专利名称：一种hsv扩增子为载体的抗病毒制剂的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及ー种新型的以HSV扩增子为载体的抗病毒制剂及其应用。
背景技术：
单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus, HSV)是人类广泛传播且导致不同严重程度感染性疾病的病毒，流行病学调查显示，正常人群的感染率高达60%-95% i。单纯疱疹病毒可分为I型(HSV-I)和II型(HSV-幻两个血清型。HSV-I的感染率随年龄增长逐渐增加，成年可达到70-80%。德国和西班牙的调查显示14-17岁感染率为40-50%，50岁时达到90% n0 HSV-2感染主要引起生殖器疱疹，美国88-94年间ー项流行病学调查显示12岁以上HSV-2血清阳性率为21. 7%。普通人群中HSV-2的感染率为10% -60% m。单纯疱疹病毒HSV-I和HSV-2的基本特点是对人体初次感染后，可在体内维持很长时间，甚至终生感染。人类是单纯疱疹病毒HSV-I和HSV-2传播的唯一宿主，其传播途径主要通过皮肤粘膜的直接接触和体液接触，包括疱疹液，眼泪，鼻涕，唾液，精液和生殖道分泌物等。单纯疱疹病毒对人体上皮组织有很强的嗜性，经皮肤和粘膜感染后，可经神经， 血液或直接扩散的形式传播至人体不同的组织細胞，交感神经节，外周神经，腮腺，鼻粘膜， 胸膜，腔静脉，骨，软骨，肛门，膀胱，脊神经节，脊椎，舌，气管，肺，胸腺，主动脉，平滑肌，纵隔淋巴结，骨髄，血液，食管，胃，大肠，胰腺，肾脏等。可以导致体内上述器官的不同的感染性疾病，如疱疹性脑炎，角膜炎，视网膜炎，面部口唇疱疹，鼻炎，鼻窦炎，气管炎，肺炎，盆腔炎，前列腺炎，膀胱尿道炎，附睾精囊腺炎等iv。单纯疱疹病毒感染绝大多数为无症状的潜伏感染，但少数人呈现不同程度的感染症状，从轻度的皮肤粘膜疱疹到致死性脑炎。HSV-I和HSV-2是ー类广泛存在的病毒，它们在人体内终生显性感染-潜伏感染-的周期v’vi。生殖器疱疹是由单纯疱疹病毒感染泌尿生殖器及肛门部位皮肤粘膜而引起的一种复发性疾病，是ー种较常见性传播疾病。生殖器疱疹可呈慢性复发过程，尚无彻底治愈的方法。生殖器疱疹的发生和复发可给患者带来很大的身心痛苦，影响其生活质量和人际交往，并可能引起播散性感染、病毒性脑膜炎、脊髄脊神经根病、盆腔炎综合征等一系列并发症。孕妇生殖器疱疹还影响优生优育，可引起子宮内HSV感染和新生儿HSV感染，导致流产、 早产、死产、新生彡L死亡或发生严重后遗症。疱疹病毒在神经系统造成感染-潜伏-再激活周期性感染，以逃避机体免疫系统的攻击，引起典型的神经系统疾病，其中包括脑炎，脑神经功能障碍，脉络丛视网膜炎，脊髄炎，多发神经节炎。导致中枢神经系统感染的途径通常可经血液传播，也可经外周神经传播致中枢，并经神经纤维在中枢内传播。HSV-I是引起疱疹性脑炎的主要病原体，95%的疱疹性脑炎是由HSV-I引起，也是致死性脑炎的最常见的病原体。自发性疱疹病毒菱脑炎常涉及到三叉神经，自发性中脑炎常涉及到第8对脑神经，位听神经。HSV-I是新生儿疱疹脑炎的主要病原体，常引起严重的后遗症，如小头，小脑和多囊性脑软化症。
HSV-I和HSV-2均能感染血管内皮细胞和血管平滑肌细胞，造成血管内皮细胞和血管平滑肌细胞胆固醇代谢障碍和局部炎症，从而导致动脉粥样硬化和血栓形成等心脑血管疾病。HSV-2感染是原发性高血压的独立危险因素vii。此外，HSV感染还可导致老年痴呆。研究显示HSV-1常出现在Alzheimer’ s病脑内病灶的周围，提示可能与发病有关，但在正常人脑内中亦有发现，提示它可能不是独立危险因素。在携带ΑΡ0)Ε-ε4等位基因的人群中，携带有HSV-I有较高的Alzheimer’ s病的发病率。提示二者存在协同关系吣^。一般认为，HSV感染是终身不能治愈的，目前常用的抗病毒药物主要是阿昔洛韦类药物(包括阿昔洛韦，喷昔洛韦，泛希洛韦，更昔洛韦)，这些药物只能暂时性抑制病毒，而不能彻底清除x。对一些病人，特别是一些抗此类药物的病人甚至无明显疗效xi。因此，需要研发新的抗病毒制剂，包括小分子化合物药物和生物大分子制剂χ"。造成病毒终身不能治愈的原因除了病毒在神经节内潜伏的特性和具有免疫逃逸功能以外，还有体内各种血器官屏障的阻碍作用。对于诸如血脑屏障，眼屏障，前列腺屏障，血睾丸屏障来说，即使小分子药物也很难到达这些部位。生物大分子药物如核酸类药物，抗体和细胞因子等不仅不能进入这些屏障，也不能进入细胞膜，从而不能达到抗病毒的效果。由于单纯疱疹病毒传播是世界性问题，因此，人们一直不断地在进行疫苗、核酸药物和生物分子药物的研发xm’xiv’xv。虽然人们在单纯疱疹病毒的预防性和治疗性疫苗的研发方面进行了大量的研究，并取的一定得进展，然而，到目前为止，尚无有效的疫苗进入临床应用。与此同时，人们也致力于基因治疗和核酸药物的研发，尤其近年来利用获得诺贝尔奖的RNA干扰技术进行的抗HSV病毒研究在体内外均取得了很大的进展，但存在的最大障碍是载体问题。利用脂质体和其它纳米载体体外细胞或体内粘膜表面释放SiRNA和内源表达shRNA，均可达到有效的抗病毒效果。然而，由于缺乏有效的体内载体，siRNA仅限于粘膜表层的抗病毒作用，使RNA干扰抗病毒机制很难进入实际的应用。因此，要实现siRNA和其它生物大分子药物抗HSV病毒的实际应用，最关键的是发展有效的载体，使siRNA和其它生物大分子抗HSV病毒药物高效地进入表达隐藏的任何组织细胞。在目前所有报道的病毒类和非病毒类载体中，非病毒类载体由于其体内转基因效率太低尚不能进入实际应用，病毒载体虽具有高效的转基因效果，但存在安全性的担忧。目前为止，尚没有利用HSV扩增子本身或者利用HSV扩增子携带大分子或者siRNA达到抗HSV目的的报道。在利用HSV载体抗HSV病毒本身的报道中，早在1999年已有人提出用重组的HSV 病毒重组子进行表达trans-dominant negative HSV-I UL9 (HSV复制结合蛋白)抗野生病毒本身，该技术由于其自身原因，使其重组病毒与其所抗的野生病毒可发生重组，这一安全性问题的存在使其没有后续的报道研究xvi。传统的HSV-I扩增子是瞬时表达，短暂的，HSV扩增子假病毒的制备早在1982年就有报道xvii，其原理是利用HSV-I病毒的oriS和pac序列连接至细菌质粒，在复制缺陷的HSV-I病毒的辅助下可制备出HSV-I扩增子假病毒，为了排除辅助病毒的污染，人们采用 cre-loxp技术删除辅助病毒的pac序列，从而进行大规模的制备，但仍存在0. 5-5%的辅助病毒污染xvm。近年来，人们进一步采用无辅助病毒污染的生产扩增子假病毒的技术，即超大型HSV-I或敲掉pac序列的HSV-I作为辅助病毒xix，该技术可生产无辅助病毒污染的扩增子假病毒，但其缺点是生产效率低不能用于扩增子大规模的制备。CN 102533823 A
发明内容
