专利名称：由紫芝液体深层发酵菌丝体得到的均一多糖及其制备方法
技术领域：
本发明涉及由紫芝液体深层发酵菌丝体得到的均一多糖GS-C-W-1、其制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的用途。
背景技术：
食药用真菌具有抗肿瘤抗病毒、降血脂、延缓衰老、护肝排毒、促进核酸和蛋白质生物合成等多种功效，在中国有悠久的使用历史。国内外大量研究表明，真菌多糖是从真菌子实体、菌丝体、发酵液中分离得到的，为真菌类药物的药效部位，是能够控制细胞分裂分化，调节细胞生长衰老的一类活性多糖。紫芝(Ganoderma sinense)作为灵芝属真菌(2005版中国药典)，其有较明显的抗 肿瘤、提高免疫力的功效。由于其制备工艺不明确，多糖含量较低(一般<60%)。另外紫芝粗多糖组分复杂，主要药效部位和组分尚未阐明。且由于紫芝子实体资源稀少，市场上少见紫芝产品。紫芝粗多糖溶解度很差，粘度较大，颜色深，味重，其分子量从几千到上千万，分子量跨度很大，难找到合适的质量控制方法。研究表明，分子量是影响多糖组分药效的主要因素之一，若能将粗多糖分离纯化得到均一多糖，阐明其构效关系，不仅能提高药效水平，并且对质量控制有很大的帮助。中国专利200710045369. 4 “一种紫芝发酵方法及制得的紫芝菌丝体”公开了一种紫芝液体深层发酵产生菌丝体的方法，该菌丝体用水提醇沉法提取得到的粗多糖含量在39 75%，其体内药理实验中，口服剂量为40mg/kg/天时有一定抗肿瘤活性。中国专利200710045368. x “紫芝菌丝体胞内多糖及其制备方法和应用”公开了一种从紫芝液体深层发酵产生的菌丝体中提取制备得到粗多糖的方法。该方法涉及的水提醇沉法提取得到粗多糖含量在39 75%。其药理实验的剂量也为40mg/kg/day (给药方式口服喂药)。杨国红，杨义芳，金隽迪(紫芝液体深层发酵的抗肿瘤活性部位研究[J].中草药，2008，39 (6)877-880)对紫芝液体深层发酵的抗肿瘤活性多糖进行了研究，从紫芝菌丝体中提取得到胞内多糖，其药理实验的剂量也为40mg/kg/天(给药方式口服喂药)。中国专利0910574:200910197329. O “一种紫芝菌丝体抗肿瘤多糖组分GS-C及其制备”公开了一定分子量范围的紫芝液体深层发酵菌丝体多糖的制备。然而，以上专利申请和文章均未涉及多糖分子量、纯度及结构解析方面及药物作用机制方面的研究。鉴于现有技术的状况，需要寻找多糖含量高、具有明显的抗肿瘤活性且给药剂量比常规方法提取得到的粗多糖的更低的紫芝菌丝体多糖组分。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种多糖含量高、抗肿瘤活性更明显且给药剂量更低的紫芝菌丝体抗肿瘤多糖组分。如本发明所使用，“液体深层发酵”是发酵工业上常用的一种发酵方法，它的培养基是液态的。如本发明所使用，“菌丝体”是菌丝集合在一起构成一定的宏观结构。如本发明所使用，“均一多糖”是单糖通过聚合而成的多糖，聚合的糖有特定的结构单元。均一多糖可分为相同单糖形成的聚糖和不同单糖形成的杂多糖。本发明的第一个目的在于提供一种紫芝液体深层发酵菌丝体均一多糖，将其命名为GS-C-W-I，其特征在于，所述均一多糖的总糖含量为大于95 %，优选为大于97. I % ;且所述均一多糖的分子量大于2000KDa。根据本发明的一个优选的实施方式，本发明所述均一多糖GS-C-W-I中多糖的分子量大于2000KDa。根据本发明的一个优选的实施方式，经TLC和HPLC分析可以得知，所述均一多糖GS-C-W-I中的多糖主要由半乳糖和鼠李糖组成，所述半乳糖与葡萄糖的摩尔比为
