专利名称：Str分型标准物质的制作方法
技术领域：
本发明涉及法医DNA检验分析领域中一种STR分型标准物质。
背景技术：
短串联重复序列(short tandem repeat, STR)又称为简单重复序列(simple sequence repeats, SSRs)，是人类基因组中分布较为广泛的一类遗传标记，其核心序列一般由2 6个碱基组成，核心序列的重复单位数目不同导致同一基因座中存在不同的等位基因。STR序列绝大多数分布于基因组非编码区，核心重复序列呈串联排列，扩增片段一般在400bp以下，目前在法医个人识别及亲子鉴定中得到了广泛应用。随着法医DNA检验分析技术的发展，其检验技术经历了限制性片段长度多态性 (RFLP)、短串联重复序列(STR)和单核苷酸多态性(SNP)等三个主要阶段。与此同时，检验过程中所用到的法医DNA标准物质也在不断发展。法医DNA标准物质不仅可以用来进行仪器的检验和校准、评价DNA检验结果的准确性和有效性、研究新的DNA检验方法，而且在实验室认可以及实验技术人员的培训及能力考核中也发挥着重要作用。美国国家标准与技术研究所(NationalInstitute of Standards and Technology,NIST)作为美国的商业部门，负责开发国家及国际标准物质。在NIST提供的标准物质中，有多种标准物质用于法医DNA的分型检测。NIST在1992年即推出了基于RFLP 分型技术的SRM2390，以后随着检验技术的发展，NIST又于1995年推出了基于VNTR分型的 SRM2391。自此以后，法医DNA检验技术的发展突飞猛进，尤其是STR基因座广泛应用于个体识别中，能够实现数字化记录检验结果，检验灵敏度大大提高。另外结合利用用复合扩增技术对基因座进行扩增，大大节省了实验时间，提高了个体识别率，因而STR技术迅速取代原来的VNTR技术，成为法医DNA检验中最重要的技术手段。与此同时，针对STR技术的法医DNA标准物质也成为研究重点，原来的SRM2391只有四个STR(TH01，F13A01，vWA和FES/ FPS)基因座的信息，这远远不能满足法医DNA检中对STR基因座的信息要求，法医DNA检验要求SRM2391应包括所提供的全部DNA样本的STR信息，这些STR信息至少应包括FBI实验室CODIS中的13个核心基因座。1998年6月NIST对SRM2391各个组分的25个基因座分型信息重新进行了分型检测，基因座包括FBI实验室CODIS中的13个核心基因座以及其它8个STR基因座，分别为 CSF1P0、D2S1338、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D19S433、 D21S11、F13A01、F13B、FES/FPS、FGA、LPL、Penta D、Penta Ε、THOl、TPOX, vWA、HLA-DQAU PolyMarker、DlS80和Amelogenin基因座。经过分型检测之后，NIST发布了 SRM2391的STR 基因分型值，新推出了针对STR检测的DNA标准物质SRM2391b，SRM2391b包括SRM2391的细胞组分和基因组DNA组分，而去除了扩增产物、D1S80等位基因分型混合物和DNA Marker。 只含有点样于直径6mm滤纸上的9947A和9948细胞，以及分别从9947A和9948两种细胞系和其它八个个体所提取的基因组DNA。目前在STR分型检验过程中，SRM2391b使用最为频繁。在日常法医DNA检验过程中，一般使用9947A或9948的基因组DNA作为阳性对照来进行质量控制，每次扩增检测结果可以首先参考阳性对照检测结果，以此判断检测过程和结果分析是否准确可靠。在实验室认可以及实验室技术人员能力考核过程中也大量使用该标准物质中的组分进行操作考核，这些应用使SRM2391b成为目前最为常用的法医DNA检验标准物质之一。同时，法医DNA分型标准物质的研发是DNA检验标准化与规范化过程中必不可少的环节，美国在法医DNA标准物质的研究方面保持国际领先，其发展是随着DNA检测技术和检验方法的不断创新而不断深入的，NIST提供的法医DNA标准物质用于法医各种分析技术的质量控制，例如线粒体DNA检测所用的SRM2392和SRM2392-I、用于Y染色体DNA分型所用的SRM2395等。然而，对于我国法医学领域常使用9947A和9948基因组DNA作为标准物质，然而上述两种基因组皆源自特定匿名供体的细胞所建立细胞系，通过后续的基因组DNA 提取及定量，最后完成定值并作为标准物质而使用的。上述标准物质具有一些不足之处，一是基因型为自然人所具有；二是需进行细胞系的建立，获取难度大，工作量大，程序复杂，成本高。本发明所提供一种人工合成的标准物质，基因型组合不一定为自然人所具有，可按照一定的原则设计出特有的基因型组合，具有独特的基因组合，可用作多种商业试剂盒所使用的标准物质。
发明内容