本发明的目的在于提供ー种新型的抗病毒制剂及其应用。在本发明的第一方面，提供ー种扩增子载体，其包括以下操作性相连的元件单纯疱疹病毒-1的复制元件oriS，包装信号pac。在一个优选例中，从5’ -3’端依次包括包装信号pac，复制元件oriS， colborigin。在另ー优选例中，所述的origin是colE origin。在另ー优选例中，所述的扩增子载体还包括选自以下的元件colE origin，抗性基因(如Amplicilin)，或报告基因。在另ー优选例中，所述的报告基因选自(但不限干)LaCZ、dSRed、GFP、EGFP或荧光素酶的编码基因。在另ー优选例中，所述的复制元件oriS的序列如SEQ ID NO=I所示；或所述的复制元件oriS序列如下获得MluI酶切BAC-HSV-1HF获得含末端重复区的BAC-TR，接着NotI 酶切BAC-TR获得含oriS及其侧翼序列的片段(约3. 5Kb)，AgeI酶切前述片段后获得含 oriS核心区及其侧翼序列的片段(约1. 7Kb)，作为复制元件oriS的序列；所述的包装信号pac的序列如SEQ ID NO 2所示；或所述的包装信号pac如下获得MluI酶酶切BAC-HSV-1HF，获得含末端重复区的BAC-TR，SacI酶切BAC-TR获得含HSV-I 末端重复区“pac”序列的片段(约4Kb) ；HphI酶切前一片段获得含末端重复区“pac”序列的片段(约1. 3Kb) ；BsrBI酶切前一片段后获得W3-DRl-Uc结构，作为包装信号pac的序列；在另ー优选例中，所述的扩增子载体以细菌质粒作为骨架载体；较佳地如 psi2. 0-U6。在本发明的另一方面，提供所述的扩增子载体的用途，用于制备防治单纯疱疹病毒感染的組合物。在一个优选例中，所述的扩增子载体通过竞争性地抑制病毒本身来防治单纯疱疹病毒感染。在本发明的另一方面，提供ー种抑制单纯疱疹病毒的构建物，其包括以下操作性相连的元件单纯疱疹病毒-1的复制元件oriS，包装信号pac，和抑制单纯疱疹病毒的元件。在一个优选例中，所述的抑制单纯疱疹病毒的元件选自(但不限干)干扰分子 (下调单纯疱疹病毒中关键基因表达的分子)，LAT基因，免疫因子。在另ー优选例中，所述的干扰分子是特异性抑制单纯疱疹病毒的基因(如立早基因ICP27)表达的siRNA或shRNA。在另ー优选例中，所述的干扰分子的序列如SEQ ID NO :3_5所示；较佳地，所述的干扰分子的序列如SEQ ID N0:4所示。在另ー优选例中，所述的干扰分子位于复制元件oriS与origin之间。在本发明的另一方面，提供所述的构建物的用途，用于制备防治单纯疱疹病毒感染的组合物。
在另一优选例中，所述的单纯疱疹病毒感染导致选自以下的疾病疱疹性脑炎， 角膜炎，视网膜炎，面部口唇疱疹，鼻炎，鼻窦炎，气管炎，肺炎，盆腔炎，前列腺炎，生殖器疱疹，膀胱尿道炎，附睾精囊腺炎，脑炎，脑神经功能障碍，脉络丛视网膜炎，脊髓炎，多发神经节炎，动脉粥样硬化，血栓，高血压，阿尔茨海默病。在本发明的另一方面，提供一种复制元件oriS的序列，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示；或其核苷酸序列如下获得MluI酶切BAC-HSV-1HF获得含末端重复区的BAC-TR，接着NotI酶切BAC-TR获得含oriS及其侧翼序列的片段(约3. 5Kb)，AgeI酶切前述片段后获得含oriS核心区及其侧翼序列的片段(约1. 7Kb)，作为复制元件oriS的序列在一个优选例中，所述的oriS序列的核心区序列包括oriS的核心区结构boxl， boxll,boxIIL·在本发明的另一方面，提供一种包装信号pac，其核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示；或其核苷酸序列如下获得MluI酶酶切BAC-HSV-1HF，获得含末端重复区的BAC-TR， SacI酶切BAC-TR获得含HSV-I末端重复区“pac”序列的片段(约4Kb) ；HphI酶切前一片段获得含末端重复区“pac”序列的片段(约1. 3Kb) ；BsrBI酶切前一片段后获得W3-DRl-Uc 结构，作为包装信号pac的序列。在另一优选例中，所述的BAC-HSV-1HF如下构建以HSV-I HF株的基因组为模板， 以 5，-CGTTACGCGTGTTACTTTCGCGAC-3，(SEQ ID NO 12)和 5，-ACCGAGCTCCGTCCCCGGGGTCCT TC-3’(SEQ ID NO 13)为引物扩增与HSV-I的UL43基因同源的左同源臂序列，引物两端分别设计的有 SacI 和 MluI 的酶切接头。以 5，-GACGCGGCCGCGGTAGTCGTCCTCCTCGTA-3，(SEQ IDNO 14)和 5，-CGGGAGCTAAACCACATTCGCGAGCACC-3，(SEQ ID NO 15)为引物扩增与 HSV-1 的UL47基因序列同源的右同源臂，引物两端分别设计有NotI和MluI的酶切接头，酶切连接法将同源臂克隆至BAC质粒的SacI，NotI酶切位点中，用MluI酶将含HSV-I同源臂的 BAC切成线性，将线性BAC-HSV-I同源臂与HSV-I基因组转染至真核细胞(如Vero细胞)， 经细胞内同源重组产生含报告基因的BAC-HSV-I重组病毒，收集含重组型BAC-HSV-I的细胞上清液，噬斑纯化挑取阳性CPE，将收获的病毒再次感染真核细胞，待病毒自身环化时提取病毒环形基因组，从而获得BAC-HSV-I HF。在本发明的另一方面，提供一种组合物，其含有有效量的所述的扩增子载体或所述的构建物；以及药学上可接受的载体。在一个优选例中，所述的组合物用于防治单纯疱疹病毒感染。在本发明的另一方面，提供一种(优选体外非治疗性地)抑制单纯疱疹病毒的方法，包括给予对象(如试样、细胞等)有效量的所述的构建物。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图1、质粒型载体C223 =BAC-GFP结构示意图。图 2、BAC-HSV-I HF 构建模式图。图3、pac，oriS的获得示意图。图4、1 携帯dsred报告基因的扩增子载体；2 携帯siRNA表达盒的扩增子载体。图5、子代病毒感染Vero細胞。图6、经hphl酶切获得1. 3Kb首尾相连的双“a”序列的片段。图7、(I)Amplicon A的红色荧光表达情况；OMmplicon B的红色荧光表达情況。图8、Ub-DRl-Uc的结构图谱。图9、首尾相连的a序列的获得示意图，以及BAC-HSV-IHFl88bp的Ub-DRl-Uc结构示意图。图10、不同病毒株对HSV扩增子的复制包装效果。其中，HF :HSV1_HF株，F =HSVl-F 株 333，HSV2-333 株。图11、siRNA抗病毒效果(采用的是SEQ ID NO 4的干扰序列)。图12、1 病毒第1代感染结果；2 病毒第2代感染结果；3 病毒第3代感染結果。图13、1-3分别为病毒1-3代实验组的CPE情況，4_6分别为1_3代病毒对照组的 CPE情况。图14、相比于对照组HSV1，实验组(Amplicon HSV1)野生病毒滴度明显下降。
