专利名称：紫外诱变获得的栅藻属微藻突变株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物工程领域，具体而言，本发明涉及通过紫外诱变野生型栅藻属微藻0301A而获得的生长速度更快、产油量更高和/或虾青素产量更高的栅藻属微藻突变株。本发明还涉及上述微藻在生产生物柴油、处理污水、生产虾青素、生产鱼虾饵料或家禽家畜饲料和固定ω2中的应用。
背景技术：
随着人类长期而大量的使用化石燃料，导致全球二氧化碳浓度急剧升高，气候变暖，海平面上升，极端天气现象频发，全世界都面临着能源短缺和生态环境日益恶化的双重危机，因此寻求一种绿色的可持续发展的新能源成为世界各国的关注焦点。在众多的新能源项目中，利用微藻吸收二氧化碳并生产生物柴油越来越受到重视。微藻是一类在水中生长的种类繁多且分布极其广泛的低等植物，它能吸收并利用光能，通过微藻细胞高效的光合作用，将光能转化为脂肪或淀粉等化合物的化学能，并放出氧气。微藻是光合效率最高的原始植物，也是自然界中生长最为迅速的一种低等植物，而且某些微藻可以生长在高盐、高碱环境的水体中，可充分利用滩涂、盐碱地、沙漠进行大规模培养，也可利用海水、盐碱水、工业废水等非农用水进行培养，还可以利用工业废气中的 co2。利用微藻生产生物柴油能够解决目前使用植物原料发展生物柴油面临的耕地不足、气候变化对产量影响大和引起农作物价格上涨等突出问题。因此，微藻生物柴油作为可再生清洁能源成为了潜在的能源研究热点。栅藻属Scenedesmus隶属于绿藻门Chlorophyta，绿球藻目Chlorococcales，栅藻 Wkenedesmaceae，是淡水绿藻的一个大属，广泛分布于湖泊、池塘、沟渠、水坑等各种水体中，尤其在一些静止小水体中更为常见，它们分类的主要依据是细胞形状、排列方式和细胞壁表面的纹饰等形态特征。通常由4 8个细胞组合生长，有时由16 32个细胞组成的定型群体，极少为单细胞。细胞常为椭圆形或纺锤形，以长轴排成1 2列或多列。细胞壁薄、光滑，或有颗粒、细齿、隆起线和刺等特殊构造。每个细胞内有1个周生色素体和1个蛋白核。光合作用色素主要为叶绿素a、叶绿素b、叶黄素和类胡萝卜素，因此生活的栅藻呈草绿色。以似亲孢子繁殖。栅藻是淡水中常见的浮游藻类，极喜在营养丰富的水中繁殖，具有广泛的应用。栅藻细胞内含有丰富的蛋白质和维生素，是鱼类很好的饲料。栅藻藻液在饲养鱼苗中的应用已有相关专利申请公开，见中国专利申请No. 200510037547，“褐塘鳢育苗方法”。大量繁殖的藻体也可作家禽家畜的饲料。栅藻种类繁多，大部分种类对有机污染物都具有较强的耐受性。栅藻在水体自净和污水净化中也有一定作用，它可与细菌同时附着在水中有机物碎片和其他水生植物体上，形成胶质层，吸附有机物。栅藻进行光合作用时，一方面产生氧气供细菌分解有机质的需要，另一方面还可直接利用污水中的氮磷作为氮源和磷源，使水中有机物迅速降解，从而净化水体。此特点可以弥补常规污水处理工艺中对氮磷营养物质处理效果较差的不足。已有相关专利申请公开，见中国专利申请号No. 200910083796，“一株低营养栅藻及其在深度污水处理中的应用”。栅藻含油，也可用于生物柴油的制备，已有专利申请公开，详情见中国专利申请号No. 201010111834，“利用微藻深度处理污水耦合生产生物油的装置及方法”。由上可知，栅藻生存能力强，应用广泛。提高栅藻生长速率，能有效提高产量，降低成本，为工业化大生产提供有力的支持，有较高的经济意义。
发明内容