本发明的目的在于提供一种作为STR分型标准物质的DNA混合物。上述DNA混合物包括如下1) -31)的31个DNA片段1)核苷酸序列至少为序列表中序列1的第271-318位所示的DNA片段、2)核苷酸序列至少为序列表中序列2第190-261所示的DNA片段、3)核苷酸序列至少为序列表中序列3第190-265所示的DNA片段、4)核苷酸序列至少为序列表中序列4第65-1 所示的 DNA片段、5)核苷酸序列至少为序列表中序列5第65-132所示的DNA片段、6)核苷酸序列至少为序列表中序列6第96-139所示的DNA片段、7)核苷酸序列至少为序列表中序列7第 44-103所示的DNA片段、8)核苷酸序列至少为序列表中序列8第44-115所示的DNA片段、 9)核苷酸序列至少为序列表中序列9第216-255所示的DNA片段、10)核苷酸序列至少为序列表中序列10第196-259所示的DNA片段、11)核苷酸序列至少为序列表中序列11第 105-144所示的DNA片段、12)核苷酸序列至少为序列表中序列12第105-148所示的DNA 片段、13)核苷酸序列至少为序列表中序列13第232-275所示的DNA片段、14)核苷酸序列至少为序列表中序列14第232-279所示的DNA片段、15)核苷酸序列至少为序列表中序列 15第230-285所示的DNA片段、16)核苷酸序列至少为序列表中序列16第230-281所示的 DNA片段、17)核苷酸序列至少为序列表中序列17第89-140所示的DNA片段、18)核苷酸序列至少为序列表中序列18第89-144所示的DNA片段、19)核苷酸序列至少为序列表中序列19第74-208所示的DNA片段、20)核苷酸序列至少为序列表中序列20第240-311所示的DNA片段、21)核苷酸序列至少为序列表中序列21第240-323所示的DNA片段、22)核苷酸序列至少为序列表中序列22第91-155所示的DNA片段、23)核苷酸序列至少为序列表中序列23第91-135所示的DNA片段、24)核苷酸序列至少为序列表中序列M第321-380所示的DNA片段、25)核苷酸序列至少为序列表中序列25第321-410所示的DNA片段、26)核苷酸序列至少为列表中序列26第170-197所示的DNA片段、27)核苷酸序列至少为序列表中序列27第170-201所示的DNA片段、28)核苷酸序列至少为序列表中序列观第143-214 所示的DNA片段、29)核苷酸序列至少为序列表中序列四第143-198所示的DNA片段、30) 核苷酸序列至少为序列表中序列30第沈3-294所示的DNA片段和31)核苷酸序列至少为序列表中序列31第22-191所示的DNA片段。进一步讲，上述DNA混合物是由所述1)-31)的31个DNA片段组成。具体地讲，所述1)DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列1所示、所述2)DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列2的所示、所述3)DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列3 所示、所述4) DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列4所示、所述5) DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列5所示、所述6) DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列6所示、所述7)DNA 片段的核苷酸序列如序列表中序列7所示、所述8) DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列8 所示、所述9)DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列9所示、所述10)DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列10所示、所述11)DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列11所示、所述 12)DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列12所示、所述13)DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列13所示、所述14) DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列14所示、所述15) DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列15所示、所述16)DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列 16所示、所述17)DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列17所示、所述18)DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列18所示、所述19)DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列19所示、 