具体实施例方式本发明人经过广泛的研究，首次成功地构建了ー种扩增子载体，其可竞争性地抑制病毒本身；还成功地利用扩增子载体表达抑制单纯疱疹病毒的基因(如siRNA)，其可抑制HSV病毒本身。由于所述的扩增子载体是依赖靶病毒复制的，因此可以追踪靶病毒到达靶病毒所潜伏藏匿的任何細胞并达到持久的抗病毒效果。如本文所用，所述的“可操作(性)地连接”、“操作性相连”或“操作性连接”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。如本文所用，所述的“小干扰RNA (small interfering RNA，siRNA) ”是指ー种短片段双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，这个过程就是 RNA 干扰(RNA interference)过程。如本文所用，术语“小发夹RNA(Small hairpin RNA，shRNA) ”是指能够形成发夹结构的非编码小RNA分子，小发夹RNA能够通过RNA干扰途径来抑制基因的表达。如本文所用，术语“扩增子(Amplicon) ”是能进行大量复制而使拷贝数不断增多的 DNA或RNA序列，这种被大量复制的DNA或RNA序列通过重组质粒转化菌扩增产生。本发明的技术方案主要是构建对不同血清型HSV病毒和不同基因型HSV病毒均有效的扩增子载体，利用靶病毒(如体内感染的HSV病毒)为辅助病毒进行复制和追踪，从而使扩增子载体到达病毒藏匿的任何部位。利用HSV病毒扩增子载体携带抗HSV病毒本身的生物大分子抑制病毒的复制和复发，从而达到高效持久的抗病毒目的。扩增子载体
本发明提供一种扩增子载体，其包括以下操作性相连的元件单纯疱疹病毒-1的复制元件oriS，包装信号pac。较佳地，从5’_3’端依次包括包装信号pac，复制元件oriS， colE origin。所述的扩增子载体以细菌质粒作为骨架载体，克隆入HSV-I的复制元件oriS和包装信号pac，该扩增子载体可在动物细胞内依赖靶病毒进行复制。考虑到核心区以外的序列多会影响其高效性，本发明人对复制元件进行了优化， 获得了含SEQ ID NO :1所示序列的含有oriS序列的片段。所述的包装信号pac的序列为BAC-HSV-I的TR区内两个a序列首尾相连而成，符合其在天然状态下的组合形式。作为本发明的优选方式，所述的包装信号Pac如下获得 MluI酶酶切BAC-HSV-1HF，获得含末端重复区的BAC-TR，SacI酶切BAC-TR获得含HSV-I 末端重复区“pac”序列的片段；HphI酶切前一片段获得含末端重复区“pac”序列的片段； BsrBI酶切前一片段后获得W3-DRl-Uc结构，作为包装信号pac的序列。除了以上元件，所述的扩增子载体中还可包括其它元件，例如选自复制起点、启动子、增强子、标记基因或翻译控制元件等。这些元件的选择是本领域技术人员所清楚的。作为本发明的优选方式，所述的扩增子载体中还包括选自以下的元件 colEorigin或报告基因。所述的报告基因选自(但不限于)LacZ、dsRed、GFP、EGFP或荧光素酶。本发明还提供了所述的扩增子载体的用途，用于制备防治单纯疱疹病毒感染的组合物。所述的组合物可用于治疗任何单纯疱疹病毒感染相关的疾病，所述的疾病包括(但不限于)疱疹性脑炎，角膜炎，视网膜炎，面部口唇疱疹，鼻炎，鼻窦炎，气管炎，肺炎，盆腔炎，前列腺炎，生殖器疱疹，膀胱尿道炎，附睾精囊腺炎，脑炎，脑神经功能障碍，脉络丛视网膜炎，脊髓炎，多发神经节炎，动脉粥样硬化，血栓，高血压，阿尔茨海默病等。经证实，HSV-I扩增子在HSV不同血清型(HSV-1和HSV-幻间的复制和包装效果相同，说明两种不同血清型病毒的oriS和pac包装序列是通用的，为实现临床抗各型、株HSV 感染提供依据。经证实，本发明所述的扩增子载体竞争性地抑制HSV-I病毒，可高效地竞争性抑制病毒复制。因为扩增子不能自行复制，因而可以抑制病毒的再复发机会。竞争抑制抗病毒不能完全阻断病毒的复制，使病毒的复制量进入递减的模式，可实现预防病毒性感染复发的目的。本发明通过构建BAC-HSV-1HF，使得TRL端和TRS端的两个a序列首尾相连， 组成完整的W3-DRl-Uc结构。研究证明W3-DRl-Uc为最小的包装信号功能域，本实验在 BAC-HSV-1HF的基础上，通过酶切获得完整的该结构，本发明构建的扩增子的a序列为首尾相连的两个a序列，包含上述天然的切割包装信号单元证-DRl-Uc，包装能力较强，本发明证实经野生病毒辅助包装后，与野生病毒共感染Vero细胞后，经多次传代扩增后，扩增子与野生病毒数量比例逐渐增大，说明其具有较好的扩增能力，一定程度上反映了其包装能力的稳定和高效。构建物本发明还提供了一种抑制单纯疱疹病毒的构建物，其包括以下操作性相连的元件单纯疱疹病毒-1的复制元件oriS，包装信号pac和抑制单纯疱疹病毒的元件。也即，在所述的扩增子载体中插入抑制单纯疱疹病毒的元件，获得所述的构建物。任何可抑制单纯疱疹病毒的复制或对单纯疱疹病毒有毒性的分子均可作为抑制单纯疱疹病毒的元件。例如所述的抑制单纯疱疹病毒的元件选自但不限于干扰分子(下调单纯疱疹病毒中关键基因表达的分子)，LAT基因，免疫因子。作为本发明的ー种优选实施方式，所述的干扰分子是特异性抑制单纯疱疹病毒的基因表达的小干扰 RNA(small interfering RNA, siRNA)、发夹 RNA(shRNA)或 microRNA。 小干扰RNA可以制备成双链核酸的形式，它含有ー个正义链和ー个反义链，这两条链仅在杂交的条件下形成双链。一个双链RNA复合物可以由相互分离的正义链和反义链来制备。 因此，举例来讲，互补的正义链和反义链是化学合成的，其后可通过退火杂交，产生合成的双链RNA复合物。本发明对小干扰RNA的制备方法没有特別的限制，包括但不限于化学合成法，体外转录法等。此外，小干扰RNA包含的正义链和反义链可通过ー个或多个编码正义链和反义链的表达盒来制备。当正义链和反义链由一个单独的表达盒编码时，它们可以从生成的转录物中断裂形成分离的正义链和反义链，其后杂交生成双链小干扰RNA。ー些对于单纯疱疹病毒的复制或存活关键的基因都可作为设计siRNA或shRNA或 microRNA的对象，例如立早基因ICP27，晚期基因US6基因，UL29基因和UU8基因。本发明还提供了所述的构建物的用途，用于制备防治单纯疱疹病毒感染的組合物。在本发明的优选实施方式中，证实了所述的扩增子载体在携带靶向HSV-I立早基因ICP27的siRNA后可实现有效的抗病毒效果。同样可以使病毒的复制量进入递减的模式， 可实现预防病毒复发的目的。利用HSV-I扩增子在HSV-I和HSV-2不同血清型间的复制和包装效果相同的特点，利用HSV-2型病毒辅助包装携帯对抗HSV-I的siRNA的扩增子载体，可避免siRNA对同型病毒的抑制而导致的包装效率下降。为了达到高效的释放效率和避免病毒基因的安全问题，本发明人利用不含病毒基因的Amplicon扩增子假病毒作为载体内源表达siRNA。目前，尚无人利用HSV-I扩增子竞争性地抑制病毒或利用HSV-I扩增子表达siRNA抗HSV病毒本身。HF 株的 BAC-HSV-I 株构建本发明首次成功构建HF株的BAC-HSV-I。HSV-1其庞大而复杂的基因组使其在真核細胞内的基因操作如定点基因的突变及某些基因的靶向敲除变的十分困难，从而不利于 HSV-I各基因功能的研究。本发明人构建的HF的BAC-HSV-I使其全基因组以BAC质粒的形式在大肠杆菌中进行保存、増殖和遗传修饰成为可能。