专利名称：一种能感染茶尺蠖的重组核型多角体病毒的制备方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域中重组病毒的构建，具体涉及对家蚕核型多角体病毒进行基因重组构建基因工程病毒的方法。
背景技术：
茶尺蠖(Bctropis oblique)，又称拱拱虫、量寸虫、吊丝虫，是茶树的主要害虫，该虫属鳞翅目(I^pidoptera)尺蛾科(Geometridae)。幼虫食叶，暴发时可将成片茶园食成光杆，致茶叶减产60%以上，严重影响成茶品质。以往防治茶尺蠖的基本方法为加强预测预报和农业防治，人工捕杀，科学使用化学农药。但是长期大量使用化学农药，致使害虫抗药性增强，天敌数目减少，造成害虫的再猖獗和爆发危害，由于农药的使用、导致环境污染、茶叶中农药残留增加、品质下降。为解决这个问题，许多专家开始研究用生物农药来防治茶树害虫，其中昆虫病毒是其中比较常用的一种。茶尺獲核型多角体病毒(Bctropis obliqua nucleopolyhedrovirus, EcobNPV) 是茶尺蠖的病原性天敌，可通过食下在虫体内迅速增殖，使其染病死亡。因此，EcobNPV可以作为生物杀虫剂用于茶尺蠖的防治。利用自然饲料(茶树鲜叶)或利用菊花作为饲料， 在室内饲喂茶尺蠖，通过接种EcobNPV使茶尺蠖染病，从患病的虫体中收集EcobNPV。用上述方法繁殖EcobNPV具有明显不足茶尺蠖人工饲养技术不成熟，难以大规模饲养，因此通过人工饲养茶尺蠖繁殖的病毒数量满足不了茶尺蠖生物防止的要求，且该法生产EcobNPV的成本很高。
发明内容
本发明的发明目的是提供一种制备能感染茶尺蠖的重组核型多角体病毒的方法， 以一种低成本、易控制的方法大量提供能感染茶尺蠖的重组核型多角体病毒。为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是一种能感染茶尺蠖的重组核型多角体病毒的制备方法，包括以下步骤
(1)制备包含茶尺蠖核型多角体病毒的包膜蛋白odv-e25、odv-US和解螺旋酶基因的片段，带启动子的家蚕核型多角体病毒基因polh的重组载体，得到重组载体 pFastBacDual—polh—helicase ；
(2)将重组载体pFastBacDual-polh-helicase 转化进五 coli DHlO BmBacmid 感受态细胞内，在培养板上培养，然后通过蓝白斑筛选获得阳性菌斑，从阳性菌斑中提取重组BmBacmi d-卯从-AWicawDNA ；所述培养板含卡那霉素、庆大霉素、四环素、 5-溴-4-氯-3-吲哚- β -D-半乳糖苷和异丙基硫代-D半乳糖苷；所述阳性菌斑为白色菌落；
(3)将上述重组BmBacmid-Z7O^-AWica1SeDNA转染到家蚕培养细胞，培养4 6天， 收集培养细胞上清，获得Pl代重组病毒BmEoNPV ；采用Pl代重组病毒BmEoNPV感染家蚕培养细胞，培养4 6天，收集培养细胞上清，获得P2代重组病毒BmEoNPV ；
(4)每头5龄家蚕注射1 2微升P2代重组病毒BmEoNPV，发病后，纯化重组病毒多角体，即得所述能感染茶尺蠖的重组核型多角体病毒。上述技术方案中，所述重组载体pFastBacDual-polh-helicase的制备方法包括以下步骤
(a)以茶尺蠖核型多角体病毒EcobNPV的DNA为模板，采用PCR扩增法扩增出EcobNPV 的包膜蛋白odv-e25、odv-e28和解螺旋酶基因的片段，克隆进pMD19_T载体，获得质粒 pMD19-helicase ；
(b)分离带启动子的家蚕核型多角体病毒基因polh，克隆进pFastBacDual载体，获得质粒 pFastBac Dual-polh ；
(c)双酶切质粒pMD19-helicase，回收EcobNPV的包膜蛋白odv_e25、 odv-e28和解螺旋酶基因的片段，克隆进载体pFastBacDual-polh，获得重组载体 pFastBacDual-polh_helicase0上述技术方案中，步骤(a)中，PCR扩增法中涉及的引物可根据GenBank已登录的 EcobNPV全基因组序列(登录号为DQ837165)，在病毒解螺旋酶基因两端分别设计，优选地， 所述引物包括