3.3-3. 7 1，优选 3. 5 : I。进一步,经高碘酸氧化及Smith降解分析得知,所述均一多糖由(I — 6)_a_半乳糖连接的主链和具有通过I — 6取代在主链上的鼠李糖分支所组成。根据本发明的一个优选的实施方式，所述均一多糖在水中pH值为7. 16。本发明的第二个目的是提供一种紫芝液体深层发酵菌丝体提取物，其包含上述均一多糖，所述均一多糖的总糖含量为大于95%,优选为97. I %,且所述均一多糖的分子量大于 2000KDa。本发明通过柱层析将不同分子量多糖分离，从而得到紫芝液体深层发酵菌丝体均一多糖GS-C-W-I，该均一多糖GS-C-W-I在降低给药剂量、并且不增加毒性的前提下能表现出一定的药效。柱层析能按照不同的原理将复杂的混合物分离纯化，已得到单一组分为目的。而分离纯化的关键在于所选的填料，根据本发明的一个优选的实施方式，本发明所选择的两个填料分别是阴离子交换树脂和葡聚糖凝胶，前者是根据被分离组分离子交换能力的差别而实现分离，后者根据被分离组分分子的线团尺寸而进行分离。本发明的第三个目的在于提供上述紫芝液体深层发酵菌丝体均一多糖GS-C-W-I的制备方法，其特征在于，包括如下步骤紫芝液体深层菌丝体粗多糖经过柱层析，得到紫芝液体深层菌丝体均一多糖GS-C-W-I。上述制备方法简单易行、生产周期短、成本较低廉。根据本发明的一个优选的实施方式，柱层析步骤通过加负压进行。采取的仪器设备为螺动泵，自动收集仪。根据本发明的一个优选的实施方式，本发明所选择的两个填料分别是阴离子交换树脂和葡聚糖凝胶。根据本发明的一个特别优选的实施方式，柱层析选择的填料阴离子交换树脂为DEAE-cellulose 52。根据本发明的一个特别优选的实施方式，柱层析选择的填料葡聚糖凝胶的型号为Sephacryl S-300。本发明制备紫芝液体深层菌丝体均一多糖GS-C-W-I的具体步骤如下紫芝液体深层发酵菌丝体多糖组分GS-C(按照中国专利0910574 :200910197329.0 “一种紫芝菌丝体抗肿瘤多糖组分GS-C及其制备”中所述方法得到)经过阴离子交换树脂，葡聚糖凝胶柱得到紫芝液体深层发酵菌丝体均一多糖GS-C-W-I。本发明利柱层析方法将紫芝液体深层发酵菌丝体粗多糖纯化成均一多糖，药理实验表明纯化后均一多糖GS-C-W-I有明显的增强机体免疫作用的活性。本发明方法得到的紫芝液体深层发酵菌丝体均一多糖GS-C-W-I含量为大于95%,优选为97. I % (苯酚-硫酸法检测)，其分子量大于2000KDa。将该均一多糖部位进行药理实验，GS-C-W-I在低浓度下对促进的T淋巴细胞增殖活性有非常显著的作用，对LPS诱导小鼠脾脏B淋巴细胞增殖反应中，随着浓度升高，其增殖活性可以得到一定的提高，但是提高到一定浓度以后，增殖的促进作用开始减弱；提示GS-C-W-I通过提高机体免疫能力达到抗肿瘤作用。且未见对给药动物的毒性反应。因此，本发明的第三个目的在于提供上述紫芝液体深层发酵菌丝体均一多糖GS-C-W-I在制备抗肿瘤药物和提高免疫力药物中的应用。
与现有的技术相比，本方法提供的紫芝液体深层发酵菌丝体均一多糖GS-C-W-I的多糖含量更高、给药剂量更低、纯度更高，且其制备工艺亦适于工业化生产。