制剂本发明还提供了一种组合物，它含有有效量(如MOI = 0. 01-10，较佳的MOI = 1) 的有效量的所述的扩增子载体或构建物；以及药学上可接受的载体。所述的组合物可用于防治单纯疱疹病毒感染。如本文所用，所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和 /或动物所接受的量。所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样ー些药剂载体它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在組合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充齐U、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、PH缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞转染试齐LU本发明所述的扩增子载体或构建物的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定 (例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。本发明的主要优点在于首次揭示了一种依赖靶病毒复制的HSV扩增子制剂，并利用该扩增子制剂竞争性抑制疱疹病毒以及利用该扩增子表达siRNA或microRNA抗HSV病毒本身。由于该扩增子制剂是依赖靶病毒复制的，因此可以追踪所抗的靶病毒到达靶病毒潜伏藏匿的任何细胞并达到持久的抗病毒效果。首次克隆和鉴定出单纯疱疹病毒HSV-I HF株的oriS序列。单纯疱疹病毒包含两个oriS序列，分别位于TRL区和TRS区，本发明所用的病毒株为HSV-1HF，目前，国际上尚没有文献报道该病毒株的oriS序列，本发明人首次测出HSV-I HF的oriS序列，经分析该 oriS含有oriS核心区域boxl，boxll, boxIII，并经试验证实其具有复制功能。病毒DNA以滚环的形式进行复制，滚环复制的DNA长链，以152Kb为单位进行切割包装，切割包装的位点位于两个a序列之间形成的Pac包装序列(Uc-DRl-Ub结构)，DRl是位于相邻的两个a序列间的同向重复序列，约17-20bp山b-DRl-Uc为最小的包装信号功能结构(即pac包装序列)。要获得包装信号pac必需在2个或2个以上串联的a序列结构中进行克隆，因为在TRS区存在一个拷贝a序列，在顶及TRL区存在一个或多个拷贝，所以只能从可能存在2个或2个以上a序列的顶区及TRL区进行克隆。然而如果病毒株在顶区及TRL区只存在一个a序列，则不能获得pac包装序列。因此传统的从顶区获取pac序列的方法具有不确定性。本发明通过构建BAC-HSV-I HF，首次从TRL端和TRS端的两个首尾相连a序列的区域内获得pac序列。采用BAC克隆技术，可从任何血清型、基因型的HSV 病毒株中稳定的获得pac序列。本发明首次证实单纯疱疹病毒利用扩增子竞争性抑制HSV-I病毒，可达到高效地竞争性抑制病毒复制。因为扩增子不能自行复制，因而可以抑制病毒的再复发机会，其竞争性抑制病毒复制虽不能完全阻断病毒的复制，但可使病毒的复制量进入递减的模式，从而可实现预防病毒复发的目的。本发明证实了 HSV-I扩增子载体在HSV-I和HSV-2不同血清型间和同一血清型不同基因型之间可以进行包装和复制，说明HSV-I型扩增子可以竞争性抑制HSV-2型病毒扩增，从而达到利用HSV-I型扩增子竞争性抑制HSV-2型病毒复制的目的。本发明证实了扩增子载体携带靶向HSV-I立早基因ICP27的siRNA后可实现有效的抗病毒效果。同样可以使病毒的复制量进入递减的模式，可实现预防病毒复发的目的。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook 等人，分子克隆实验室指南(New York Co Id Spring Harbor LaboratoryPress, 2002)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和
份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。材料BAC质粒(为大肠杆菌的F因子，具体为C223质粒，获自美国华盛顿大学，分子病毒系Dr. Yu实验室，图谱见图1)，HSV-I HF病毒株获自郑州大学一附院。克隆工具酶均购自大连宝生物公司，pDsred2-CUp-cmv-β -gal质粒购于Clontech公司，β -半乳糖苷酶原位染色检测试剂盒购自碧云天公司，Lipofectamine 2000购自hvitrogen公司，DNA测序由北京三博远志公司完成，无支原体胎牛血清购于杭州四季青生物工程材料有限公司。质粒提取，胶回收，PCR清洗过柱试剂盒均购于Axygen公司。实施例1、BAC-HSV-I HF株的构建以HSV-I HF株的基因组为模板，以5，-CGTTACGCGTGTTACTTTCGCGAC-3，(SEQ ID NO 12)；禾ロ5，-ACCGAGCTCCGTCCCCGGGGTCCTTC-3，(SEQ ID NO 13)；扩增与HSV-I的UL43基因同源的左同源臂序列，引物两端分别设计的有SacI和 MluI的酶切接头。以引物5，-GACGCGGCCGCGGTAGTCGTCCTCCTCGTA-3，(SEQ ID NO 14)；禾ロ5，-CGGGAGCTAAACCACATTCGCGAGCACC-3，(SEQ ID NO 15)；如图2，扩增与HSV-I的UL47基因序列同源的右同源臂，引物两端分别设计有 NotI和MluI的酶切接头，酶切连接法将同源臂克隆至BAC质粒的&iCI，NotI酶切位点中， 用MluI酶将含HSV-I同源臂的BAC切成线性，将线性BAC-HSV-I同源臂与HSV-I基因组用脂质体包理法转染至Vero細胞(购于中国科学院上海細胞生物学研究所)，经真核細胞内同源重组产生含GFP绿色荧光报告基因的BAC-HSV-I重组病毒，收集含重组型BAC-HSV-I 的Vero細胞上清液，噬斑纯化挑取含GFP的阳性CPE，将收获的含GFP的病毒再次感染Vero 細胞，待病毒自身环化时用Hirt法提取病毒环形基因组，即完成BAC-HSV-I HF的构建。结果成功构建了感染性的BAC-HSV-I HFjfBAC-HSV-I HF环形质粒转染Vero细胞后可包装出携帯绿色荧光的重组BAC-HSV子代病毒。子代病毒可成功感染Vero細胞，如图5。实施例2、HSV-I扩增子载体的构建初始载体构建psi2.0_U6(购自Ambion公司，自带Ampicillion (抗性基因)为基础，通过 HindIII和EcoRI切除400bp的片段，合成下列多克隆位点(由上海宝赛生物有限公司合成，含有 Bglll，AgeI, SpeI, Sail, HindIII 和 EcoRI 位点)MCSup 5 ’ -AGCTGGGCCCGGAGATCTTAATTAACCGGTACTAGTCGACAAAAGCTTAAGAATTCAACTCGAG-3 ，(SEQ ID NO 16)；