所述20) DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列20所示、所述21) DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列21所示、所述22)DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列22所示、所述23) DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列23所示、所述M) DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列M所示、所述25) DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列25所示、所述^ODNA片段的核苷酸序列如序列表中序列26所示、所述27) DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列27所示、所述片段的核苷酸序列如序列表中序列观所示、所述片段的核苷酸序列如序列表中序列四所示、所述30)DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列30所示、所述 31)DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列31所示。所述1) DNA 片段、2) DNA 片段、3) DNA 片段、4) DNA 片段、5) DNA 片段、6) DNA 片段、7) DNA 片段、8) DNA 片段、9) DNA 片段、10) DNA 片段、11) DNA 片段、1 DNA 片段、1 DNA 片段、14) DNA 片段、1 DNA 片段、16) DNA 片段、17) DNA 片段、1 DNA 片段、1 DNA 片段、20) DNA 片段、 21) DNA 片段、22) DNA 片段、23) DNA 片段、24) DNA 片段、25) DNA 片段、26) DNA 片段、27) DNA 片段、28) DNA片段、29) DNA片段、30) DNA片段和31) DNA片段的摩尔比是(1.8-2. 2) (0.8-1 .2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (1.8—2 2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (1.8—2· 2) (1.8—2· 2)(0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (1.8-2.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0 8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (1.8-2.2) (1.8-2.2)；优选摩尔比是 2:1:1:1:1:2:1:1:2:2:1:1:1:1:1:1:1:1:2:1:1:1:1:1:1:1 1 1 1 2 2。本发明的另一目的在于提供一种重组质粒混合物。本发明提供的重组质粒混合物通过如下方法制备将上述的1)-31)的31个DNA片段分别插入到31个载体中，得到分别含有1)_31)的31个DNA片段的31个重组载体；将所述31个重组载体混合，得到重组质粒混合物。分别含有1)-31)的31个DNA片段的31个重组载体的摩尔比为(1.8-2.2) (0. 8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) ((1.8-2.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (1.8-2.2) (1.8-2.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (1.8-2 2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2)(0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (1. 8-2. 2) (1. 8-2. 2)；优选摩尔比是2 1 1 1 1 2 1 1 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 1 1 1 1 1 1:1:1:1:2:2。上述31个载体可以是克隆载体。进一步可以是相同的克隆载体，也可以是不同的克隆载体。这些载体具体可以是T载体。上述的DNA混合物或上述的重组质粒混合物在STR分型扩增中作为标准物质的应用也属于本发明的保护范围。上述STR分型扩增的体系中，每IOul体系中，上述的1)-31)的31个DNA片段的摩尔数是 1. 01Xl(T9pmol、0. 505Xl(T9pmol、0. 505Xl(T9pmol、0. 505Xl(T9pmol、
