专利名称：一种dna或rna复合物的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种DNA或RNA复合物的制备方法，具体涉及尺寸可控、重复性好的 DNA或RNA复合物的制备方法，属于生物药用材料领域。
背景技术：
近些年来，随着对DNA的深入研究，科学家发现许多疾病如遗传性疾病、肿瘤等与人体的基因异常有密切的关系。基因治疗是20世纪90年代发展起来的一种革新性的生物医学技术。它通过一定的方式将人的正常基因或具有治疗作用的基因导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病的目的。基因治疗可用于治疗血友病、 囊性纤维病等很多遗传病，以及癌症、艾滋病等恶性病。1990年美国科学家成功地进行了 ADA(腺苷脱氨酶)缺陷患者的人体基因治疗，这一开创性的工作标志着基因治疗已经从实验研究过渡到临床实验。1991年，我国首例B型血友病的基因治疗临床实验也获得了成功。基因治疗以及RNA干扰的主要难题在于如何将基因物质安全有效地传递到目标细胞中。常用的基因传递载体主要分为病毒类和非病毒类。病毒类载体的优点是病原性低， 基因传递效率高，但是安全性差，对外源基因大小有限制、造价高。常见的非病毒基因药物的传递载体为阳离子化合物，包括高分子，磷脂，树枝状大分子以及多肽等，相对于病毒类载体，非病毒类载体的安全性高，但转染效率较差，这与非病毒类载体与DNA或RNA形成的复合物的结构和性能密切相关。这些合成的靶向分子通过静电和DNA相互作用，能够将基因材料压缩成很小的粒子，完成基因传递。DNA或RNA复合物的结构以及性质决定了其生物相容性以及传递DNA或RNA的效率。文献报道复合物尺寸在IOOnm左右时最有利于基因传递(ffeijun Li and Francis C. Szoka Jr. Pharmaceutical Research,Vol. 24,No. 3,March 2007Lipid_based Nanoparticles for Nucleic Acid Delivery ；Dana J. Gary, Nitin Puri,You-Yeon Won Polymer-based siRNA delivery -Perspectives on the fundamental and phenomenological distinctions from polymer-based DNA delivery Journal of Controlled Release 12U2007)64—73)。目前，将DNA或RNA与阳离子聚合物混合制备复合物的方法主要是简单混合，混合的方法包括漩涡混合、超声混合等，这种方法制备的复合物有以下缺点(1)复合物尺寸较大，通常在200-500nm左右，复合物尺寸较大不利于DNA或RNA的传递；(2)复合物结构可控性差，传统简单混合复合过程在很大程度上受动力学控制，所形成的复合物结构受浓度、 盐度、混合次序、混合速度等多种因素影响，形成的复合物的结构和形貌很大程度上取决于制备的过程，制得的复合物粒子之间尺寸差别较大，不利于DNA或RNA的传递。所以，制备尺寸可控性好，重复性好、复合物尺寸较小的DNA或RNA与阳离子聚合物的复合物从而实现高效的基因传递是目前急需解决的一个技术问题。
发明内容
本发明提供一种DNA或RNA复合物的制备方法，它的步骤如下
1)配制含阳离子聚合物的溶液；2)配制含DNA或RNA的溶液；3)外加直流电场，阳离子聚合物溶液与含DNA或RNA溶液在电场中相遇，复合形成 DNA或RNA与阳离子聚合物的复合物。所述外加直流电场优选是利用电泳设备所产生的电场，优选毛细管电泳、芯片电泳、或板电泳。电场强度范围可适用于5V/cm lOOOV/cm。当所述外加直流电场是利用毛细管电泳设备所产生时，所述外加直流电场的电压是-IKV -9KV。本发明所述方法可以制备所有N/P比例(阳离子聚合物与DNA比例)的DNA或 RNA复合物。在本发明实施例中给出了 N/P比例为0.9 1 3. 1 1的例子，实际制备中并不限于此范围，N/P比例并不造成对本发明的限制。所述阳离子聚合物选自聚乙烯亚胺、多聚赖氨酸、多聚精氨酸、多聚组氨酸、多聚鸟氨酸及上述几种氨基酸的嵌段共聚物、鱼精蛋白、硫酸鱼精蛋白、精胺和壳聚糖中的一种或多种的混合。所述含阳离子聚合物的溶液浓度为-IX 10_8 5X 10_2g/ml。