SEQ ID No. 1 =Eo-Helicasel GAACTAGTATGATTGGTGTAATCGT (下划线示分e I位点)； SEQ ID No. 2 :Eo-Helicase2 :CACTGCAGACTTTGCA CGTAGTTTGTGTATATG (下划线示Ai I位点)；步骤(c)中，双酶切质粒pMD19-helicase的步骤中，采用的用和/^I内切酶。上述技术方案中，步骤(b)中，分离带启动子的家蚕核型多角体病毒基因polh的方法选自以下两种方法中的任何一种
(一)用限制性内切酶5 / I酶切家蚕核型多角体病毒BmNPV的DNA，回收含有完整多角体蛋白基因编码区以及启动子的片段Po从，该片段大小约为1.4 1Λ ；
或者，(二)通过PCR体外扩增的方法从家蚕核型多角体病毒的DNA中克隆含有完整多角体蛋白基因编码区以及启动子的片段/70从。本发明同时要求保护采用上述制备方法制得的能感染茶尺蠖的重组核型多角体病毒。本发明同时要求保护上述能感染茶尺蠖的重组核型多角体病毒作为防治茶尺蠖的生物杀虫剂的应用。因此，本发明同时要求保护一种防治茶尺蠖的生物杀虫剂，所述防治茶尺蠖的生物杀虫剂的主要活性成分为上述能感染茶尺蠖的重组核型多角体病毒。在实际应用中，将上述能感染茶尺蠖的重组核型多角体病毒喷洒在茶叶树叶面上，可防止茶尺蠖对茶叶树的危害。由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点
1.用本发明的技术方案构建的重组病毒BmEoNPV既能感染家蚕又能感染茶尺蠖；用家蚕生产能感染茶尺蠖重组核型多角体病毒可以满足生物防治对大量病毒的需求。2.用本发明技术方案生产的重组病毒BmEoNPV成本低、生产易控。
图1是实施例一中PCR扩增出的EcobNPV的包膜蛋白odv-e25、odv_d8和解螺旋酶基因的片段(约5.01Λ)的电泳图；其中，M为DNA标准分子量；1为PCR产物；
图2是实施例一中pMD19-helicase的鉴定；其中，M为DNA标准分子量，1为 pMD19-helicase DNA用分e I禾Π Ai I双酶切后电泳；
图3是实施例一中pFastBacDual-polh-helicase的鉴定；其中M为DNA标准分子量， 1 为 pFastBacDual-polh-helicase DNA 用^asH I 酶切后的电泳；
图4是实施例一中Pl代重组病毒BmEoNPV的PCR鉴定；其中，M为DNA标准分子量；1 为以重组质粒pFastBacDual-polh-helicase为模板，2为Pl代重组病毒BmEoNPV DNA为模板；
图5是实施例一中P2代重组病毒BmEoNPV感染家蚕培养细胞4 一 6天后的细胞变化； 可见细胞变圆，细胞核中形成多角体。
具体实施例方式下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述
实施例一能感染茶尺蠖重组核型多角体病毒的构建，包括如下步骤，
1.根据GenBank已登录的EcobNPV全基因组序列(登录号为DQ83716Q，在病毒解螺旋酶基因两端分别设计引物
SEQ ID No. 1 =Eo-Helicasel GAACTAGTATGATTGGTGTAATCGT (下划线示 Sue I 位点)， SEQ ID No. 1 :Eo-Helicase2 :CACTGCAGACTTTGCACGTAGTTTGTGTATATG(下划线示/ ^ I 位点)，
2.以EcobNPV DNA 为模板，用 Eo-Helicasel、Eo-Helicasel 引物进行 PCR 扩增， PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图谱参见图1。将扩增出的EcobNPV的包膜蛋白0dv-e25、 odv-e28和解螺旋酶基因的片段(约5. Okb)，克隆进pMD19_T (TAKARA公司产品)载体，获 pMD19-helicase ；
