专利名称：一种分子信标荧光定量pcr检测邻苯二甲酸酯的方法
技术领域：
本发明属于邻苯二甲酸酯的检测领域，特别涉及一种分子信标荧光定量PCR检测邻苯二甲酸酯的方法。
背景技术：
邻苯二甲酸酯(PAEs)是塑料的增塑剂，是世界上生产量大，应用面广的人工合成有机化合物，它广泛应用于塑料工业。这类污染物已大量进人环境，普遍存在于土壤、底泥、 水体、生物、空气及大气降尘物等环境样品中。由于PAEs的广泛存在，其对环境的影响渐渐凸显。研究证明，PAh具有急性毒性、致癌性和致畸性等多种生物毒性。环境行为和生态效应研究表明，邻苯二甲酸酯水解和光解速率都非常缓慢，已成为一种全球性的环境有机污染物，被中国环境检测总站和美国EPA列为优先控制污染物。关于邻苯二甲酸酯的检测有气相色谱法、液相色谱法、气相色谱-质谱法 (GC-MQ、荧光法等。用色谱法检测不但昂贵费时，而且分析过程繁琐冗长。近年来，随着生物技术的发展产生了许多邻苯二甲酸酯的生物检测方法。荧光定量PCR是近年来出现的具有高灵敏度的定量PCR方法。PAEs于细胞质中的雌激素结合后，进一步与结合DNA复合后，形成PCR扩增的模板。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种分子信标荧光定量PCR检测邻苯二甲酸酯的方法，该方法具有灵敏度高，检出限低，特异性强的特点，可用于快速检测大批量样本中的邻苯二甲酸酯的含量，具有良好的应用前景。本发明的一种分子信标荧光定量PCR检测邻苯二甲酸酯的方法，包括(1)将喂养于含邻苯二甲酸酯的水中的鲤鱼杀死并取出肝脏，用KCl溶液洗去血液，吸干水分，加入体积与肝脏质量比为4mL Ig的HEDG缓冲液勻浆，离心取上清，即得含有受体的细胞溶质；(2)将pUC19质粒稀释50倍作为模板，PCR扩增制得结合DNA，将结合DNA于琼脂糖凝胶电泳分离，最后纯化回收；(3)将邻苯二甲酸酯倍比稀释为10、/1-10_ν ，取10μ L与250μ L的细胞溶质混合，于2o°c振荡温育浊；(4)从上述混合物中取20yL加入1.5mLEP管中，20°C温育15min后，再加入2yL 结合DNA，继续20°C温育15min得配体-受体-DNA复合物；从复合物中取12 μ L再加入 2uL ExoIII (核酸外切酶III)缓冲液和6yL HEDG缓冲液，混勻后37°C温育15min，再加入 ExoIIIlOOU,混勻后37°C温育15min进行初次消解；取经初步消解的溶液5 μ L，加入15 μ L Sl核酸酶混合液，于37°C温育30min进行再次消解；再加入IyLSl核酸酶停止液，70°C灭活15min ；得到分子信标PCR的模板；(5)以上述模板进行分子信标荧光定量PCR扩增，分子信标PCR循环40次后在72°C延伸5min，得加入邻苯二甲酸酯浓度与起始模板拷贝数的回归方程；其中，引物碱基序列为上游引物 Rl :5' CAGGTC AGAGTGACC TGC TTC CTC GCT CAC TG 3'；下游引物 R2 5' GTC CAG TCT CAC TGG ACA GGC AAC TAT GGA TG 3'，分子信标探针的序列为 5' FAM-CTTGG CAAGCAGCAGATTACGCCCAAG-DABCYL 3'；(6)根据结合DNA标准曲线进行线性回归分析，得邻苯二甲酸酯浓度与Ct值关系， 测定样品Ct值计算得邻苯二甲酸酯浓度。所述步骤(1)中的KCl溶液浓度为0. 15 0. 2mol/L。所述步骤⑵中的PCR扩增引物碱基序列为上游引物Fl :5' CAG GTC AGA GTG ACC TGC TTC CTC GCT CAC TG 3'，下游引物 F2 5' GTC CAG TCT CAC TGGACA GGC AAC TAT GGATG 3'ο所述步骤O)中的琼脂糖凝胶质量百分比浓度为1%。所述步骤(4)中的Sl核酸酶停止液含0. 3mol/L的Tris碱和1. 35mol/L的EDTA。