一种提取微藻中油脂的方法
【专利摘要】本发明涉及一种提取微藻中油脂的方法，包括以下步骤：步骤1、在密封反应器中，将微藻溶解于混合醇溶剂中，边震荡边加热萃取得到提取液；步骤2、将步骤1所得提取液进行离心分离以得到上清液，再用与步骤1中相同的混合醇溶剂将剩余渣滓洗涤多次并离心分离，将每次分离得到的液体与所述上清液汇合得到上清液汇合液；步骤3、将步骤2中得到的上清液汇合液旋转蒸发以除去混合醇溶剂得到粗油脂；步骤4、将步骤3中得到的粗油脂溶解到正己烷溶剂中以得到粗油脂溶液，将粗油脂溶液移至分液漏斗中，加入去离子水或者中性盐溶液洗涤多次以除去粗油脂溶液中的水溶性物质，然后收集洗涤后的粗油脂溶液上层有机相并旋转蒸发除去正己烷溶剂，得到总油脂。
【专利说明】一种提取微藻中油脂的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微藻生物【技术领域】，具体涉及一种提取微藻中油脂的方法。
【背景技术】
[0002]化石燃料的日益枯竭及其带来的环境污染使人们将更多的目光投向了生物可再生能源。而粮食类的生物能源会加剧粮食匮乏的危机，所以作为非粮食作物的微藻获得人们的青睐。微藻可以生长在各种水域环境，尤其是咸水水域和污水水域，不仅不与粮食作物争抢土地，还能起到净化环境的作用，微藻生长速度快，含油量高，同时还含有丰富的蛋白和糖类，可作为理想的动物饲料原料。
[0003]微藻中油脂的提取是生产生物柴油的关键步骤。目前采用的方法多为有机溶剂的提取，而多数的溶剂提取必须需要对微藻进行干燥。有机溶剂提取一般采用的溶剂为正己烷，甲醇/氯仿，乙醚，石油醚，乙醇，异丙醇等。除了常规的有机溶剂提取，还有超临界二氧化碳提取，液态二甲醚提取等，而这两种方法对提取设备以及人工操作有较高的要求。
[0004]中国专利CN102533430A提出了一种用甲醇和乙酸的混合液来提取油脂的方法。中国专利CN 102199482B提出了一种用纤维素酶和蛋白酶组成的混合酶处理产油微生物使其分解，然后再用有机溶剂进行油脂的萃取。中国专利CN101429467A提出了一种在湿藻中通入蒸汽使藻液形成溶浆，使细胞内的蛋白和油脂溶出，进而进行水提，可以分离出蛋白和油脂。在文献(Liu CZ, Zheng S，Xu L, Wang F，Guo C.Algal oil extractionfrom wet biomass of Botryococcus braunii by 1， 2-dimethoxyethane.AppliedEnergy.2013, 102: 971-974)中，作者提出了用 1，2-dimethoxyethane (二甲氧基乙烧)来提取布朗藻中的油脂，可以提取干藻和湿藻。在文献(Wang G, Wang T.Lipid andbiomass distribution and recovery from two microalgae by aqueous and alcoholprocessing.Journal of the American Oil Chemists’ Society 2012; 89(2):335-345)中，作者利用乙醇，在酶和超声的辅助下进行提取。在文献(Yao L, Gerde JAj Wang T.0ilextraction from microalga Nannochloropsis sp.with isopropyl alcohol.Journalof the American Oil Chemists’ Society 2012; 89 (12): 2279-2287)中，作者提出了用异丙醇在来提取微藻中的油脂。
