基胍溶液混合。30°C以下，处理30分钟；然后在离心机中离心5分钟，丢掉上清液，再加入人造海水。其中，本发明所用到的亚硝基胍溶液的浓度为0. 3g/L化学诱变剂与微藻悬浮液的体积比例为1 10。2)离子束诱变把经上述处理过的藻液均勻涂布在无菌空白培养基上，加30%甘油保护，用无菌风风干。再将涂布有微藻的平板放置入离子注入机靶室内进行离子注入， 靶室内的真空度大概在1χ10_3乇。以N+为注入离子，离子注入能量为lOKev，注入剂量为 5 X IO14NVcm203)离子注入完成后，使用固体培养基进行单藻筛选，以摇瓶培养的二是二碳六烯酸产率为标准，以高出对照组20%的摇瓶中挑选高产藻种，反复多次进行离子注入诱变和选育，以二十二碳六烯酸产率大于2g/L，即获得用离子束生物工程诱变的高产藻种。显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化和变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
权利要求
1.一种利用离子束生物工程诱变微藻生产二十二碳六烯酸的方法，其特征在于包括以下步骤1)化学诱变选择隐甲藻作为出发藻种，按照常规方法经过斜面培养，接种子瓶在 25°C培养室培养，把培养三天左右的种液中的微藻用人造海水溶液稀释，稀释度控制在100 倍以内；2)离子束诱变把经上述处理过的藻液均勻涂布在无菌空白培养基上，加20-30%甘油保护，用无菌风风干，再将涂布有微藻的平板放置入离子注入机靶室内进行离子注入；3)离子注入完成后，使用固体培养基进行单藻筛选，以摇瓶培养的二十二碳六烯酸产率为标准，以高出对照组10% -20%的摇瓶中挑选高产藻种，反复多次进行离子注入诱变和选育，以二十二碳六烯酸产率大于2g/L，即获得用离子束生物工程诱变的高产藻种。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤1)包括如下步骤将稀释所得到的微藻悬浮液按照特定比例与化学诱变剂亚硝基胍溶液混合，在25°C -30°C处理20-30 分钟；然后在离心机中离心5分钟，去掉上清液，再加入人造海水。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于步骤2)中靶室内的真空度大概在lxlO—2乇-lxlO—3乇；以N+为注入离子，离子注入能量为5-lOKev，注入剂量为 2. 5X1014-5 X IO14NVcm20
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述亚硝基胍溶液的浓度为0.Ig/ L-0. 3g/L，化学诱变剂与微藻悬浮液的体积比例为1 10。
全文摘要
本发明公开了一种利用离子束生物工程诱变微藻生产二十二碳六烯酸的方法，包括以下步骤1)化学诱变选择隐甲藻作为出发藻种，按照常规方法经过斜面培养，接种子瓶在25℃培养室培养，把培养三天左右的种液中的微藻用人造海水溶液稀释；2)离子束诱变把经上述处理过的藻液均匀涂布在无菌空白培养皿中，加20-30％甘油保护，用无菌风风干，再将涂布有微藻的平板放置入离子注入机靶室内进行离子注入；3)离子注入完成后，使用固体培养基进行单藻筛选，以摇瓶培养的二十二碳六烯酸产率为标准，以高出对照组10％-20％的摇瓶中挑选高产藻种。本发明具有选育方法简单，成本较低，选育周期短的优点。
文档编号C12R1/89GK102220307SQ201110138270
公开日2011年10月19日 申请日期2011年5月26日 优先权日2011年5月26日
发明者姚黎明 申请人:武汉中科光谷绿色生物技术有限公司