所述步骤(5)中的分子信标荧光定量PCR扩增体系为每50μ1体系中包括含 25ymol/LMgCl2 的反应缓冲液 5μ L、l. 25mmol/L dNTP 4 μ L、50 μ mol/L 上下游引物各 0. 2 μ L、TaqDNA聚合酶0. 3 μ L、探针0. 3 μ L、模板5 μ L和灭菌双蒸水35. 8 μ L，TaqDNA聚合酶浓度为3U/yl。所述步骤(5)中的分子信标PCR循环步骤为94°C预变性5min，94°C变性30s，55°C 退火 30s，72°C延伸 Imin0本发明将从鲤鱼肝脏中提取的雌激素受体与不同浓度的邻苯二甲酸酯结合形成复合物后，再与用特异性引物合成的结合DNA结合形成配体-受体-DNA复合物，用核酸外切酶III和Sl核酸酶消解。酶切后的产物作为模板，进行分子信标荧光定量PCR扩增，结合定量DNA标准曲线，得到邻苯二甲酸酯浓度与Ct值关系。将外切酶保护与分子信标荧光定量PCR方法结合，制备分子信标PCR模板时，经核酸外切酶III和Sl核酸酶消解，使游离的DNA不能被扩增，从而提高PCR检测准确度及灵敏度，加入了分子信标探针，使检测更具有特异性。有益效果本发明具有灵敏度高，检出限低，特异性强的特点，可用于快速检测大批量样本中的邻苯二甲酸酯的含量。
图1是实施例1标准模板分子信标荧光定量PCR扩增曲线；图2是实施例1标准模板分子信标荧光定量PCR模板浓度-Ct值关系曲线；图3是实施例1不同浓度邻苯二甲酸酯诱导结合DNA的分子信标荧光定量PCR扩增曲线图；图4是实施例1邻苯二甲酸酯浓度的对数与Ct值关系曲线。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例1一、雌激素受体的提取及配体-受体复合物的制备1、含雌激素受体的细胞溶质的提取取在邻苯二甲酸酯浓度为0. 01mg/L的水中驯养的鲤鱼，用5mg/L的苯坐卡因麻醉。取其肝脏，用0. 15mol/L冰上预冷的KCl溶液洗去肝脏外血液，再用灭菌的滤纸吸干表面水分，按照m(肝脏)v(缓冲液)=1 4比例加入HEDG缓冲液(冰上预冷)于玻璃勻浆器中勻浆。勻浆液于15000g离心一小时，小心吸取上清，即为含有受体的细胞溶质，分装后于-80°C保存备用。2、邻苯二甲酸酯-雌激素受体复合物的制备及纯化将lg/L的邻苯二甲酸酯稀释为K^g/L-lO—Vl，各取10 μ L，加入细胞溶质 250 μ L，于20°C振荡温育池。当配体受体反应结束后，加入0. 2mL60%的HAP混勻，冰浴 30min,每IOmin混勻一次，以便HAP充分吸附受体蛋白，在4°C，3500rpm条件下离心lmin， 弃上清。沉淀颗粒加入ImL含0. 05% T-80的HEDG缓冲液，混合洗涤，同样条件下离心 15min。重复3次，最后一次弃上清后，加入0. 4mL0. 2mol/L的磷酸缓冲液，间歇振荡三次， 再离心15min，取上清。此时溶液中为较纯的配体受体复合物。二、配体-受体-结合DNA复合物的制备及外切酶消解1、结合DNA的制备将pUC19质粒稀释50倍作为模板，常规PCR方法扩增制得结合DNA。利用 premierf. 0引物设计软件设计含有反应元件(下划线部分)的上下游引物。引物序列如下上游引物 Fl 5' CGGAG TTCCG TGAGA AGA GG ATAAC GCAGG AAAGA ACATG 3'；下游引物 F2 :5, GTCCAG TCT CAC TGG ACA GGC AAC TAT GGA TG 3，。产物于琼脂糖凝胶电泳分离，用PCR产物快速纯化试剂盒纯化回收。