[0005]从目前公开报导的方法来看，提取油脂的方法存在提取不充分，步骤繁琐，成本过高，溶剂有一定的毒性以及环境污染等问题。
【发明内容】
[0006]本发明设计了一种提取微藻中油脂的方法，其解决了现有技术中提取油脂的方法存在提取步骤繁琐，成本过高，溶剂有一定的毒性以及环境污染等的问题。
[0007]为了解决上述存在的技术问题，本发明采用了以下方案:
一种提取微藻中油脂的方法，其特征在于:包括以下步骤:
步 骤1、在密封反应器中，将微藻溶解于混合醇溶剂中，一边震荡，一边加热萃取得到提取液；
步骤2、将步骤I所得提取液进行离心分离以得到上清液，再用与步骤I中相同的混合醇溶剂将剩余渣滓洗涤多次并离心分离，将每次分离得到的液体与所述上清液汇合得到上清液汇合液；
步骤3、将步骤2中得到的上清液汇合液旋转蒸发以除去上清液汇合液中的混合醇溶剂，得到粗油脂；
步骤4、将步骤3中得到的粗油脂溶解到正己烷溶剂中以得到粗油脂溶液，将粗油脂溶液移至分液漏斗中，并加入去离子水或者中性盐溶液洗涤多次以除去粗油脂溶液中的水溶性物质，然后收集洗涤后的粗油脂溶液上层有机相并旋转蒸发除去正己烷溶剂，得到总油脂。
[0008]进一步，混合醇溶剂为甲醇和其他低碳醇中的一种或几种的混合液。
[0009]进一步，甲醇和其他低碳醇的体积比为1:10-10:1。
[0010]进一步，甲醇与其他低碳醇的体积比为0.5-2。
[0011]进一步，其他低碳醇包括乙醇或异丙醇。
[0012]进一步， 步骤I中微藻是干藻或湿藻。
[0013]进一步，微藻为小球藻或金球藻或绿藻。
[0014]进一步，步骤I中加热萃取的温度是0_120°C。
[0015]进一步，步骤I中加热萃取的温度是40_70°C。
[0016]进一步，步骤I中加热萃取的温度是70°C。
[0017]进一步，步骤I中萃取时浸提的次数为1-100次，总的浸提时间为1-500分钟。
[0018]进一步，步骤I中萃取时浸提的次数为1-10次，总的浸提时间为30-180分钟。
[0019]进一步，步骤I中混合醇溶剂和藻粉干重的比例为I =1-1000:1, V (ml):m(g)。
[0020]进一步，步骤I中混合醇溶剂和藻粉干重的比例为10 =1-50:1, V (ml):m(g)。
[0021]进一步，步骤I中混合醇溶剂和藻粉干重的比例为20:1，V (ml):m(g)。
[0022]进一步，步骤2中将提取液在5000rpm的转速下离心分离5min以得到上清液。
[0023]进一步，步骤2中用与步骤I中相同的混合醇溶剂将剩余渣滓洗涤两次并离心分离。
[0024]进一步，步骤4中用去离子水或者中性盐溶液，如氯化钠，氯化钾，硫酸钠等将粗油脂溶液洗涤三次以除去粗油脂溶液中的水溶性物质。
[0025]进一步，步骤4中加入的中性盐溶液是等体积的浓度为1%的硫酸钠溶液。
[0026]该提取微藻中油脂的方法具有以下有益效果:
(I)本发明提取微藻中油脂的方法，提取方法简单，易于操作，提取时间短，能够直接提取湿藻中的油脂，免去了微藻干燥的预处理步骤，能耗低，成本低，油脂的提取率较高。
[0027](2)本发明提取微藻中油脂的方法采用混合醇作为萃取溶剂，由于甲醇具有良好的穿透性，能够在常温下轻松的穿透细胞壁和细胞膜，从而进入细胞内进行油脂的提取，而乙醇或异丙醇有较高的油脂溶解度，将甲醇与乙醇或者异丙醇组成混合醇作为提取溶剂，兼有二者的优势。而且，与传统的甲醇和氯仿混合溶剂相比，乙醇和异丙醇都是水溶性的醇，他们能够直接提取湿藻中的油脂并且无毒无害。