0.505X 10_9pmol>l· 01 X 10_9pmol >0. 505 X 10力pmol、0. 505 X K^pmol、1. 01 X 10力pmo 1、
1.OlX 10_9pmol>0. 505X K^pmol、0. 505X 10力pmol、0. 505X K^pmol、0. 505X 10_9pmol> 0. 505X 10_9pmol>0. 505X 10_9pmol>0. 505X 10力pmol、0. 505X K^pmol、1. OlX 10_9pmol> 0. 505Xl(T9pmol、0. 505X 10_9pmol>0. 505X K^pmol、0. 505X K^pmol、0. 505X 10_9pmol>
0.505Xl(T9pmol、0. 505X 10_9pmol>0. 505X K^pmol、0. 505X K^pmol、0. 505X 10_9pmol>
1.01Xl(T9pmol、l. 01Xl(T9pmol。1上述STR分型扩增的体系中，每IOul体系中，上述的分别含有1)-31)的31个 DNA 片段的 31 个重组载体的摩尔数是 1. 01 X 10_9pmol>0. 505X l(T9pmol、0. 505X l(T9pmol、
0.505X10_9pmol>0. 505X K^pmol、1· 01 X 10力pmol、0· 505X K^pmol、0· 505X 10_9pmol>
1.OlX 10_9pmol>l. 01 X 10_9pmol>0. 505 X 10_9pmol >0. 505 X 10力pmol、0. 505 X 10力pmol、
0.505Xl(T9pmol、0. 505X 10_9pmol>0. 505X K^pmol、0. 505X K^pmol、0. 505X 10_9pmol>
1.OlX 10_9pmol>0. 505X K^pmol、0. 505X 10力pmol、0. 505X K^pmol、0. 505X 10_9pmol> 0. 505Xl(T9pmol、0. 505X 10_9pmol>0. 505X K^pmol、0. 505X K^pmol、0. 505X 10_9pmol> 0. 505Xl(T9pmol、l. 01 X l(T9pmol、1. 01Xl(T9pmol。本发明围绕目前法医分子遗传学中业已发现的STR基因座位点，调查研究中国人群在上述位点中存在的全部等位基因，并利用生物统计技术研究每个等位基因的基因频率分布。在此基础上综合利用分子遗传学、分子生物学、细胞生物学、基因工程等实验技术，首次研发建立等位基因DNA信息库，包含STR基因座位点全部等位基因DNA片段，进而建立我国自主研发的法医DNA标准参照物体系，形成特有的人工合成的STR标准物质。
图1为TyperTM15荧光复合扩增试剂盒的STR分型图谱。图2为Identifilier 试剂盒的STR分型图谱。图3为PowerPlexl6扩增试剂盒STR分型图谱。图4为Sinofiler 的STR分型图谱。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。对现有的STR基因座进行分析研究，首先选择FBI实验室CODIS中的13个核心基因座以及目前商业化的美国ABI公司的AmpFISTR Identifiler 、Promega公司的 PowerPlexs 16以及公安部物证鉴定中心研制的DNATyperTM15商业化试剂盒所包含的其它 STR 基因座，这些基因座包括 CSF1P0、FGA、THOl、TPOX, vWA、D3S1358、D5S818、D7S820、 D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、D2S1338、D19S433、Penta D、Penta Ε、 D6S1043、Amel。其次还可选择其它业已发现但尚未包含在上述试剂盒中的STR基因座位点，例如 D19S253、D12S391、D1S1612、D9S302、D18S535、D15S816 等。总之，标准物质含19 个基因座=CSFlPO, D2S1138、D3S1358、D5S818、D6S1043、 D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D19S433、D21S11、FGA、Penta D、Penta E、 THOU VffA, TPOX 禾口 AmeL实施例1、19个基因座等位基因的获得一、基因座CSFlPO等位基因(N = 12 (TAGA) 12)的获得1、引物的设计在确定CSFlPO基因座位侧翼序列的基础上，引物设计如下forward primer TGGCAGAAGCCGGAGGTAA ；Reverse primer CCGATGAGCTGCTGCCTTG2、PCR 扩增用上述引物对，以提取的人唾液的基因组DNA为模板进行PCR扩增。其中PCR体系及反应参数如下a. PCR 扩增体系(10 μ L)
5χ反应液(含dNTP、Mg2+)2.0nL
正反向引物(ΙΟμΜ)0.2*2=0.4.nL
TaqDNA 聚合酶(5u/nL)0.2nL