图I为本发明实施例I所得紫芝液体深层发酵菌丝体均一多糖GS-C-W-I的HPGPC图谱。图2为用HPGPC检测的实施例I步骤2)中w_l的分子量分布(MWD)结果。图3为实施例I步骤2)中w-1过Sephacry S-300的洗脱曲线。图4为用HPGPC检测的实施例I步骤2)中w-l_S300 (15-25)的分子量分布(MWD)结果。图5为实施例I步骤2)中W-1-S300 (15-25)过S^hacry S-300的洗脱曲线。图6为GS-C-W-I水解后的TLC结果，其中I为果糖，2为岩藻糖，3为阿拉伯糖，4为鼠李糖，5为葡萄糖，6、7为GS-C-W-1，8为半乳糖，9为木糖，10为半乳糖醛酸，11为甘露糖。图7A-7D分别为水、半乳糖、鼠李糖、实施例I制得的GS-C_W_1的HPLC图谱。图8为高碘酸标准曲线。图9A-9D分别为水、赤藓醇、甘油、实施例I制得的GS-C_W_1降解样品的HPLC图
-i'TfeP曰。图10为实施例I制得的GS-C-W-I的紫外图谱。图11为实施例I制得的GS-C-W-I的红外图谱。图12为实施例I制得的GS-C-W-I的1H-NMR图谱。
具体实施例方式为了更好地理解本发明，通过以下实施例来说明，但这些实施例不构成对本发明的限制。实施例I :紫芝液体深层发酵菌丝体均一多糖GS-C-W-I的制备I)紫芝液体深层发酵菌丝体粗多糖GS-C的制备
所述紫芝液体深层发酵菌丝体粗多糖GS-C通过中国专利0910574 200910197329. O “一种紫芝菌丝体抗肿瘤多糖组分GS-C及其制备”中所述方法得到。具体方法如下紫芝菌种(Ganoderma sinense)从山东购得。平板培养基在121 °C下消毒灭菌30分钟，28°C培养4-6天。摇瓶种子培养基121°C消毒灭菌30分钟，冷却后在无菌室接种，在28± I°C摇瓶间的摇床上，震荡培养5-7天，挑选好的摇瓶种子进发酵罐内培养5-6天，最后得到紫芝液体发酵菌丝体。菌丝体用水提取I 3h，提取液减压浓缩，加入乙醇沉淀，沉淀部分干燥至恒重，得粗多糖。将粗多糖用去离子水溶解，用截留分子量为3万的材质为聚酰胺的中空纤维素超滤膜超滤，压力为O. 1-0. 3mPa，溶液流速根据膜保持良好的透过率为宜，收集截留液，用截留分子量为200的纳滤膜浓缩液体，冷冻干燥，得到紫芝菌丝体多糖大于3万部位。取被超滤膜截留多糖，用水溶解，装入截留分子量为30万的透析袋，按透析袋内液袋外液=I 25的比例用水透析，每隔2小时换水I次。用苯酚硫酸法结合HPGPC图谱检测透析效果，至不再透出多糖为止。取截留液，浓缩冷冻干燥，即得多糖组分GS-C。2)柱层析结合HPGPC检测2. lDEAE-cellulose52 纤维素柱层析分离 取GS-C 2. 5g，用少量去离子水溶液溶解，离心分离，将沉淀再用少量去离子水试溶，离心分离，反复3次，合并上清液。取上清液上已平衡好的DEAE-cellulose 52纤维素柱，用去离子水洗脱，以IOmL/管收集洗脱液2个柱体积。每隔2 5管用苯酚-硫酸法测定其吸收值，并做洗脱曲线。合并水洗脱液洗脱下来的主峰，记为w-1 ；HPGPC 检测 色谱条件色谱柱TSK-GEL GMPffxl,柱温35°C，流动相为超纯水，流速O. 3mL/min，检测器为示差折光检测器。用HPGPC检测w-1主峰的行为。样品配制成5mg/mL的水溶液。分析结果见附图2。由附图2可知，该洗脱部分主要由保留时间为19min和22min峰的多糖组成，根据保留时间-分子量对数标准曲线，可知该流份w-1平均分子量大于50w。因此选用SephacrylS_300(分子量分离范围30000-1500000)对w_l进行反复层析。2. 2 第一次 Sephacry S-300 纯化精密称取w-1样品500mg,溶于5mL去离子水，离心除不溶物(离心，IOmin,5000rpm),重复2次,用滴定管吸上清液沿管壁四周缓缓滴入Sephacryl S-300进行分离。