[0028](3)本发明提取微藻中油脂的方法，萃取时采用浸提的方式，不需要其他物理，化学或生物等条件(如超声，搅拌，微波，酶解等)的辅助，方法简单，无污染。
[0029](4)本发明提取微藻中油脂的方法，其步骤I和步骤2中用同样的混合醇溶剂作为提取剂和洗涤剂，操作程序简单，也易于旋转蒸发时除去，节省操作程序，省时省力。
【具体实施方式】
[0030]下面结合具体实施例，对本发明做进一步说明:
实施例1
称取2g的干藻，将干藻溶解于密闭反应器中的溶剂中，并在70°C水浴条件下提取I小时得到提取液(该过程中浸提一次，时长I小时，下面的实施例亦然)，溶剂是40ml的甲醇与乙醇(体积比2:1)的混合溶剂；
将上述所得到的提取液在5000rpm的转速下离心分离5min以得到上清液，再用相应的溶剂，即甲醇与乙醇(体积比2:1)的混合液将剩余渣滓洗涤两次并离心分离，将每次分离得到的液体与上清液汇合得到上清液汇合液；
将上述汇合在一起的上清液汇合液旋转蒸发以除去上清液汇合液中的甲醇与乙醇的混合溶剂，得到粗油脂；
将得到的粗油脂溶解到正己烷溶剂中得到粗油脂溶液，将粗油脂溶液移至分液漏斗中，并加入等体积的浓度1%的硫酸钠溶液洗涤三次以除去粗油脂溶液中的水溶性物质，然后收集洗涤后的粗油脂溶液上层有机相并旋转蒸发除去正己烷溶剂，得到总油脂；
最终，粗油脂的回收率90.06%，总油脂的回收率为64.28%。
[0031]实施例2
称取2g的干藻，将干藻溶解于密闭反应器中的溶剂中，并在70°C水浴条件下提取I小时得到提取液，溶剂是40ml的甲醇与异丙醇(体积比2:1)的混合溶液；
将上述所得提取液在5000rpm的转速下离心分离5min以得到上清液，再用相应的溶剂，即甲醇与异丙醇(体积比2:1)的混合液将剩余渣滓洗涤两次并离心分离，将每次分离得到的液体与上清液汇合得到上清液汇合液；
将上述汇合在一起的上清液汇合液旋转蒸发以除去上清液汇合液中的甲醇与异丙醇的混合溶剂，得到粗油脂；
将得到的粗油脂溶解到正己烷溶剂中得到粗油脂溶液，将粗油脂溶液移至分液漏斗中，并加入等体积的浓度1%的硫酸钠溶液洗涤三次以除去粗油脂溶液中的水溶性物质，然后收集洗涤后的粗油脂溶液上层有机相并旋转蒸发除去正己烷溶剂，得到总油脂；
最终，粗油脂的回收率86.82%，总脂的回收率为47.86%。
[0032]实施例3
称取2g的干藻，将干藻溶解于密闭反应器中的溶剂中，并在70°C水浴条件下提取I小时得到提取液，溶剂是40ml的甲醇与乙醇(体积比1:2)的混合溶剂；
将上述所得提取液在5000rpm的转速下离心分离5min以得到上清液，再用相应的溶剂，即甲醇与乙醇(体积比1:2)的混合液将剩余渣滓洗涤两次并离心分离，将每次分离得到的液体与上清液汇合得到上清液汇合液；
将 上述汇合在一起的上清液汇合液旋转蒸发以除去上清液汇合液中的甲醇与乙醇的混合溶剂，得到粗油脂；将得到的粗油脂溶解到正己烷溶剂中得到粗油脂溶液，将粗油脂溶液移至分液漏斗中，并加入等体积的浓度1%的硫酸钠溶液洗涤三次以除去粗油脂溶液中的水溶性物质，然后收集洗涤后的粗油脂溶液上层有机相并旋转蒸发除去正己烷溶剂，得到总油脂；
最终，粗油脂的回收率84.34%，总脂的回收率为54.32%。
[0033]实施例4