所述含DNA或RNA的溶液浓度为1 X 1(Γ8 5 X l(T2g/ml。当DNA为鱼精DNA，阳离子聚合物为聚赖氨酸时，DNA或RNA复合物的尺寸最小的条件为DNA溶液浓度为lX10_3g/ml，阳离子聚合物溶液浓度为5X10_4g/ml，电场强度为 125V/cm, N/P = 1. 8。所述溶液的配制方法为将阳离子聚合物和DNA分别溶于电泳缓冲液；缓冲液优选 PBS缓冲液、HEPES缓冲液、或Tris缓冲液；进一步优选为0. 2 XPBS缓冲液。本发明技术效果如下当聚电解质发生复合时，聚电解质周围的反离子会被释放出来，使得熵大量地增加，熵的增加时聚电解质发生复合的一个主要驱动力。由于聚电解质复合主要是由熵增驱动的，反离子在溶剂中的分散是一个重要因素。由计算模拟得知，存在外加电场时，反离子并不局限在高分子骨架周围。同时，外加电场的存在可以使得聚电解质不发生折叠。另外， 外加电场还有助于实现DNA或RNA与聚阳离子在分子级别的均勻混合，并且避免了混合次序的影响。因此，在外加电场存在的条件下，调整电场，从而调整反离子的分布和聚电解质的构象来调节和控制DNA或RNA与阳离子聚合物复合过程。本发明基于DNA(或RNA)复合物的熵增驱动原理，提出利用外加电场来调控聚电解质的抗衡离子分布，从而降低了 DNA(或RNA)复合物的熵变，达到了减慢复合物动力学和调控复合物结构的目的。由于DNA(或RNA)带负电，聚阳离子带正电，当施加外加电场的时候，DNA向正极运动，阳离子聚合物向负极运动，DNA (或RNA)和阳离子聚合物在某一位置相遇因为静电作用发生复合。本发明DNA或RNA复合物的制备方法的有益效果为⑴本发明方法制备的 DNA (或RNA)复合物尺寸可控性强，通过调节电场的电压和/或DNA或RNA与阳离子聚合物之间的比例，可以制得尺寸可控的DNA或RNA与阳离子聚合物的复合物；(2)本发明方法制备的DNA(或RNA)复合物尺寸较小，通过调节电场的电压和/或DNA或RNA与阳离子聚合物之间的比例，本发明的DNA (或RNA)复合物尺寸可达到IOOnm左右，非常适合DNA或RNA的传递和细胞转染；C3)本发明方法制备的DNA (或RNA)复合物尺寸均勻一致，方法重复性好，本发明方法不受DNA或RNA与阳离子聚合物的浓度、盐度、混合次序、混合速度等因素的影响，制备的DNA (或RNA)复合物尺寸均勻一致，操作可重复性强。
图1 实验方案示意图；图2 电压为_9kV时，不同N/P下电泳流出曲线图；图3 不同电压下迁移率随N/P变化图；图4 本发明DNA或RNA复合物的原子力显微镜图；图5 最佳电场下复合物的AFM图；图6 简单漩涡混合制备的复合物的上清液尺寸大小；图7 简单漩涡混合制备的复合物的沉淀照片。
具体实施例方式以下实验以鱼精DNA与多聚赖氨酸(聚赖氨酸；Poly-L-lysine，PLL)的在外加电场存在的情况下的复合为例，进一步说明本发明的技术方案和有益效果。实验的示意图见图1。一、实验仪器及样品的配制1、实验仪器为了研究在电场下的复合，利用毛细管电泳仪(P/ACE MDQ, Beckman Coulter Inc.，U. S. Α)提供电场，见图1。毛细管可以用来作为反应分离容器(“hject-Mix-React-S印arate-and-Quantitate”，(IMReSQ))。为了避免荧光染料的影响，用254nm的紫外吸收来监测DNA的运动。2、电泳缓冲液的配制(0. 2 X PBS缓冲液)将标准的磷酸缓冲液固体充分溶解在250mL水中得到PBS缓冲液。稀释5倍成 0. 2XPBS缓冲液，用孔径0. 45 μ m的滤膜过滤后用于实验。3、样品的配制鱼精DNA( 2000bps)和聚赖氨酸PLL(聚合度75-150)作为实验对象。将鱼精DNA和PLL溶于电泳缓冲液中，最终浓度分别为5 X 10_4g/ml和1 X 10_3g/ ml ο4、毛细管的处理以及涂层实验所用的毛细管裸管总长为40. 2cm，有效长度为30cm，内径为100 μ m。裸管用 0. IMNaOH处理3分钟，接着用Mi Ili-Q水，0. IM HCl，Mi Ili-Q水以及0. 2 XPBS缓冲液依次预处理2，3，2，3分钟。将聚吡咯烷酮(PVP)溶于电泳缓冲液，浓度为1%，冲洗3分钟，用于毛细管动态涂层以阻止分析物的吸附以及抑制毛细管壁的电渗流。二、实验过程1、电场的影响将DNA和PLL先后分别由毛细管的两端用压力注入，DNA和PLL的比例由进样时间和进样压力控制。