用去离子水洗脱，流速为O. 5mL/min,收集5mL/管,收集I. 5-2个柱床的体积。每隔3管以苯酚-硫酸法检测吸光度A490，并做洗脱曲线。见附图3。合并主峰，记为W-1-S300 (15-25)，浓缩，冻干。用HPGPC检测每个主峰的行为。样品配制成5mg/mL的水溶液。进行色谱条件相同的纯度检测。分析结果见附图4。2. 3 第二次 Sephacry S-300 纯化精密称取w-l-S300(15-25)样品250mg，溶于5mL去离子水，离心除不溶物(离心，IOmin, 5000rpm),重复2次,用滴定管吸上清液沿管壁四周缓缓滴入Sephacryl S-300进行分离。用去离子水洗脱，流速为O. 5mL/min,收集5mL/管,收集I. 5-2个柱床的体积。每隔3管以苯酚-硫酸法检测吸光度A490，并做洗脱曲线。见附图5。由图5可知洗脱曲线出现2个峰，分离效果明显，收集主峰25#-43#，减压浓缩到适当体积，冻干，称重，得160mg。即得本方法紫芝液体深层发酵菌丝体均一多糖GS-C-W-I。实施例2 :苯酚硫酸法测定本发明紫芝液体深层发酵菌丝体均一多糖GS-C-W-I的
多糖含量具体步骤如下标品配制精密称定干燥好的葡萄糖25mg,定溶至100ml,配成250ug/ml标品溶液，分别取O. 05,0. 1,0. 15,0. 2,0. 25,0. 3mL于试管中，加去离子水补足O. 3mL，分别加5%苯酚O. 7mL充分摇匀，快速加入浓硫酸4mL，50°C、40min水浴，冷却后测定吸光度。空白配制取0.6ml去离子水，加5%苯酚I. 4ml，浓硫酸8ml，水浴加热，冷却，作
空白液。 标准曲线绘制将标准待测液和空白液用紫外分光光度法于488nm处测其吸收值，并做标准曲线。样品配制取GS-C-W-I样品,精密称定5mg,加入IOml的去离子水中配制O. 5mg/ml溶液，取O. 05ml于试管中，加水补足O. 3ml，按标品液依次加入苯酚、浓硫酸，水浴加热，
冷却，作样品液。检测将待测样品用紫外分光光度法于488nm处测其吸收值，用标准曲线测得GS-C-W-I的多糖含量为97. 1%。实施例3 :用葡聚糖标准品Dextron系列标定本发明紫芝液体深层发酵菌丝体均一多糖GS-C-W-I中多糖的分子量具体方法如下色谱条件TSK-GEL GMPffxl色谱柱；流动相为水；流速0. 3mL/min ;柱温35°C ;检测器为示差检测器。标品Dextron、GS-C-W-l样品分别用水溶解,进样。测定葡聚糖Dextron系列和GS-C-W-l的保留时间，以Dextron的保留时间-Dextron系列的分子量对数值做标准曲线，可知GS-C-W-I的分子量大于2000KDa。实施例4 :紫芝液体深层发酵菌丝体均一多糖GS-C-W-I的结构解析I)完全酸水解取样品8mg溶于2mol/L三氟乙酸(TFA)，充氮气封管，110°C水解4h，管内液减压蒸干，加2mL甲醇溶解并减压蒸干，重复3次以除尽三氟乙酸，再加入ImL去离子水溶液使样品溶解。I. 1GS-C-W-1 水解后的 TLC 结果取O. 05mL该样品以果糖、岩藻糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳醒酸、木糖、半乳糖、鼠李糖为对照单糖分别点样，分别以丙酮水=24 I、正丁醇乙酸乙酯异丁醇醋酸水吡啶=35 100 60 35 30 35展开，最后以苯胺-邻苯二甲酸显色，并在110°C烘烤10-15min，观察结果。见附图6。由图6得知4、8号与GS-C-W-I在同一直线，故可以判断GS-C-W-I存在半乳糖、鼠李糖单糖。I. 2HPLC检测多糖单糖组分色谱柱条件