此结合DNA(1036bp)的核苷酸序列如下5 ‘ CAGGTCAGAGTGACCTGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAG CGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCA AAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGA GCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTG GAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGC GTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCA CGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACT TATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAG TGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAA AAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTA CGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCA CGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAA ATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGA TCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGTCCAGTGAGACTGGAC 3’。2、配体-受体-结合DNA复合物的制备
从上述每管中取出20μ 1于1.5mlEP管中，加入Iyg poly(dl. dC)于20°C温育 15min后，再加入2μ 1结合DNA，继续20°C温育15min，此时溶液中为配体-受体-DNA复合物。3、外切酶消解取12 μ L配体-受体-DNA复合物，加入2 μ L ExoIII buffer,6y L HEDG缓冲液，使其体积为20 μ L，混勻后37°C温育15min。再加入ExoIII 100U，混勻后于37°C温育15min。 取出5μ L酶切产物，加入15μ ISl混合液(50U)，37°C温育30min。再加入1 μ LSI停止液 (0. 3mol/L Tris 碱，1. 35mol/L EDTA)，70°C灭活 IOmin0 得到分子信标 PCR 的模板。三、分子信标荧光定量PCR检测邻苯二甲酸酯标准曲线的建立1、定量标准曲线以不同浓度的标准模板进行分子信标荧光定量PCR扩增。PCR扩增条件每50μ L 体系中包含有 10Xbuffer5y L(含25mmol/L MgCl2), 1. 25mmol/L dNTP 4 μ L，50 μ mol/L弓丨物各0· 2 μ L，TaqDNA聚合酶(3U/ μ L) 0· 3 μ L，探针0. 3 μ L,模板5 μ L，灭菌双蒸水35 μ L ； 分子信标荧光定量PCR循环步骤94°C预变性5min，94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸 lmin，循环40次；最后在72°C延伸5min，得出一条定量标准曲线，见附图1、2及表1。在 103-108COpieS/y L范围内，Ct值与起始模板浓度的对数之间有很好的线性关系。两者关系式为y (Ct) = -3. 008x (模板初始拷贝值的对数)+ . 855，相关系数R2 = 0. 99120。表1标准曲线的不同定量模板起始拷贝数与Ct值
权利要求