具体地，本发明提供以下各项1.栅藻属微藻突变株，其是由野生型栅藻属微藻0301A通过紫外诱变而获得的生长速度更快的突变株。2、根据以上1所述的栅藻属微藻突变株，其是产油量更高和/或虾青素产量更高的突变株。3.根据以上1所述的栅藻属微藻突变株，所述野生型栅藻属微藻0301A的部分 ITS序列如SEQ ID NO. 1所示。4.根据以上1-3中任一项所述的栅藻属微藻突变株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为=CGMCC No. 4322。5.野生型栅藻属微藻0301A，其部分ITS序列如SEQ ID NO. 1所示。6. 一种生产生物柴油的方法，包括培养根据以上1-4中任一项所述的栅藻属微藻突变株或根据以上5所述的野生型栅藻属微藻0301A的步骤。7. 一种处理污水的方法，包括在污水中培养根据以上1-4中任一项所述的栅藻属微藻突变株或根据以上5所述的野生型栅藻属微藻0301A的步骤。8. 一种生产虾青素的方法，包括培养根据以上1-4中任一项所述的栅藻属微藻突变株或根据以上5所述的野生型栅藻属微藻0301A的步骤。9.根据以上1-4中任一项所述的栅藻属微藻突变株或根据以上5所述的野生型栅藻属微藻0301A在生产鱼虾饵料和/或家禽家畜饲料中的应用。10.根据以上1-4中任一项所述的栅藻属微藻突变株或根据以上5所述的野生型栅藻属微藻0301A在固定(X)2和/或制备生物柴油中的应用。
图 1. NCBI-BLAST 结果；图2. 030IA的分子鉴定进化树；图3.紫外诱变技术方案示意图；图4. 0301A光学形态图(1为通气培养时，藻细胞生长中期形态；2为通气培养时， 藻细胞生长后期形态)；和图5.野生株030IA与突变株0301A-73生长比较结果。
具体实施例方式下文将参考实施例详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利要求具体限定。
实施例1.野生型栅藻属微藻0301A的获得和鉴定本发明人自分离获得一株栅藻0301A，椭圆形，大小为直径8-12 μ m,有细胞壁，生长速度较快，产油，产虾青素，抗逆性强。经过分子鉴定，结果为栅藻属。1.提取基因组并进行基因扩增用CTAB法提取培养4天的0301A藻基因组DNA。取一定量的细胞，研磨处理后加入适量CTAB缓冲液，勻浆，加入等体积的酚氯仿抽提，等体积异丙醇沉淀，75 %乙醇洗涤后溶于一定体积灭菌双蒸水中，紫外分光光度计检测其浓度和纯度。ITS (internal transcribed spacer)序列扩增采用真核生物ITS扩增通用引物引物 1 5，GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG 3，引物 2 5，GCATATCAATAAGCGGAGGA 3，取1μ 1总DNA为模板，。扩增条件如下:94°C变性5min，然后94°C 40s, 56°C 40s, 72°C 2min 30个循环，最后72°C IOmin0 1. 0%的琼脂糖凝胶电泳检测其扩增产物，PCR扩增获得约750bp片断。获得的0301A藻的ITS部分序列(SEQ ID No. 1)如下TCCTCCGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTAGCCTTGCCTGAGCTCAGGTCGAAAGTTTAGACA TACCATAGGTATGTTCCTGCTTGGCTCCTAGCAAGATCCACAAGCAACAACTTCGTGTAGTCGGCAGAAGCCGGTGC TACCTATCCAGTTGAAGCCCATAACGGGTCCTTGCTTAAGCCTCTGCACTTCAGCCAACCCAATCCGCAGTAAAGCA GATTGGGGAAGCCAGATCCACCCCAATGGCCAGCTAGAGAAGCCGACACACCCAACAAGTTGGGAGGGGTGAGGGTG