液相色谱柱TYPEUG80 (4. 6 X 250mm)软件处理系统Minennium32版GPC数据处理系统检测器Water 2410示差折光检测器流动相乙腈水=3 I柱温箱35°C检测器温度35°C流速lmL/minHPLC检测结果见附图7A-7D。根据标品半乳糖与鼠李糖的摩尔量，结合多糖样品HPLC的峰面积比，可以推断多 糖GS-C-W-I单糖中半乳糖鼠李糖=3.5 I (摩尔比)。可以进一步证明TLC点板中存在半乳糖和鼠李糖单糖。2)高碘酸氧化2. I高碘酸标准曲线30mmol/L高碘酸液配制精密称取高碘酸钠322. 08mg定溶于50mL容量瓶。标准曲线的绘制取7个250mL容量瓶分别依次加入高碘酸钠溶液O. 2,0. 4,0. 6，O. 8，1，1.5，2mL，加去离子水定容。放置IOmin后，以水作为空白，用分光光度法，在223nm的波长处测吸收度，以高碘酸钠μ mol/L为横坐标，光密度值为纵坐标作标准曲线。见表I和附图8。表I、不同浓度高碘酸在223nm的吸收度
高碘酸浓度(μηιοΙ/L) A(223nm)
240.231
480.483
r^o1720.73
96 0.978 120 1.212 180 1.829 _240__2.4742. 2高碘酸氧化反应精密称取GS-C-W-I IOmg于IOmL容量瓶中，然后加入15mmol/LNaI04定容至刻
度。放置在暗处反应(4°C )，间隔时间(0h、2h、24h、48h、72h......)取样O. lmL，用蒸馏水
稀释250倍，用紫外分光光度计，以蒸馏水作空白对照，在223nm波长处测吸光度值，直到吸光度值恒定为止。加乙二醇终止反应(中和剩余的高碘酸)，高碘酸氧化完成。2. 3用NaOH滴定甲酸的生成量O. lmol/L NaOH滴定液标定精密称取105°C恒重的邻苯二甲酸氢钾O. 6g溶于50mL新沸过的冷水，酚酞做为指示液，滴定至溶液显粉红色。最终测得NaOH溶液浓度为O.092mol/L。甲基红指示剂配制精密称取O. 1004g,加O. 05mol/L NaOH溶液7. 4mL使溶解，再加水稀释至200mL，即得。取2mL上述氧化液，加I滴甲基红作指示剂，用O. 0092mol/L NaOH(用邻苯二甲酸氢钾标定)滴定，计算得甲酸生成量。2. 4实验结果2. 4. I吸光值恒定时测得A吸收值为O. 295。高碘酸液对照初始A吸收值为O. 607，而高碘酸液在72h后吸收值无变化。故可以得出高碘酸与样品反应的O. 757mol。2. 4. 2根据滴定最后计算得甲酸生成量为O. 34mmolo2. 4. 3而高碘酸消耗量高于甲酸生成量的二倍，说明存在被高碘酸氧化不产生甲酸的己糖残基I — 2、I — 2,6、I — 4、I — 4,6键型；甲酸生成量显不分子中I —、1 — 6键型的己糖残基约占34%，高碘酸消耗量及甲酸生成量显示分子中的糖残基均可被氧化。
3) Smith 降解反应将乙二醇处理后的GS-C-W-I用高碘酸氧化后的溶液透析(Mw = 3500)，蒸馏水透析48小时。浓缩，加入NaBH4还原过夜。用冰醋酸中和至pH为6 7，透析，减压蒸至2mL左右，进行冷冻干燥。将还原的样品放入安瓿瓶中，加入2mL 2mol/L后封管，于110°C下水解4h，反应瓶中的溶液减压蒸干，再加入I 2mL的甲醇，蒸干，重复三次以除尽过量的TFA，水解后的样品用ImL水溶解，做HPLC考察。3. I色谱条件液相色谱柱TYPEUG80 (4. 