pMD19-helicase 的鉴定结果参见图 2。pMD19-helicase DNA 用分e I ^WPst I 双酶切可切出约5. Okb的条带。3.按常规方法，提取BmNPV-DNA，用5 / I酶切后，回收5 / I片段(含有完整的多角体蛋白基因及启动子，约1.4kb)，克隆进pFastBacDual (Iinvitrogen公司产品)的5 / I 位点，获得质粒 pFastBac Dual-polh ；
4. pMD19-helicase用分el和AiI双酶切，电泳，胶回收长度约为5. 01Λ的片段，连接至载体pFastBacDual-polh 的1§7￡^1禾口/ >^1位点，获得质粒口？88{88001181-口0111-1161化886 ； pFastBacDual-polh-helicase 的鉴定结果参见图 3。pFastBacDual-polh-helicase DNA经及I酶切，可切出T^OObp左右和9000bp左右的条带，与预想的片段大小相同， 说明所得到的质粒为正确的重组质粒。5. pFastBac Dual-polh-helicase ^it Ε. coli DHlOBmBacmid C^itTj^^i 参见:Cuiping Cao 等，Development of a rapid and efficient BmNPV baculovirus expression system for application in mulberry silkworm, Bombyx mori. RESEARCH COMMUNICATIONS. 2006, 91 (12) : 1692-1697)感受态细胞，涂布于含卡那霉素(kan, 50μδ/πι),庆大霉素(Gen, 7μδ/πι1)，四环素(Tet, lOPg/ml)，5_ 溴 _4_ 氯 _3_ 吲哚-β -D-半乳糖苷(X-gal，100μδ/πι1)和异丙基硫代-β -D半乳糖苷(IPTG, 40μδ/πι1)筛选平板上，倒置培养皿，37°C培养至少48h，并把平板放置4°C冰箱直至看到明显的白斑。6.用灭菌牙签挑取白斑单菌落，然后在含Kan (5(^g/ml)，Gen (7μδ/ ml), Tet (1 OPg/ml)的3ml液体细菌培养基，37°C震荡培养至对数生长期，提取 ^acmiA-polh-helicase 基因组 DNA。7.取 4yg 重组 BmBacmid-polh-helicase DNA 与 8μ1 脂质体混合后，转染 1 X 106/ml的家蚕培养细胞，27°C培养4 一 6天，细胞出现明显病变，并有多角体形成。收集发病细胞上清，获Pl代重组病毒BmEoNPV。Pl代重组病毒BmEoNPV的鉴定参见图4。以Pl代重组病毒BmEoNPV DNA为模板， Bm Polh-Hel-I(SEQ ID No. 3 5，-GATCTTCGGCAACCATGTAG-3，)和 Bm Polh-Hel-2(SEQ ID No. 4 :5，-CGTGTTATCGAGGAGCG-3，)为引物进行PCR扩增，可特异性扩增出700bp左右的条带，与理论值相符，表明重组病毒BmEoNPV被正确构建。8. Pl代重组病毒BmEoNPV 10微升，感染1 X 106/ml的家蚕培养细胞，27°C培养 4 一 6天，收集发病细胞上清，获P2代重组病毒BmEoNPV。P2代重组病毒BmEoNPV感染家蚕培养细胞4 一 6天后的细胞变化参见图5。细胞出现明显病变，并可观察到有多角体形成。9.将P2代重组病毒BmEoNPV以每头5龄家蚕注射1 一 2微升，25 °C正常饲养，发
病后，纯化重组病毒多角体。实施例二 实施例一获得的重组病毒BmEoNPV的应用
将实施例一获得的重组病毒多角体，配制IO8多角体/ml的病毒液，喷洒在茶叶树上， 并将野外捕捉到的3 — 4龄茶尺蠖放养在喷洒过重组病毒多角体茶树，自然取食，一周后， 茶尺蠖的自然感染死亡率达63%。