MCSDOffN 5 ’ -GGGCCCGGAGATCTTAATTAACCGGTACTAGTCGACAAAAGCTTAAGAATTCAACTCGAGAATT-3 ，(SEQ ID NO 17)；将合成的MCSup和MCSdown退火后形成的两端带有EcoRI和HindIII酶切接头的片段通过EcoRI和HindIII酶切加入psi2. 0-U6从而形成psi2. Ο-mcs,以AseI和MluI酶切Clontech公司的pDsred2_Cl，获得dsred红色荧光蛋白的编码序列；以EcoRI/Hindlll 酶切Clontech公司pcmv- β载体，获得LacZ报告基因序列，并通过分子克隆的方式分别克隆至 psi2. Ο-mcs 载体的 XhoI 或 EcoRI/Hindlll 位点内，分别获得 psi2. O-mcs-dsred 和 psi2.0—mcs-LacZopac，oriS的获得示意图如图3。“pac”序列的获得MluI酶酶切BAC-HSV-1HF，获得含末端重复区的BAC-TR，SacI酶切BAC-TR获得 4Kb的含HSV-I末端重复区“pac”序列的片段；HphI酶切4Kb的片段后获得1. 3Kb的含末端重复区“pac”序列的片段(图6)。另经BsrBI酶切1. 3Kb的片段后可获得188bp的Ub-DRl-Uc结构(为最小包装单位的包装信号)，EcoRI酶切PGEMT线性T载体(购自大连宝生物公司)，Klenow酶(购自大连宝生物公司)补平EcoRI酶切后的PGEMT线性T载体，将188bp的片段以平端化末端加入PGEMT，以T7通用引物进行测序(测序由北京三博远志测序公司完成)，以T7 为引物测出188bp长度的片段，测序结果见SEQ ID NO :2 (其中，双划线的部分为Ub， 瀲体激分为f/c，单划线的部分为DRl)5，- CGGCC AGACCCCAACCCCAAAAACGGGGCCCCCCCCGAAACUb
ACACCCCCGGGGGTCGCGCGCGGCCCTTTAAAGCGCGGCGGCGG GCAGCCCGGGCCCCCCGCGG CrrGGGGCGGCGCGCAAAAAAGGDRlUC
CGGCCGGCGGCCCGGGCGGCGGGCGCGCGCACGGCGGGCGTTGGGGGCGGGGCCGCGGGAG _ >’将获得的188bp片段(由BsrBI酶切1. 3Kb的片段，BsrBI酶切后产生的为平段)，克隆入psi2. O-mcs-dsred和psi2. O-mcs-LacZ的BglII位点中，从而分别构建成 psi2. O-mcs-dsred-pac 禾口 psi2. 0_mcs_LacZ_pacoOriS 的获得MluI酶切BAC-HSV-1HF获得含末端重复区的BAC-TR，接着NotI酶切BAC-TR获得 3. 5Kb的含oriS及其侧翼序列的片段，AgeI酶切3. 5Kb的含oriS及其侧翼序列的片段后获得1. 7Kb的含oriS核心区及其侧翼序列的片段并用于构建扩增子载体，另用NcoI酶切 1. 7Kb的片段后获得1. 2Kb的含oriS核心区域及其部分侧翼序列的片段，EcoRI酶切PGEMT 线性T载体(购自大连宝生物公司)，Klenow酶(购自大连宝生物公司)补平1.2Kb的片段和EcoRI酶切后的PGEMT线性T载体，将1. 2Kb的片段以平端化末端加入PGEMT，以T7通用引物进行测序(测序由北京三博远志测序公司完成)，以T7为引物测出409长度的片段， 其序列为SEQ ID NO 1 5’ -TGGGTTTCTGTCGTCGGAGGCCCCCGGGGTGCGTCCCCTGTGTTTCGTGGGTGGGGTGGGCGGGTC TTCCCCCCCCCCCGCGTCCGCGTGTCCCTTTCCGATGCGATCCCGATCCCGAGCCGGGGCGTCGCGATGCCGACGCC GTCCGCTCCGACGGCCCTCTGCGACTCCCGCTCCCGGTCCGCGTGCTCCGCAGCCGCTCCCGTCGTTCGTGGCCGGC GCCGTCTGCGGGCGTCGGTCGCGCCGGGCCTTTATGTGCGCCGGAGAGACCCGCCCCCCGCCGCCCGGGCCCGCCCC CGGGGCCGGCGCGGAGTCGGGCACGGCGCCAGTGCTCGCACTTCGCCCTAATMTATATATATATTGGGACGAAGTGC GAGCGCTGGGGGTGCTCACTTCTTTGAGCCGGCG-3’ (下划线部分为长度为的 oriS 的核心区域)经BLAST分析后，该序列与HSV-117株的序列同源性为97 %，由于所测出的序列已包括oriS核心区域，故剩下的片段没有继续进行测序。将1.7Kb的片段 カロ 入 psi2. Ο-mcs-dsred-pac 中的 HindIII 位点即构建成扩增子 A(Amplicon A, Amplicon-dsred)，SpeI和SphI双酶切Amplicon Α,并确定加入的oriS为正方向；将1. 2Kb 的片段加入psi2. O-mcs-dsred-pac中的HindIII位点构建成扩增子B (Amplicon B), SpeI 和SphI双酶切Amplicon Α,并确定加入的oriS为正方向。含dsred、0riS、pac序列的扩增子载体见图4中“1”。Amplicon A 和 Amplicon B 的功能比较实验步骤(1)实验前一天，Vero細胞置于六孔板，实验当天Vero细胞达到90%贴壁时进行转染，用脂质体2000转染质粒各2ygAmplicon A和Amplicon B于Vero细胞中，Mi后换液。(2) 24h后，加入MOI = 1的HSV-1 HF株野生病毒感染六孔板各孔。⑶感染4 后收获病毒。(4)收获病毒，三次冻融裂解后TCID50法測定病毒滴度。(5)将收获的分別含Amplicon A和Amplicon B假性病毒的混合病毒液，用相同的滴度(Μ0Ι = 1)进行第二次感染Vero細胞，48小时后荧光倒置显微镜下观察Amplicon A 和Amplicon B的红色荧光表达情況，红色荧光代表扩增子的复制能力。结果48小时后荧光观察，Amplicon A(图 7 “ ⑴”)和 Amplicon B(图 7 “(2) ”) 均有复制能力。但是结果显示Amplicon A的复制能力显著高于Amplicon B，表明本发明制备的1. 7Kb的含有OriS的片段除了具有核心区的复制功能外，还具有复制增强序列，故在以下的实施例中本发明人将siRNA分子加入Amplicon A中进行下一步的抗病毒实验。