6 X 250mm)软件处理系统Minennium32版GPC数据处理系统检测器Water 2410示差折光检测器流动相乙腈水=3 I柱温箱35°C检测器温度35°C流速lmL/min对照品为赤藓醇、甘油。3. 2 结果见附图 9A-9D。由附图9D可得知=Smith降解反应产物HPLC检测出大量的甘油，说明含有可以产生甘油的键型，即I—、I — 2、I — 6、I — 2，6 ;未检测出赤藓醇，说明不含有生成赤藓醇的键型，即I — 4、1 — 4,6 ;各部分均未检测出糖残基，说明分子均由可被高碘酸氧化的键型构成。因此推测GS-C-W-I是以I — 6键型为主链接构的键型。4)紫外图谱见附图10。取GS-C-W-1样品进行紫外全波长扫描，在260nm和280nm处未见吸收,证明不含核酸和蛋白质。5)红外图谱取Img GS-C-W-I样品，用溴化钾压片进行IR检测。见附图11。GS-C-W-I红外光谱图有多糖特征吸收，3438. 7CHT1的宽峰是-OH的伸缩振动。2925. 8CHT1峰是糖的C-H伸缩振动，1635. 3cm—1为结合的水吸收峰，1384. 4cm—1是糖的C-H变角振动，以上可判断GS-C-W-I为多糖类化合物。GS-C-W-I在1074. ScnT1的峰为吡喃环的特征吸收峰，在83701^1处有吸收峰,而在89001^1处无吸收峰,其可能为a -D卩比喃半乳糖的吸收峰，说明GS-C-W-I糖苷键类型为α -构型。6)核磁图谱取多糖样品IOmg装入核磁管，溶于重水中，在核磁共振仪上进行1H-NMR,光谱分析。1H-NMR图谱分析从附图12中可见Cl质子化学位移位于δ 4. 8 5. 3间，则证明GS-C-W-I含α型吡喃己糖，与红外结果相符。实施例5 :实施例I制得的紫芝液体深层发酵均一多糖GS-C-W-I的药理活性DGS-C的体内抗肿瘤实验I. I动物昆明种小鼠，雄性
I. 2实验方法取生长良好的小鼠肝癌Η22腹水或Lewis肺癌瘤块，用生理盐水以I : 4稀释(细胞浓度约1-2 X IO7个/ml)，每只小鼠右腋皮下接种O. 2ml。接种后次日起给药，给药体积为O. 5ml/20g体重，小鼠肝癌H22连续腹腔注射7天，Lewis肺癌连续腹腔注射10天。双灵固本散经口灌胃。接种后10日解剖H22，14日解剖Lewis肺癌，取瘤块，称瘤重，结果判定根据以下公式
对照组平均瘤重-给药组平均瘤重
肿瘤抑制率％=__X 100%
对照组平均瘤重I. 3实验结果表I、GS-C对小鼠H22的抑制率
剂量给药动物数动物体重(g)瘤重(g)
组别一抑瘤率％
(mg/kg) 方案始终 (去瘤后)x 士SD
空白对照15 15 29.49±2.67 2.59±0.67
双灵固本散250 igx7 10 10 28.38±2.39 1.70±0.45** 34.40
GS-C5 ipx7 10 10 26.64±2.71* 1.23±0·33** 52.50与对照组比较*Ρ < O. 05广P < O. 01。表2、GS-C对小鼠Η22和Lewis的抑制率
组别剂量给药动物数动物体重(g)瘤重(g) 抑瘤率％
_(mg/kg) 方案始终_(去瘤后)_x 土 SD_
空白对照丨O 1021.19土 1.353.44±0.64
双灵固本散250 ig><7 6 621.41±1.35 2.32±0.36** 32.45
GS-C5 ip><7 6 618.71 士 1.63** 2.05士0.54** 40.26与对照组比较*P < O. 05广P < O. 01。由表1，表2可知分子量大于30万(GS-C)的多糖部位有较强的抗肿瘤作用。