称取2g的干藻，将干藻溶解于密闭反应器中的溶剂中，并在70°C水浴条件下提取I小时得到提取液，溶剂是40ml的甲醇与异丙醇(体积比1:2)的混合溶液；
将上述所得提取液在5000rpm的转速下离心分离5min以得到上清液，再用相应的溶剂，即甲醇与异丙醇(体积比1:2)的混合液将剩余渣滓洗涤两次并离心分离，将每次分离得到的液体与上清液汇合得到上清液汇合液；
将上述汇合在一起的上清液汇合液旋转蒸发以除去上清液汇合液中的甲醇与异丙醇的混合溶剂，得到粗油脂；
将得到的粗油脂溶解到正己烷溶剂中得到粗油脂溶液，将粗油脂溶液移至分液漏斗中，并加入等体积的浓度1%的硫酸钠溶液洗涤三次以除去粗油脂溶液中的水溶性物质，然后收集洗涤后的粗油脂溶液上层有机相并旋转蒸发除去正己烷溶剂，得到总油脂； 最终，粗油脂的回收率79.54%，总脂的回收率为42.53%。
[0034]实施例5
称取7g的湿藻(干重为2g)，将湿藻溶解于密闭反应器中的溶剂中，并在70°C水浴条件下提取I小时得到提取液，溶剂是40ml的甲醇与乙醇(体积比2:1)的混合溶剂；
将上述所得提取液在5000rpm的转速下离心分离5min以得到上清液，再用相应的溶剂，即甲醇与乙醇(体积比2:1)的混合液将剩余渣滓洗涤两次并离心分离，将每次分离得到的液体与上清液汇合得到上清液汇合液；
将上述汇合在一起的上清液汇合液旋转蒸发以除去上清液汇合液中的甲醇与乙醇的混合溶剂，得到粗油脂；
将得到的粗油脂溶解到正己烷溶剂中得到粗油脂溶液，将粗油脂溶液移至分液漏斗中，并加入等体积的浓度1%的硫酸钠溶液洗涤三次以除去粗油脂溶液中的水溶性物质，然后收集洗涤后的粗油脂溶液上层有机相并旋转蒸发除去正己烷溶剂，得到总油脂；
最终，粗油脂的回收率77.39%，总脂的回收率为92.02%。
[0035]实施例6
称取7g的湿藻(干重为2g)，将湿藻溶解于密闭反应器中的溶剂中，并在70°C水浴条件下提取I小时得到提取液，溶剂是40ml的甲醇与异丙醇(体积比2:1)的混合溶液；
将上述所得提取液在5000rpm的转速下离心分离5min以得到上清液，再用相应的溶剂，即甲醇与异丙醇(体积比2:1)的混合液将剩余渣滓洗涤两次并离心分离，将每次分离得到的液体与上清液汇合得到上清液汇合液；
将上述汇合在一起的上清液汇合液旋转蒸发以除去甲醇与异丙醇的混合溶剂，得到粗油脂；
将得到的粗油脂溶解到正己烷溶剂中得到粗油脂溶液，将粗油脂溶液移至分液漏斗中，并加入等体积的浓度1%的硫酸钠溶液洗涤三次以除去粗油脂溶液中的水溶性物质，然后收集洗涤后的粗油脂溶液上层有机相并旋转蒸发除去正己烷溶剂，得到总油脂；最终，粗油脂的回收率77.08%,总脂的回收率为88.06%。
[0036]实施例7
称取2g的干藻，将干藻溶解于密闭反应器中的溶剂中，并在40°C水浴下提取2.5小时得到提取液，溶剂是40ml的甲醇与乙醇(体积比2:1)的混合溶剂；
将上述所得提取液在5000rpm的转速下离心分离5min以得到上清液，再用相应的溶剂，即甲醇与乙醇(体积比2:1)的混合液将剩余渣滓洗涤两次并离心分离，将每次分离得到的液体与上清液汇合得到上清液汇合液；
将上述汇合在一起的上清液汇合液旋转蒸发以除去甲醇与乙醇的混合溶剂，得到粗油
月旨;
将得到的粗油脂溶解到正己烷溶剂中得到粗油脂溶液，将粗油脂溶液移至分液漏斗中，并加入等体积的浓度1%的硫酸钠溶液洗涤三次以除去粗油脂溶液中的水溶性物质，然后收集洗涤后的粗油脂溶液上层有机相并旋转蒸发除去正己烷溶剂，得到总油脂；