1.一种分子信标荧光定量PCR检测邻苯二甲酸酯的方法，包括(1)将喂养于含邻苯二甲酸酯的水中的鲤鱼杀死并取出肝脏，用KCl溶液洗去血液，吸干水分，加入体积与肝脏质量比为4mL Ig的HEDG缓冲液勻浆，离心取上清，即得含有受体的细胞溶质；(2)将pUC19质粒稀释50倍作为模板，PCR扩增制得结合DNA，将结合DNA于琼脂糖凝胶电泳分离，最后纯化回收；(3)将邻苯二甲酸酯倍比稀释为10、/1-10_/1，取10μ L与250 μ L的细胞溶质混合， 于20°C振荡温育2h ；(4)从上述混合物中取20μ L加入1.5mLEP管中，20°C温育15min后，再加入2 μ L结合DNA，继续20°C温育15min得配体-受体-DNA复合物；从复合物中取12 μ L再加入2 μ L ExoIII buffer和6μ L HEDG缓冲液，混勻后37°C温育15min，再加入ExoIIIlOOU，混勻后 37°C温育15min进行初次消解；取经初步消解的溶液5 μ L，加入15 μ L Sl核酸酶混合液， 于37°C温育30min进行再次消解；再加入1 μ L Sl核酸酶停止液，70°C灭活15min ；得到分子信标PCR的模板；(5)以上述模板进行分子信标荧光定量PCR扩增，分子信标PCR循环40次后在72°C 延伸5min，得加入邻苯二甲酸酯浓度与起始模板拷贝数的回归方程；其中，引物碱基序列为上游引物 Rl :5' CAGGTC AGAGTGACC TGC TTC CTC GCT CAC TG 3'；下游引物 R2 5' GTCCAG TCT CAC TGG ACA GGC AAC TAT GGA TG 3'，分子信标探针的序列为 5' FAM-CTTGG CAAGCAGCAGATTACGCCCAAG-DABCYL 3'；(6)根据结合DNA标准曲线进行线性回归分析，得邻苯二甲酸酯浓度与Ct值关系，测定样品Ct值计算得邻苯二甲酸酯浓度。
2.根据权利要求1所述的一种分子信标荧光定量PCR检测邻苯二甲酸酯的方法，其特征在于所述步骤(1)中的KCl溶液浓度为0. 15 0. 2mol/L。
3.根据权利要求1所述的一种分子信标荧光定量PCR检测邻苯二甲酸酯的方法，其特征在于所述步骤(2)中的PCR扩增引物碱基序列为上游引物Fl 5' CAG GTC AGA GTG ACC TGC TTC CTC GCT CAC TG 3'，下游引物 F2 5' GTC CAG TCT CAC TGG ACA GGC AAC TAT GGA TG 3' ο
4.根据权利要求1所述的一种分子信标荧光定量PCR检测邻苯二甲酸酯的方法，其特征在于所述步骤O)中的琼脂糖凝胶质量百分比浓度为1%。
5.根据权利要求1所述的一种分子信标荧光定量PCR检测邻苯二甲酸酯的方法，其特征在于所述步骤中的Sl核酸酶停止液含0. 3mol/L的1Tris碱和1. 35mol/L的EDTA。
6.根据权利要求1所述的一种分子信标荧光定量PCR检测邻苯二甲酸酯的方法，其特征在于所述步骤(5)中的分子信标荧光定量PCR扩增体系为每50μ1体系中包括含 25ymol/L MgCl2 的反应缓冲液 5 μ L、1. 25mmol/L dNTP 4 μ L、50 μ mol/L 上下游引物各 0. 2 μ L、TaqDNA聚合酶0. 3 μ L、探针0. 3 μ L、模板5 μ L和灭菌双蒸水35. 8 μ L，TaqDNA聚合酶浓度为3U/yl。
7.根据权利要求1所述的一种分子信标荧光定量PCR检测邻苯二甲酸酯的方法，其特征在于所述步骤(5)中的分子信标PCR循环步骤为94°C预变性5min，94°C变性30s，55°C 退火 30s，72°C延伸 Imin0
全文摘要
本发明涉及一种分子信标荧光定量PCR检测邻苯二甲酸酯的方法，包括将从鲤鱼肝脏中提取含有受体的细胞溶质与不同浓度的邻苯二甲酸酯结合形成复合物后，再与用特异性引物合成的结合DNA结合形成配体-受体-DNA复合物，用核酸外切酶III和S1核酸酶消解。酶切后的产物作为模板，进行分子信标荧光定量PCR扩增，得到加入邻苯二甲酸酯浓度与起始模板拷贝数的回归方程，结合定量DNA标准曲线，经线性回归分析，得到邻苯二甲酸酯浓度与Ct值关系，可进行不同浓度邻苯二甲酸酯的检测。本发明具有灵敏度高，检出限低，特异性强的特点，可用于快速检测大批量样本中的邻苯二甲酸酯的含量，具有良好的应用前景。
文档编号C12Q1/68GK102230007SQ20111015657
公开日2011年11月2日 申请日期2011年6月10日 优先权日2011年6月10日
发明者李颢, 白舟, 谢佳, 赵晓祥, 邵姗珊 申请人:东华大学