2) GS-C-W-1 的体外 MTT 实验2. I实验材料及配制(I)细胞株A549(人肺癌细胞株)、SK0V3(人卵巢癌细胞株)、K562(人白血病细胞株)、SMMC-7721 (人肝癌细胞株)。上述细胞株由上海医药工业研究药理室保存，传代维持。(2)DMEM完全培养基添加10%新生牛血清(GIBCO BRL)、双抗；⑶O. 25%胰蛋白酶溶液(Trypsin):购自Invitrogen公司，_20°C保存。(4)磷酸缓冲液(PBS) NaC18g, KC10. 2g，Na2HPO4L 15g，KH2PO4O. 2g，溶于 IL 双蒸水，121°C高压消毒20min，4°C保存。
(5) MTT (AMRESC0)溶液用 PBS 配成 5mg/ml 溶液。(6)溶解液每IOOml去离子双蒸水含SDS 10g，异丁醇5ml，浓盐酸O. 1ml。(7)对照品泰素 Bristol Myers Squibb SRL.批号0E60359。2. 2实验方法(I)样品及对照品制备将样品溶解于PB S或DMSO中，得到浓度为10mg/ml的溶液。再用PBS作梯度稀释，得到浓度分别为ΙΟΟΟμ g/ml、100l·! g/ml、10l·! g/ml、l μ g/ml、
0.I μ g/ml、0. 01 μ g/ml的稀释样品。对照品原液为6mg/ml，用PBS作梯度稀释，得到浓度分别为 1000 μ g/ml、100 μ g/ml、10 μ g/ml>I μ g/ml、0. I μ g/ml、0. 01 μ g/ml 的稀释样品。(2)将稀释好的样品和对照品加入平底96孔板中，每孔10μ 1，每点作两个平行测
O(3)取处于对数生长期的细胞，细胞经胰酶消化并洗涤后悬浮于含10%血清的DMEM培养基中，并调节细胞悬浮液密度至2 X IO5细胞/ml。(4)在平底96孔板中，每孔加入90 μ I细胞，最后一孔加入90 μ I培养基，于37°C、5% CO2细胞培养箱中培养48小时。(5)每孔中加入20 μ I 5mg/mlMTT溶液，继续在培养箱中保温3 4小时。(6)每孔加入100 μ I溶解液，继续在培养箱中保温过夜，使生成的甲臢晶体充分溶解。测定570nm光吸收值。(7)通过软件计算样品对各肿瘤细胞的IC50。2. 3实验结果
\^口口名称~~SKOV3~ SMMC-7721~A549细
GS-C-W-I ~>100>100>100由上表看出GS-C-W-1对SK0V3、SMMC-7721、A549人肿瘤细胞株没有细胞毒作用。3) GS-C-W-I的体外免疫实验(Con A和LPS诱导的小鼠脾脏淋巴细胞增殖活性测试的研究。)3. I动物ICR小鼠，雌雄不限。3. 2实验方法3. 2. I试剂配置L-DMEM完全培养基按常规方法配置。
MTT溶液用PBS配成5mg/mL溶液，4°C保存，两周内有效。Con A :用无血清L-DMEM培养基配成10ug/mL溶液，O. 22um微孔滤膜过滤除菌。LPS :用无血清L-DMEM培养基配成40ug/mL溶液，O. 22um微孔滤膜过滤除菌。3. 2. 2脾细胞制备小鼠以颈椎脱位致死，无菌取脾脏，Ficoll分离脾细胞，以L-DMEM培养液洗三次，计数，用含10%胎牛血清的L-DMEM培养液配成2 X IO6细胞/mL细胞悬液。3. 2. 3小鼠脾脏淋巴细胞增殖实验将小鼠脾细胞悬液点于96孔培养板上，每孔IOOuL,设一个对照组，再加入50uL的Con A或LPS (终浓度为2. 5ug/mL或10ug/mL)，最后加入不同量的GS-C-W-I (终浓度为10， 50，100ug/mL)，每孔培养液补足为200uL。将细胞培养板置于含有5% CO2, 37°C培养箱中培养。72h后，加入MTT溶液(5mg/mL)10uL，置于5% C02，37°C培养箱中继续培养4h。取出反应物，离心(2000rpm，5min)，弃上清，每孔加入150uL DMSO,充分振荡，待凝块完全溶解后在酶标测定仪上570nm读出A值。3. 3实验结果在体外对小鼠脾脏淋巴细胞转化的影响的测试结果见表3，表4。表3、GS-C-W-I体外对Con A诱导小鼠脾脏T淋巴细胞增殖的影响