实施例3、靶向ICP27的siRNA分子的有效性筛选实验采用Ambion公司的设计软件，分別设计靶向HSV-I立早基因ICP27 mRNA的3个干扰分子所述的siRNA对应序列如下ICP27-SiRNAl :5，-GGGTCTCCTGGGAAACCTTCT-3，(SEQ ID NO 3)；ICP27-SiRNA2 :5，-GGCGGATTAAGGACATTCTCA-3，(SEQ ID NO 4)；ICP27-SiRNA3 :5，-GGGCCTGATCGAAATCCTACT-3，(SEQ ID NO 5)；为了在体内形成所述siRNA，涉及寡核苷酸模板如下(每ー SiRNA对应两条分别是互补配对的上下链序列，经退火后可以形成双链DNA，将此DNA连接至扩增子载体，该载体就可以表达siRNA分子，以下的T为top即上链，B为bottom即下链)ICP27-SiRNAl(SEQ ID NO 6)T 5' -CCGGGGGTCTCCTGGGMACCTTCTCMGAGMAGGTTTCCCAGGAGACCCTTTTTTGGMG-3，；B :5，MTTCTKIMMAAGGGTCKrrGGGAAA0CrTTCrcrTGAGMGGTTKmGGAGA0000C-3，(SBQ ID NO 7)。ICP27-SiRNA2 T :5，"00GGGG0GGAnMGGAQ\TTCKMGAGMATGT0CrTMTGT00GCCmTTTGGMG-3，(SBQ ID NO :8)；B :5，-MTTCTKIMMAAGGOGGACMTMGGACMTTCrcrTGAGATGTOCrTMTGTOOGCOOC-3，(SBQ ID NO :9)。ICP27-SiRNA3 T 5' "00GGGGGCCrGAT0GMAT0CrACKMGAGATAGGATTT0GATQ\GGanTTTTTGGMG-3，(SBQ ID NO :10);
B 5' -MncrmMMAGGG0CMraGAAAT0CrAICICnGAGTAGGATnOGATaVGG0000C-3，( ) K) NO :11)。以上寡核苷酸模板由上海生物工程技术服务有限公司合成。将以上设计的上下链分子(T，B之间互补配对，经退火后可以形成双链DNA分子，用以插入到载体中)通过 EcoRI和AgeI位点(T链，B链的退火产物两端会暴露出EcoRI和AgeI位点的接头，即 CCGG和AATT)插入慢病毒pLKO. 1-purOr载体(购自Addgene)，将携带siRNA分子的慢病毒pLKO. l-puror载体和包装质粒Δ 8. 2 (购自Addgene)、包膜质粒VSV-G (购自Addgene) 共转染细胞(购自ATCC)完成对慢病毒的包装，将包装后的携带siRNA分子的 pLKO. l-puror慢病毒感染Vero细胞，建立可以稳定表达siRNA分子的Vero细胞系。用 HSV-IHF株病毒感染Vero细胞系，48小时后TCID50法测定各组细胞的病毒滴度，同时实时荧光定量PCR检测各组细胞内ICP27mRNA表达水平，Western blot检测各组细胞内ICP27 蛋白表达情况。结果，48小时后TCID50法测定各组细胞的病毒滴度，实验组病毒滴度下降(P < 0. 05), PCR检测实验组细胞内ICP27mRNA表达水平(P < 0. 05)。Westernblot检测实验组细胞内ICP27蛋白表达较对照组下降，结果发现，其中siRNA2的效果最为理想。实施例4、携带靶向HSV-I立早基因ICP27siRNA的扩增子构建及其抗病毒效果前述含有ICP27_SiRNA2 (即合成的T链和B链的退火产物)的慢病毒 pLKO. l-purc/载体，利用Hindlll/EcoRI酶酶切后获得带TO启动子的siRNA的表达核(片段大小约400bp)，将表达核分别连接至前述实施例2获得的HSV-I扩增子载体(含dsred 报告基因，即Amplicon A)的SpeI酶切位点中构建完成Amplicon-dsred-siRNA27，见图4 中 “2”。用相同质量2ug的实验组Amplicon-dsred-siRNA27(图中简写为 Amplicon-ICP27 siRNA)质粒和对照组(图中简写为Amplicon，不含有siRNA，其它元件均相同)转染Vero 细胞，24h后，加入相同滴度(Μ0Ι = 1)的野生病毒HSV-IHF病毒感染细胞，感染4 后收获病毒液，感染Vero细胞。按上述步骤重复操作3次。观察红色荧光的比值及细胞病变情况 (CPE)，用以确定抗病毒效果。结果野生病毒(HSV-1HF株)滴度明显下降，见图11。实施例5、不同血清型及不同株的HSV病毒对扩增子载体的包装效果研究脂质体转染扩增子载体(以上实施例4获得的Amplicon-dsred-siRNA27)于Vero 细胞中，次日，分别用HSV-I HF株(HF)，HSV-IF株(F;获自武汉病毒所)，HSV-2 333株(333;获自武汉病毒所)野生病毒感染細胞(Vero細胞)，感染4 后收获病毒，将收获的病毒再次感染Vero細胞，观察不同血清型及不同株的HSV病毒是否可以对扩增子载体进行包装。结果HSV扩增子具有利用HSV不同血清型和不同基因型病毒株进行包装的能力， 见图10。实施例6、单纯扩增子竞争性抑制野生HSV病毒复制效果的研究(1)实验前一天，Vero細胞置于六孔板，实验当天Vero细胞达到90 %贴壁率时进行转染，用脂质体2000转染质粒(Amplicon-dsred质粒)2μ gjh后换液，质粒转染进行三个重复；保留部分孔不转入质粒；(2)24h后，加入MOI = 1的HSVl野生病毒(即HSV-1 HF株)感染六孔板各孔，包括转染有质粒的孔和没有转染质粒的孔；C3)感染4 后收获病毒；(4)将收获病毒三次冻融裂解后測定滴度，得到第一次病毒滴度结果(Rl)；(5)用第一次感染获得病毒，用相同的滴度(Μ0Ι = 1)进行第二次感染Vero細胞， 48小时后收获病毒，測定病毒滴度，得到第二次病毒滴度结果(R2)；(6)用第二次感染获得病毒，用相同的滴度(Μ0Ι = 1)进行第三次感染Vero細胞， 48小时后收获病毒，測定病毒滴度，得到第三次病毒滴度结果(R3)。结果实验结表明随着感染轮数增加，携帯红色荧光的扩增子的数量逐渐增加。CPE程度减轻(图12-13)，实验组和对照组病毒滴度測定结果第一次转染后，用相同MOI的病毒去感染細胞，48小时收获病毒测定滴度，结果表示Amplicon-dsred+HSVl组比HSVl组病毒滴度下降10倍。第二次用HSVl和Amplicon-dsred+HSVl相同滴度的病毒去感染細胞，48小时后收获病毒，病毒滴度測定结果表现为AmpliC0n-dSred+HSVl组比HSVl组病毒滴度下降150倍。第三次用第二次感染收获的相同滴度的HSVl和Amplicon-dsred+HSVl病毒去感染細胞，48小时后收获病毒，病毒滴度测定结果表现为AmpliC0n-dSred+HSVl组比HSVl 组病毒滴度下降300倍。根据扩增复制的实验结果表明随着感染次数的増加，混合病毒中扩增子的比例也在増加。结合本实施例的结果显示随着感染次数的増加，扩增子数量也在不断増加，病毒的滴度却在下降，显示出在扩增子病毒和野生型病毒共同存在吋，可以抑制野生型病毒HSVl的复制，实验组野生病毒滴度明显下降(图14)。讨论 HSV病毒感染宿主細胞，进入細胞后释放线性DNA分子，线性DNA在复制前会首尾相连变成环形(简称为DNA的环化)，这个过程大概在病毒进入細胞的30分钟到6小时之间完成。