TAAACCGACGCTGAGGCAGACATGCTCTTGCCCGAAGGCTCGAGCGCAATATGCGTTCAAAGATTCGATGGTTCACG GAATTCTGCAATTCACACTACGTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGTTGCGAGAGCCAAGATATCCGTTGTTGA GAGTTGTCTTTGGTTAAGATTGCCAGTTACTAGCAATCACAACTTCAGAGTTTAGTTTTAACAGTGGTTAGCACTGG TGTATAGTCATGCCAAGGCGCCACTGAGCAGGCAGCAATGCCCGCCCAGCTGTGAGATGCGAACGGGTTTTAAGCCG AACGCCCCACTGGCAAGCCAAGGCACGGAACGTTGAGGTTCACATTGTGGTTTTAATAATTCAATGATCCCTCCGCA GGTTCACCTACGGAGACCTTGTTACGACTTTTACTTCC比对结果显示在已公布的藻种ITS序列及5. 8S序列中，与0301A亲缘关系最近的是kenedesmus sp. isolate Pic 6/16 T-1W，其保守片段主要集中在200_650bp序列位置，见图1所示。利用NCBI数据库中的BLAST工具对藻株030IA藻的ITS部分序列进行序列相似性分析。选取和该藻株的ITS部分同源序列，利用ClustaLx软件包进行序列同源进化比对，形成一个多重序列匹配排列矩阵。然后运用Mega 4.0软件，采用邻位相连 (Neighbor-joining)算法，自展数据集bootstraps值为1000构建系统发育进化树如图2 所示。图示经 clustaL χ 禾Π Mega 4. 0 分析，0301Α(标号为 MI)与 Scenedesmussp. isolate Pic 6/16T-1W具有较近的进化距离，图中数字为bootstraps值，表示进化距离。根据形态和ITS序列BLAST结果(见图1)及构建系统发育进化树结果(见图2)， 初步鉴定0301A藻为栅藻属，并且可能为一个新种。自分离栅藻0301A生长迅速，产油，产虾青素，应用广泛。即可作为鱼虾饵料、家禽家畜饲料，也可作为生物柴油原料。考虑到工业化大生产的需要，还需要提高生长速度。实施例2.野生型栅藻属微藻0301A的紫外诱变育种和突变株的获得
在本实施例中，利用紫外诱变的方法，对自分离的栅藻0301A进行诱变育种，从而获得生长速度及含油率提高的性状优良的突变藻株，适用于工业生产生物柴油、进行污水处理及作为鱼虾饵料的生产原料。应用紫外诱变的方法对自分离栅藻0301A进行诱变育种，总体技术方案如图3所
7J\ ο具体的诱变步骤如下1)紫外诱变以自分离栅藻藻株0301A为出发藻株。将藻株从平板上接种至IOOml三角瓶中， 置于光照培养箱中(25°C，5000-7000LuX，12h L(明)/12h D(暗))培养至指数生长期后进行紫外诱变。以2个30W紫外灯管作为紫外诱变的光源，距离30cm处进行30min的照射后，关闭紫外灯，加入一定量的培养液，置于IOOml三角瓶中，于25°C黑暗条件下复苏培养12-60h，防止光修复。暗培养后的藻液转入适宜的培养条件下培养，用血球计数板记录各组存活细胞数量并计算致死率。致死率(％) = (1-处理组存活细胞数/对照组细胞数)X100%。待致死率稳定后，取一定藻液，稀释到一定浓度涂布固体培养基平板。待藻落长出后，挑取较大的单藻落于新的固体培养基平板上保存，以供筛选。2)多孔板筛选从原始保存板上挑取上述藻落分别接种到48孔板中，每孔含BG 11液体培养基 (BGl 1培养基配方在下文中描述)700 μ 1，每块板接种一株出发藻株作为对照。