_样品_浓度(ug/mL )_平均值对照 - 0.185±0.013_GS-C-W-I_10_0.291 士0.027#与对照组相比，*P< O. 05，< O. 01。表4、GS-C-W-I体外对LPS诱导的小鼠脾脏B淋巴细胞增殖的影响
_样品_浓度(ug/mL )_平均值
对照-0.196 士 0.014100.173±0.006
GS-C-W-I500.193±0.019
__IjOO__0.122±0.033*与对照组相比，*P < O. 05。表3和表4结果显示GS-C-W-I在低浓度下对促进的T淋巴细胞增殖活性有非常显著的作用，对LPS诱导小鼠脾脏B淋巴细胞增殖反应中，随着浓度升高,其增殖活性可以得到一定的提高，但是提高到一定浓度以后，增殖的促进作用开始减弱；提示GS-C-W-I通过提高机体免疫能力达到抗肿瘤作用。
权利要求
1.紫芝液体深层发酵菌丝体均一多糖，其特征在于，所述均一多糖的总糖含量为大于95%，优选为大于97. 1%，且所述均一多糖的分子量大于2000KDa。
2.根据权利要求I所述的均一多糖，其特征在于，所述均一多糖由半乳糖和鼠李糖组成。
3.根据权利要求2所述的均一多糖，其特征在于，所述半乳糖与鼠李糖的摩尔比为3.3-3. 7 1，优选 3. 5 : I。
4.根据权利要求2或3所述的均一多糖，其特征在于，所述均一多糖由(I—6)-a-半乳糖连接的主链和具有通过I — 6取代在主链上的鼠李糖分支所组成。
5.根据权利要求I至4任一所述的均一多糖，其特征在于，所述均一多糖在水中pH值为 7. 16。
6.紫芝液体深层发酵菌丝体提取物，其包含权利要求1-5任一所述的均一多糖，所述均一多糖的总糖含量为大于95%,优选为97. I %,且所述均一多糖的分子量大于2000KDa。
7.权利要求1-5任一所述的均一多糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤紫芝液体深层发酵菌丝体粗多糖经柱层析得到均一多糖。
8.根据权利要求7所述的均一多糖的制备方法，其特征在于，所述柱层析步骤所用的填料为阴离子交换树脂和葡聚糖凝胶。
9.根据权利要求8所述的均一多糖的制备方法，其特征在于，所述填料阴离子交换树脂为 DEAE-cellulose 52。
10.根据权利要求8所述的均一多糖的制备方法，其特征在于，所述葡聚糖凝胶的型号为 Sephacryl S-300。
11.权利要求1-5任一所述的均一多糖在制备抗肿瘤药物和提高免疫力药物中的应用。
全文摘要
本发明公开紫芝液体深层发酵菌丝体均一多糖，其特征在于，所述均一多糖的总糖含量为大于95％，且所述均一多糖的分子量大于2000KDa。本发明也公开上述均一多糖的制备方法。本方法提供的紫芝液体深层发酵菌丝体均一多糖的多糖含量更高、给药剂量更低、纯度更高，且其制备工艺亦适于工业化生产。
文档编号C12R1/645GK102827297SQ20111015675
公开日2012年12月19日 申请日期2011年6月13日 优先权日2011年6月13日
发明者杨义芳, 牛莉鑫, 金隽迪 申请人:上海医药工业研究院