形成环形结构后，病毒DNA以滚环的形式进行复制，滚环复制的DNA长链，以152Kb为单位进行切割包装，切割包装的位点位于两个a序列之间形成的Pac包装序列(Uc-DRl-Ub 结构)，DRl是位于相邻的两个a序列间的同向重复序列，约17-20bp ；Ub-DRl-Uc为最小的包装信号功能结构(即Pac包装序列)xx。最后，线性基因组与衣壳相结合可成为完整的病毒颗粒。 HSV的扩增子含有HSV的复制起始点oriS和包装信号I^ac。要获得包装信号pac 必需在2个或2个以上串联的a序列结构中进行克隆，因为在TRS区存在一个拷贝a序列，在顶及TRL区存在一个或多个拷贝xxi，所以只能从可能存在2个或2个以上a序列的顶区及TRL区进行克隆。然而如果病毒株在顶区及TRL区只存在一个a序列，则不能获得 pac包装序列。因此传统的从顶区获取pac序列的方法^“具有不确定性。本发明通过构建BAC-HSV-I HF,从TRL端和TRS端的两个首尾相连a序列的区域内获得pac序列。由于野生的HSV在体内形成环的时间为30分钟到数小时，时间极为短暂，在没有克隆载体的情况下很难获得。而本发明人意外的发现，通过BAC重组和克隆技术，才能在HSV形成环状的短暂时间内获得TRL和TRS首尾相连的Pac序列。根据本发明的揭示，采用BAC克隆技术， 可从任何血清型、基因型的HSV病毒株中稳定的获得pac序列。本发明首次从HF株克隆出188bp的Pac包装序列，含有切割包装的最小单位 Uc-DRl-Ub结构，并证明了该包装序列对不同的血清型和基因型的HSV具有通用的包装功能，利用此结构构建的扩增子被证明可持续传代。因此，研究者可以按BAC的克隆方法获得 Pac序列，也可以按本发明人公布的Pac序列进行HSV扩增子的构建。如图9所示BAC携带HSV，当HSV在宿主细胞内再形成首尾相连的环形结构时， 可以将环形的BAC-HSV提取出来(不带BAC的HSV在体内形成首尾相连的环形HSV时，虽然也可以提取出来，但是由于它是一次性的不能在大肠杆菌内进行保存，也不能在大肠杆菌内进行再扩增，所以不能对其在体外进行操作，因为提取出来的HSV环形DNA既有环形又有线性，虽说有一点环形的HSV，但也无法挑取出来进行应用)，由于BAC可以在大肠杆菌内生长，本发明人把BAC-HSV转进大肠杆菌内后，使得HSV的整个基因组DNA以质粒的形式保存于大肠杆菌中，当把大肠杆菌内的BAC-HSV质粒再转染进真核细胞以后，BAC-HSV环形基因组在真核细胞内又可以重新包装出有衣壳的病毒颗粒，这样BAC-HSV以质粒的形式即可在大肠杆菌中保存，又可以在真核细胞内包装病毒颗粒，尽管目前国际上已经构建成的有 BAC-HSV 17株和BAC-HSV KOS株，但主要用于HSV基因的功能研究(如在大肠杆菌内敲除某个基因后，再在真核细胞内研究其功能)，本领域还没有利用BAC-HSV克隆技术获得TRS 和TRL首尾相连形成的Pac序列的报导。本发明人首次克隆出HSV HF株的BAC，从而构建成BAC-HSV HF株，由于HF株网上没有公布其全基因组序列，本发明人首次测序了 HSV HF的复制起始点oriS序列，该oriS 序列含有oriS的ΒοχΙ,ΒοχΙΙ,ΒοχΙΙΙ核心结构，共88bp，本发明人用于构建扩增子载体的 1. 7Kb的含有oriS的片段，除了 88bp的oriS核心区域，剩下的序列为具有增强oriS复制起始点功能的侧翼序列。另外本发明人也首次测出了 HSV HF株的188bp的首尾相连的包装信号Pac序列。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。参考文献_i ChayavichitsiIp P, Buckwalter JV, Krakowski AC, et al. Herpes Simplex[J], Pediatr Rev. 2009Apr ；30 (4) :119-29 ；quiz 130.ii Arduino PG,Porter SR. Herpes Simplex Virus Type 1 infection :overviewon relevan clinico-pathologicalfeatures[J]. J Oral Pathol Med. 2008 Feb ；37 (2) 107-21iii Gupta R, Warren T, ffald A. Genital herpes[J]. Lancet. 2007 Dec 22 ； 370(9605) :2127-37.iv李琦涵，姜莉.人类疱疹病毒的病原生物学[Μ].北京化学エ业出版社， 2009. 3-7.ν Lachmann R. Herpes simplex virus latency.Expert Rev Mol Med. 2003Dec 5 ； 5(29) :1-14.vi Toma HS, Murina AT, Areaux RG Jr, et al. Ocular HSV-I latency, reactivation and recurrent disease. Semin Ophthalmol. 2008 Jul-Aug ；23 (4) 249-73.vii Sun Y, Pei W, Wu Y, et al. Herpes simplex virus type 2 infection is a risk factor for hypertension[J]. Hypertens Res. 2004 Aug ；27 (8) :541-4.viii Itzhaki R. Herpes simplex virus type 1, apolipoprotein E and Alzheimer' diseasev[J]. Herpes. 2004Jun ； 11 Suppl 2 :77A-82A.ix Letenneur L,Peres K,Fleury H,et al.Seropositivity to herpes simplex virus antibodies and risk ofAlzheimer ' s disease -.a population-based cohort study. PLoS One. 2008 ；3 (11) :e3637.χ Gilbert C, Bestman-Smith J, Boivin G. Resistance of herpesviruses to antiviral drugs :clinical impacts andmolecular mechanisms[J]. Drug Resist Updat. 2002 Apr ；5 (2) :88-114.xi Morfin F, Thouvenot D. Herpes simplex virus resistance to antiviral drugs[J]. J Clin Virol. 2003Jan ；26(1) :29-37.xii Schang LM. Herpes simplex viruses in antiviral drug discovery[J]. Curr Pharm Des. 2006 ；12(11) :1357-70.xiii Hosken NA. Development of a therapeutic vaccine for HSV-2[J]. Vaccine. 