为了防止DNA和PLL在检测窗口之后才发生复合不利于观察，将PLL先推至检测窗口之前然后再施加电场。固定电压为_9kV以及固定DNA的进样量，改变PLL 的进样时间和进样压力，得到如图2的电压流出曲线。之后，改变电压，得到不同电压，不同 N/P的复合物的电泳流出曲线，计算迁移率，发明人得到如图3的曲线。在电场下发生复合时，复合物较DNA自身流出时间减少，说明了流体力学半径Mi 减小，见图2。在图2中，电压为-9kV时，不同N/P比例下(N/P表示PLL/DNA的比例)电泳流出曲线图，其中虚线指的是DNA自身的电泳流出曲线，实线指的是DNA和PLL发生复合时的电泳流出曲线，纵坐标指的是254nm的紫外吸收大小。从图2中发明人发现当PLL的含量较少的时候，电泳流出曲线基本不发生变化，如N/P = 0. 6。当PLL增加的时候，如N/P =1.8的时候，实线出峰时间提前，而且有拖尾。前面的峰是DNA自身出峰时间，而拖尾的部分是DNA和PLL的复合物。由于迁移率μ = q/(6Ji η Μι)，出峰时间的减少说明了迁移率的增加，g卩μ变大(其中q为电荷，η为粘度，Mi为流体力学半径)。当发生复合的时候，q只能减少，η不变，因此μ的增加只能是因为Mi的减小造成的。当Ν/Ρ继续增加的时候，到3. 1的时候，复合物电泳图上基本没有出峰，说明了 DNA被复合完全，且复合物基本为中性。复合有最佳的比例和最佳电场强度，见图3。图3给出了不同电压下迁移率比μ/ μ0随Ν/Ρ变化图，其中μ指的是复合物的迁移率，μ 0是DNA自身的迁移率。从图3中发明人发现不同的电压下，当Ν/Ρ= 1.8的时候，迁移率比都有一个最大值。同样的，在不同的Ν/Ρ比例下，在电压等于_5kV的时候，迁移率比同样存在一个最大值。因此，N/P = 1. 8 和-5kV是该鱼精DNA和PLL复合的最优条件。综合图2和图3，在电场下发生复合时，复合物的流体力学半径明显减小，并且当 DNA或RNA和阳离子聚合物的种类确定时复合过程有最佳的比例和最佳电场强度。2、复合物的结构为了直接观察到复合物的结构，利用原子力显微镜AFM(Atomic Force Microscope)来观察电场下制备的复合物的结构。将毛细管中在电场作用下形成的复合物用压力推出到云母片上，洗盐三次后在超净台中自然干燥。空白样品是在PVP中预分离5min后直接压力推出到云母片上得到，洗盐干燥部分与样品制作相同。仪器型号为 Nanoscope 111(a)(维易科Veeco公司)，EV扫描头，RFESP针尖(维易科Veeco公司，共振频率90kHz)，轻敲模式。实验发现得到的复合物结构尺寸大小比较均一，只有IOOnm左右，原子力显微镜表征见图 4 和图 5。据文献报道(Weijun Li and Francis C. Szoka Jr. Pharmaceutical Research, Vol. 24, No. 3, March 2007 Lipid-based Nanoparticles for Nucleic Acid Delivery ；Dana J. Gary, Nitin Puri, You-Yeon Won Polymer-based siRNA delivery Perspectives on the fundamental and phenomenological distinctions from polymer-based DNA delivery Journal of Controlled Releasel21 U007) 64-73)，复合物的比例为IOOnm左右是用于基因治疗的最佳尺寸。同时，在图4和图5中发现制备得到的粒子尺寸大小比较均勻一致，这充分说明了本发明利用电场制备复合物的优势，复合物的制备可以避免外界因素，比如混合顺序、混合速度等。制备的结构尺寸可控而且混合达到分子级别。3、对比试验
作为对比实验，将鱼精DNA和PLL直接涡旋混合，可以发现在所有的比例下，复合物很快就沉淀出来，见图7，并且上清液中复合物粒子的尺寸都在微米级别以上，见图6(测量粒径大小的仪器为 ZetaPALS, Brookhaven Instruments Corporation, Holtsville, NY.)。现今常见的涡旋制备或者超声制备的复合物往往结构不可控，得到的结构都是“冻结，，(frozen)结构。三、实验结论鱼精DNA与聚赖氨酸(Poly-L-lysine，PLL)的复合在没有电场存在下，二者形成了宏观沉淀，并且上清液中复合物粒子的尺寸都在微米级别以上。