最终，粗油脂的回收率80.35%，总脂的回收率为45.32%。
[0037]在以上各实例中，震荡的速度以及料液比对于油脂的提取没有显著的影响。
[0038]本发明提取微藻中油脂的方法采用混合醇作为萃取溶剂，由于甲醇具有良好的穿透性，能够在常温下轻松的穿透细胞壁和细胞膜，从而进入细胞内进行油脂的提取，但是由于甲醇自身的溶解度过低，其油脂提取能力，尤其是中性油脂的提取能力很差；而乙醇和异丙醇虽然有较高的油脂溶解度，但是其细胞穿透能力不足。所以，考虑将甲醇与乙醇或者异丙醇组成混合醇作为提取溶剂，兼有二者的优势。传统的甲醇和氯仿混合溶剂虽然有很强的油脂提取能力，但是氯仿和水是不互溶的，所以该方法不能直接用来提取湿藻中的油脂。但是乙醇和异丙醇都是水溶性的醇，他们能够直接提取湿藻中的油脂并且无毒无害。
[0039]上面结合实施例对本发明进行了示例性的描述，显然本发明的实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种改进，或未经改进将本发明的构思和技术方 案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种提取微藻中油脂的方法，其特征在于:包括以下步骤: 步骤1、在密封反应器中，将微藻溶解于混合醇溶剂中，一边震荡，一边加热萃取得到提取液； 步骤2、将步骤I所得提取液进行离心分离以得到上清液，再用与步骤I中相同的混合醇溶剂将剩余渣滓洗涤多次并离心分离，将每次分离得到的液体与所述上清液汇合得到上清液汇合液； 步骤3、将步骤2中得到的上清液汇合液旋转蒸发以除去上清液汇合液中的混合醇溶剂，得到粗油脂； 步骤4、将步骤3中得到的粗油脂溶解到正己烷溶剂中以得到粗油脂溶液，将粗油脂溶液移至分液漏斗中，并加入去离子水或者中性盐溶液洗涤多次以除去粗油脂溶液中的水溶性物质，然后收集洗涤后的粗油脂溶液上层有机相并旋转蒸发除去正己烷溶剂，得到总油脂。
2.根据权利要求1所述的提取微藻中油脂的方法，其特征在于:混合醇溶剂为甲醇和其他低碳醇中的一种或几种的混合液。
3.根据权利要求2所述的提取微藻中油脂的方法，其特征在于:甲醇和其他低碳醇的体积比为1:10-10:1。
4.根据权利要求3所述的提取微藻中油脂的方法，其特征在于:甲醇与其他低碳醇的体积比为1:2-2:1。
5.根据权利要求1、2、3或4所述的提取微藻中油脂的方法，其特征在于:其他低碳醇包括乙醇或异丙醇。
6.根据权利要求1所述的提取微藻中油脂的方法，其特征在于:步骤I中微藻是干藻或湿藻，藻类为小球藻或金球藻或绿藻。
7.根据权利要求1所述的提取微藻中油脂的方法，其特征在于:步骤I中加热萃取的温度是0_120°C。
8.根据权利要求1所述的提取微藻中油脂的方法，其特征在于:步骤I中萃取时浸提的次数为1-100次，总的浸提时间为1-500分钟。
9.根据权利要求1或9所述的提取微藻中油脂的方法，其特征在于:步骤I中萃取时浸提的次数为1-10次，总的浸提时间为30-180分钟。
10.根据权利要求1所述的提取微藻中油脂的方法，其特征在于:步骤I中混合醇溶剂和藻粉干重的比例为1:1-1000:1, V (ml):m(g)。
【文档编号】C11B1/10GK103937604SQ201410137528
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月8日 优先权日:2014年4月8日
【发明者】冯嵬, 黄俊远 申请人:北京化工大学