将48孔板置于人工气候箱中培养，正常培养条件下(即，温度25°C、湿度50-60%、光照5000-7000lux、 光周期12hL/ia!D)培养约4-5天至藻液明显变为绿色，测量OD75tl值，按终浓度OD75tl = 0. 03 计算各突变藻株需要的接种量，按不同接种量调整各突变株至相同OD75tl，接种到新的各孔含700μ 1 BGll液体培养基的48孔板中，正常条件下培养后测量0叫5(|值，与出发藻株比较， 选择较出发藻株OD75tl更高的突变株进行第二轮筛选。将挑选出的藻落接种于M孔板中培养板中，每孔含BGll液体培养基1. 5ml。在人工气候箱中于正常培养条件下培养至指数生长期，测量OD75tl值，按终浓度OD75tl = 0. 03计算各突变藻株需要的接种量，按不同接种量调整各突变株至相同OD75tl，接种到新的各孔含1.5ml BGll液体培养基的M孔板中，正常条件下培养9-11天后测量OD75tl值，与出发藻株比较，选择较出发藻株OD75tl更高的突变株准备进行三角瓶筛选。3)三角瓶筛选将多孔板筛选出的藻株进行三角瓶中培养筛选。在人工气候箱中于正常培养条件下利用M孔板进行藻株扩培，待培养至指数生长期后，测量OD75tl值，按终浓度OD75tl = 0. 03 计算各突变藻株需要的接种量，按不同接种量调整各突变株至相同OD75tl,接种到50ml三角瓶中，每瓶含BGl 1培养基15ml。正常条件下，每天摇动三角瓶一次并调整位置，培养7_8天后测量OD75tl值，选择较大OD值的藻株按4%接种量接种到500ml三角瓶中，设立两个平行样，每瓶含培养基100ml，培养13-15天后测定OD75tl值，最终确立生长迅速的藻株。4)利用评价体系对突变株进行评价。5)利用板式反应器对性状优良的突变株进行性能验证。通过上述筛选方法，发明人成功获得了一株栅藻属微藻突变株，命名为0301A-73， 其是由野生型栅藻属微藻030IA通过紫外诱变而获得的生长速度更快、产油量更高和/或
6虾青素产量更高的突变株。根据布达佩斯条约，已经将所述突变藻株0301A-73于2010年 11月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国北京朝阳区大屯路，中科院微生物研究所，100101)，保藏号为CGMCC No. 4322。实施例3.野生型栅藻030IA和突变藻株0301A-73的比较1.形态特征比较分离获得的0301A栅藻，椭圆形，大小为直径8-12 μ m,有一蛋白核，有细胞壁，生长速度较快，产油，产虾青素，抗逆性强。生长期藻细胞为绿色，到平台期后细胞变黄，养殖时间过久的情况下，细胞能变为红色。静止培养状态下，细胞偏圆形，通气状态下，细胞为明显的椭圆形。此藻株在BGll培养基中能得到较好的生长。如图4所示。筛选获得的性能优良的突变株0301A-73形态特征与出发藻株相比，没有明显的差异。2.虾青素含量比较将野生株030IA及突变株0301A-73在4cm光径的管式反应器中，24小时连续光照培养16d(天)后离心收集藻细胞，测定细胞中虾青素的含量。培养过程中光照强度控制在50-250 μ mol/m2. s，利用通气使藻株在培养基中混勻均勻，温度调控在25_35°C范围内， 在培养期内，通过向培养液中通入CO2，将培养基的pH值调节在7-8之间。从培养的第 9天起，加大光照强度，双面照光，使光照强度在250-400 μ mol/m2. s，在这一阶段内，藻细胞开始油脂积累及虾青素。虾青素提取a)取充分干燥的藻粉，混勻。准确称取50mg藻粉到IOmL离心管中，加入ImL的去离子水，充分涡旋振荡混合，避免产生絮凝。b)加入IOmL丙酮，在40_50°C下超声5分钟。c) 3000rpm离心5分钟，将上液转移到50mL棕色容量瓶中。d)重复b、c两步，一定要确保上层液无色(约3-4次)。