权利要求
1.一种能感染茶尺蠖的重组核型多角体病毒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤(1)制备包含茶尺蠖核型多角体病毒的包膜蛋白odv-e25、Odv-US和解螺旋酶基因的片段，带启动子的家蚕核型多角体病毒基因polh的重组载体，得到重组载体 pFastBacDual—polh—helicase ；(2)WMMMW pFastBacDual-polh-helicase ^iti&B. coli DHlO BmBacmid 胃受态细胞内，在培养板上培养，然后通过蓝白斑筛选获得阳性菌斑，从阳性菌斑中提取重组 BmBacmi d-/7o7A-Aeyica^eDNA ；(3)将上述重组BmBacmid-Z7O^-AWica1SeDNA转染到家蚕培养细胞，培养4 6天， 收集培养细胞上清，获得Pl代重组病毒BmEoNPV ；采用Pl代重组病毒BmEoNPV感染家蚕培养细胞，培养4 6天，收集培养细胞上清，获得P2代重组病毒BmEoNPV ；(4)每头5龄家蚕注射1 2微升P2代重组病毒BmEoNPV，发病后，纯化重组病毒多角体，即得所述能感染茶尺蠖的重组核型多角体病毒。
2.根据权利要求1所述能感染茶尺蠖的重组核型多角体病毒的制备方法，其特征在于，所述培养板含卡那霉素、庆大霉素、四环素、5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-半乳糖苷和异丙 基硫代-β-D半乳糖苷。
3.根据权利要求1所述能感染茶尺蠖的重组核型多角体病毒的制备方法，其特征在于，重组载体PFastBacDual-polh-helicase的制备方法包括以下步骤(a)以茶尺蠖核型多角体病毒EcobNPV的DNA为模板，采用PCR扩增法扩增出EcobNPV 的包膜蛋白odv-e25、odv-e28和解螺旋酶基因的片段，克隆进pMD19_T载体，获得质粒 pMD19-helicase ；(b)分离带启动子的家蚕核型多角体病毒基因polh，克隆进pFastBacDual载体，获得质粒 pFastBac Dual-polh ；(c)双酶切质粒pMD19-helicase，回收EcobNPV的包膜蛋白odv_e25、 odv-e28和解螺旋酶基因的片段，克隆进载体pFastBacDual-polh，获得重组载体 pFastBacDual-polh_helicase0
4.采用权利要求1所述制备方法制得的能感染茶尺蠖的重组核型多角体病毒。
5.权利要求1所述能感染茶尺蠖的重组核型多角体病毒作为防治茶尺蠖的生物杀虫剂的应用。
6.一种防治茶尺蠖的生物杀虫剂，其特征在于，所述防治茶尺蠖的生物杀虫剂的主要活性成分为权利要求4所述能感染茶尺蠖的重组核型多角体病毒。
全文摘要
本发明公开了一种能感染茶尺蠖的重组核型多角体病毒的制备方法，包括以下步骤(1)制备重组载体pFastBacDual-polh-helicase；(2)将重组载体pFastBacDual-polh-helicase转化进E.coliDH10BmBacmid感受态细胞内，在培养板上培养，然后通过蓝白斑筛选获得阳性菌斑，从阳性菌斑中提取重组BmBacmid-polh-helicaseDNA；(3)将上述重组BmBacmid-polh-helicaseDNA转染到家蚕培养细胞，收集培养细胞上清，获得重组病毒BmEoNPV；(4)每将重组病毒注射，纯化得到重组病毒多角体。将上述重组核型多角体病毒喷洒在茶叶树叶面上，可防止茶尺蠖对茶叶树的危害，而且该方法成本低、生产易控。
文档编号C12N15/34GK102260690SQ20111015086
公开日2011年11月30日 申请日期2011年6月7日 优先权日2011年6月7日
发明者刘卫星, 曹广力, 杨益民, 潘中华, 薛仁宇, 贡成良, 郭睿 申请人:溧阳市民生农业科技园有限公司, 苏州大学