而在电场存在下，二者在同样条件下形成了直径IOOnm左右，尺寸分布均勻的复合物粒子。在本发明实验例中，利用毛细管电泳证明了本发明的有益效果。本发明方法可以应用于任何电泳电场下的复合，如芯片电泳、板电泳、工业化电泳技术等。实施例1 将标准的磷酸缓冲液稀释5倍，制备成0. 2 X PBS缓冲液；将DNA溶于缓冲液中，浓度为5X10_4g/ml ；将多聚赖氨酸(PLL)溶于缓冲液中，浓度为lX10_3g/ml ；利用毛细管电泳仪提供电场；将DNA和PLL先后分别由毛细管的两端用压力注入，在电场存在的情况下， DNA向正极流动，PLL向负极流动，DNA和PLL在电场的存在下混合得到DNA或RNA复合物。 固定DNA的进样量，调节电压和PLL的进样量，得到不同尺寸的DNA或RNA复合物。利用原子力显微镜AFM(NAN0SC0PE Ilia, EV扫描头，tapping模式)来观察电场下制备的复合物的结构，复合物尺寸均勻，尺寸在IOOnm左右。实施例2 将标准的磷酸缓冲液稀释5倍，制备成0. 2 X PBS缓冲液；将RNA溶于缓冲液中，浓度为5X10_5g/ml ；将多聚赖氨酸(PLL)溶于缓冲液中，浓度为lX10_4g/ml ；利用毛细管电泳仪提供电场；将RNA和PLL先后分别由毛细管的两端用压力注入，在电场存在的情况下， RNA向正极流动，PLL向负极流动，RNA和PLL在电场的存在下混合得到RNA复合物。固定 RNA的进样量，调节电压和PLL的进样量，得到不同尺寸的RNA复合物。利用原子力显微镜AFM(NAN0SC0PE Ilia, EV扫描头，tapping模式)来观察电场下制备的复合物的结构，复合物尺寸均勻，尺寸在IOOnm左右。以上详细描述了本发明所提供的DNA或RNA复合物的制备方法，本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明构思实质范围内的改动，均落在本发明的保护范围内。
权利要求
1.一种DNA或RNA复合物的制备方法，它的步骤如下1)配制含阳离子聚合物的溶液；2)配制含DNA或RNA的溶液；3)外加直流电场，阳离子聚合物溶液与含DNA或RNA溶液在电场中相遇，复合形成DNA 或RNA与阳离子聚合物的复合物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述外加直流电场是利用电泳设备所产生的电场，优选毛细管电泳、芯片电泳、或板电泳。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述外加直流电场的电场强度范围是5V/ cm 1000V/cmo
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，将阳离子聚合物和DNA分别溶于电泳缓冲液，缓冲液，优选PBS缓冲液、HEPES缓冲液、或Tris缓冲液。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阳离子聚合物与DNA的比例为 0. 9 1 3. 1 1。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阳离子聚合物选自聚乙烯亚胺、多聚赖氨酸、多聚精氨酸、多聚组氨酸、多聚鸟氨酸及上述几种氨基酸的嵌段共聚物、鱼精蛋白、硫酸鱼精蛋白、精胺和壳聚糖中的一种或多种的混合。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含DNA或RNA溶液的浓度范围为 1X10—8 5X10_2g/ml。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阳离子聚合物溶液的浓度范围为-IXlO-8 5Xl(T2g/ml。
全文摘要
本发明公开了一种DNA或RNA复合物的制备方法，属于生物药用材料领域。该方法利用外加直流电场，阳离子聚合物溶液与DNA或RNA溶液在电场中相遇，复合形成DNA或RNA与阳离子聚合物的复合物。本发明方法制备得到的DNA或RNA复合物结构可控、尺寸小、尺寸均匀、有利于DNA或RNA的传递、有利于基因治疗。
文档编号C12N15/87GK102268459SQ201110150739
公开日2011年12月7日 申请日期2011年6月7日 优先权日2011年6月7日
发明者刘赟, 周继寒, 夏玉琼, 孙建波, 杨旭燕, 梁德海, 牛林, 苏翠翠, 郑萃 申请人:北京大学