e)得到的上层液在室温下最少放置15分钟，用丙酮混合定容，待后续分析使用。f)移取ImL步骤e所得溶液到IOmL玻璃离心管中，加入1. OmL的内标储备溶液 (配制方法准确称量2mg的胡萝卜素醛(Fluka cat# :10829, HPLC分析用内标品，放在 50mL的容量瓶中，溶液浓度为40ug/mL，用丙酮溶解，混合定容)，混勻。g)将干式恒温器温度设定在37°C，加入3mL的胆固醇酯酶溶液(胆固醇酯酶 wako Pure Chem, cat #037-11221。溶液配制方法将准确称量的胆固醇酯酶溶解在50mM Tris-HCKpH 7.0)，保证溶液的活力单位为如nit/mL)到试管中，轻轻混合静置。h)在37°C下反应45分钟，反应过程中每隔10分钟轻轻倒置两次。i)加入Ig的十水硫酸钠和2mL的石油醚，涡旋振荡30秒，在3000rpm下离心3分钟。j)移取石油醚层到含有Ig的无水硫酸钠的IOmL玻璃离心管中。k)室温下用氮气吹干石油醚，加入3mL的丙酮，超声溶解，过滤(分析测试样)。虾青素检测照上面方法进行提取后，使用Agilent 1200液相色谱仪进行液相色谱分析(检测器UV/VIS，474nm ；色谱柱YMC_CarotenoidTM S5um，250X4. 6mm ；柱温25°C ；流速lmL/min ；分析方法内标法)，流动相甲醇、甲基叔丁醚、磷酸水溶液混合液。其虾青素含量如下表1 :表1虾青素检测结果
权利要求
1.栅藻属微藻突变株，其是由野生型栅藻属微藻0301A通过紫外诱变而获得的生长速度更快的突变株。
2.根据权利要求1所述的栅藻属微藻突变株，其是产油量更高和/或虾青素产量更高的突变株。
3.根据权利要求1所述的栅藻属微藻突变株，所述野生型栅藻属微藻0301A的部分 ITS序列如SEQ ID NO. 1所示。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的栅藻属微藻突变株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为=CGMCC No. 4322。
5.野生型栅藻属微藻0301A，其部分ITS序列如SEQID NO. 1所示。
6.一种生产生物柴油的方法，包括培养根据权利要求1-4中任一项所述的栅藻属微藻突变株或根据权利要求5所述的野生型栅藻属微藻0301A的步骤。
7.—种处理污水的方法，包括在污水中培养根据权利要求1-4中任一项所述的栅藻属微藻突变株或根据权利要求5所述的野生型栅藻属微藻0301A的步骤。
8.—种生产虾青素的方法，包括培养根据权利要求1-4中任一项所述的栅藻属微藻突变株或根据权利要求5所述的野生型栅藻属微藻0301A的步骤。
9.根据权利要求1-4中任一项所述的栅藻属微藻突变株或根据权利要求5所述的野生型栅藻属微藻0301A在生产鱼虾饵料和/或家禽家畜饲料中的应用。
10.根据权利要求1-4中任一项所述的栅藻属微藻突变株或根据权利要求5所述的野生型栅藻属微藻0301A在固定(X)2和/或制备生物柴油中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种栅藻属微藻突变株，其是由野生型栅藻属微藻0301A通过紫外诱变而获得的生长速度更快、产油量更高和/或虾青素产量更高的突变株。本发明还涉及野生型栅藻属微藻0301A及其突变株在生产生物柴油、处理污水、生产虾青素、生产鱼虾饵料或家禽家畜饲料和固定CO2中的应用。
文档编号C12P23/00GK102485889SQ20101057781
公开日2012年6月6日 申请日期2010年12月3日 优先权日2010年12月3日
发明者吴义诚, 吴洪, 王媛媛, 王慧岭, 邓平, 马卫敬 申请人:新奥科技发展有限公司