2005 Marl8 ；23 (17-18) :2395-8.xiv Jones CA, Cunningham AL. Vaccination strategies to prevent genital herpes and neonatal herpes simplexvirus(HSV) disease[J]. Herpes. 2004 Apr ； 11 (1) 12-7.XV Halford WP, Puschel R, Rakowski B. Herpes simplex virus 2 ICPO mutant viruses are avirulent andimmunogenic implications for a genital herpes vaccine. PLoS One. 2010 Aug 17 ；5(8). pii :el2251xvi Yao F,Eriksson E. A novel anti-herpes simplex virus type 1-specific herpes simplex virus type !recombinant[J]. Hum Gene Ther. 1999 Jul 20 ；10 (11) 1811-8.xvii Spaete RR, Frenkel N. The herpes simplex virus amplicon :a new eucaryotic defective-viruscloning-amplifying vector.Ce丄1. 1982Aug ;30 (1) 295-304.
xviii Logvinoff CiEpstein ALA novel approach for herpes simplex virus type 1 ampIicon vector production, using the Cre-IoxP recombination system to remove helper virus[J]. Hum Gene Ther.2001 Jan20 ； 12 (2) :161-7.xix Fraefel C. Gene delivery using helper virus-free HSV-I ampIicon vectors[J]. Curr Protoc Neurosci. 2007Jul ；Chapter 4 :Unit 4.14.XX Hodge PD, Stow ND. Effects of mutations within the herpes simplex virus type 1 DNA encapsidationsignal on packaging efficiency. J Virol. 2001， 75(19) :8977-86.xxi M0CARSKI, E. S. ， and ROIZMAN, B. (1982). Herpesvirus-dependent amplification and inversion ofce11-associated viral thymidine kinase gene flanked by viral a sequences and linked to an origin of viralDNA replication. Proc. Nat/. Acad. Sci. USA 79，5626-5630.xxii Nasseri, Μ. , and E. S. Mocarski. 1988. The cleavage recognition signal is contained within sequencessurrounding an a~a junction in herpes simplex virus DNA. Virology 167 :25-30.
权利要求
1.ー种扩增子载体，其包括以下操作性相连的元件单纯疱疹病毒-1的复制元件oris，包装信号pac。
2.如权利要求1所述的扩增子载体，其特征在干，所述的复制元件oriS的序列如SEQ ID NO 1所示；或所述的复制元件oriS序列如下获得=MluI酶切BAC-HSV-1HF获得含末端重复区的BAC-TR，接着NotI酶切BAC-TR获得含oriS及其侧翼序列的片段，AgeI酶切前述片段后获得含oriS核心区及其侧翼序列的片段，作为复制元件oriS的序列；所述的包装信号pac的序列如SEQ ID NO :2所示；或所述的包装信号pac如下获得 MluI酶酶切BAC-HSV-1HF，获得含末端重复区的BAC-TR，SacI酶切BAC-TR获得含HSV-I 末端重复区“pac”序列的片段；HphI酶切前一片段获得含末端重复区“pac”序列的片段； BsrBI酶切前一片段后获得W3-DRl-Uc结构，作为包装信号pac的序列；
3.权利要求1所述的扩增子载体的用途，用于制备防治单纯疱疹病毒感染的組合物。
4.ー种抑制单纯疱疹病毒的构建物，其包括以下操作性相连的元件单纯疱疹病毒-1的复制元件oriS，包装信号pac，和抑制单纯疱疹病毒的元件。
5.如权利要求4所述的构建物，其特征在干，所述的抑制单纯疱疹病毒的元件选自干扰分子，LAT基因，免疫因子。
6.如权利要求5所述的构建物，其特征在干，所述的干扰分子是特异性抑制单纯疱疹病毒的基因表达的siRNA或shRNA。
7.权利要求4所述的构建物的用途，用于制备防治单纯疱疹病毒感染的組合物。
8.一种复制元件oriS的序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO=I所示；或其核苷酸序列如下获得=MluI酶切BAC-HSV-1HF获得含末端重复区的BAC-TR，接着 NotI酶切BAC-TR获得含oriS及其侧翼序列的片段，AgeI酶切前述片段后获得含oriS核心区及其侧翼序列的片段，作为复制元件oriS的序列
9.ー种包装信号pac，其核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示；或其核苷酸序列如下获得=MluI酶酶切BAC-HSV-1HF，获得含末端重复区的BAC-TR，SacI 酶切BAC-TR获得含HSV-I末端重复区“pac”序列的片段；HphI酶切前一片段获得含末端重复区“ pac”序列的片段；BsrBI酶切前一片段后获得W3-DRl-Uc结构，作为包装信号pac 的序列。
10.一种组合物，其含有有效量的权利要求1所述的扩增子载体或权利要求4-6任一所述的构建物；以及药学上可接受的载体。
全文摘要
本发明涉及一种HSV扩增子为载体的抗病毒制剂。本发明首次揭示一种扩增子载体，其可竞争性地抑制病毒本身；还成功地利用扩增子载体表达抑制单纯疱疹病毒的基因(如siRNA)，其可抑制HSV病毒本身。本发明的HSV扩增子抗病毒制剂既能够利用疱疹病毒再复制自身，又能携带抗病毒的干扰分子，可产生持久的抗病毒效应。
文档编号C12N15/11GK102533823SQ20101057762
公开日2012年7月4日 申请日期2010年12月8日 优先权日2010年12月8日
发明者韩志强 申请人:郑州威瑞生物技术有限公司