DNA 模板(0.5ng/nL)l+OpL
去离子水_6.4nL_
总反应体积10.0^b. PCR热循环参数950C Ilmin ；94°C Imin, 60 °C Imin, 72°C lmin, 30cycles ；60°C 60min ；25°C Hold。 (其中退火温度依据不同基因座的Tm值而有所变化。)经过电泳、回收、纯化后的PCR产物片段直接插入载体T载体(购自!Iomega公司， 名称为pGEM-T Vector货号为A3600)，重组后的克隆载体转入大肠杆菌DH5 α，经蓝白斑筛选阳性克隆，并进行质粒DNA的提取，经酶切鉴定后，进行PCR片段的测序。测序结果表明扩增产物的核苷酸序列如序列表中序列1所示，其中短串联重复序列(STR)的核心序列是(TAGA)12，重复次数N为12，位于序列表中序列1的第271-318位。3、根据测序结果，将连接正确的重组克隆载体(命名为V-CSF1)保存备用。二、基因座 D2S1138 等位基因(N = 18 (TGCC) 7 (TTCC) (TGCC) (TTCC)9 ；N =
9Forward primer :ATATTGGGGAGCTGTTTCAGAReverse primer GTTCATTTCTTCCTAGCACTTAGAAC按照步骤一中的方法，用本步骤引物对，从提取的人唾液的基因组DNA中进行PCR 扩增，结果得到两种PCR产物，经跑胶、回收、纯化后的PCR产物片段分别插入pGEM-T，重组后的克隆载体转入大肠杆菌DH5 α，经蓝白斑筛选阳性克隆，并进行质粒DNA的提取，经酶切鉴定后，进行PCR片段的测序。测序结果表明第一种扩增产物的核苷酸序列如序列表中序列2所示，其中短串联重复序列(STR)的核心序列是(TGCC)7(TTCC) (TGCC) (TTCC)9，重复次数N为18，位于序列表中序列2的第190-261位。第二种扩增产物的核苷酸序列如序列表中序列3所示，其中短串联重复序列 (STR)的核心序列是(TGCC)7(TTCC) (TGCC) (TTCC)ltl，重复次数N为19，位于序列表中序列3 的第190-265位。将含有第一种扩增产物的重组克隆载体(命名为V-1338-1)和含有第二种扩增产物的重组克隆载体(命名为V-1338-2)保存备用。三、基因座D3S1358 等位基因(N = 17 (AGAT) 13 (AGAC) 2 (AGAT) 2 ；N = 15 (AGAT) n (AGAC) 2 (AGAT) 2)的获得Forward Primer TGTGTATTCCCTGTGCCTTTReverse Primer CCCAGGAGTTTGAGGCTGTA按照步骤一中的方法，用本步骤引物对，从提取的人唾液的基因组DNA中进行PCR 扩增，结果得到两种PCR产物，经跑胶、回收、纯化后的PCR产物片段分别插入pGEM-T，重组后的克隆载体转入大肠杆菌DH5 α，经蓝白斑筛选阳性克隆，并进行质粒DNA的提取，经酶切鉴定后，进行PCR片段的测序。测序结果表明第一种扩增产物的核苷酸序列如序列表中序列4所示，其中短串联重复序列(STR)的核心序列是(AGAT)13 (AGAC)2 (AGAT)2，重复次数N为17，位于序列表中序列4的第65-1 位。第二种扩增产物的核苷酸序列如序列表中序列5所示，其中短串联重复序列 (STR)的核心序列是(AGAT) n (AGAC)2 (AGAT)2，重复次数N为15，位于序列表中序列5的第 65-132 位。将含有第一种扩增产物的重组克隆载体(命名为V-1358-1)和含有第二种扩增产物的重组克隆载体(命名为V-1358-2)保存备用。四、基因座D5S818等位基因(N=Il (AGAT)11)的获得Forward Primer TGTCCCAGATAATCTGTACReverse Primer :GGAATGCTTTAGTGCTTTT按照步骤一中的方法，用本步骤引物对，从提取的人唾液的基因组DNA中进行PCR 扩增，经跑胶、回收、纯化后的PCR产物片段插入pGEM-T，重组后的克隆载体转入大肠杆菌 DH5 α，经蓝白斑筛选阳性克隆，并进行质粒DNA的提取，经酶切鉴定后，进行PCR片段的测序。测序结果表明扩增产物的核苷酸序列如序列表中序列6所示，其中短串联重复序列(STR)的核心序列是(AGAT)11，重复次数N为11，位于序列表中序列6的第96-139位。将含有扩增产物的重组克隆载体(命名为V-818)保存备用。五、基因座D6S1043 等位基因(N = 15 (AGAT) 15 ；N = 18 (AGAT) 18)的获得Forward Primer GCAATAGTGTGCAAGGATGGReverse Primer TTGTATGAGCCACTTCCCAT按照步骤一中的方法，用本步骤引物对，从提取的人唾液的基因组DNA中进行PCR 扩增，结果得到两种PCR产物，经跑胶、回收、纯化后的PCR产物片段分别插入pGEM-T，重组后的克隆载体转入大肠杆菌DH5 α，经蓝白斑筛选阳性克隆，并进行质粒DNA的提取，经酶切鉴定后，进行PCR片段的测序。测序结果表明第一种扩增产物的核苷酸序列如序列表中序列7所示，其中短串联重复序列(STR)的核心序列是(AGAT)15，重复次数N为15，位于序列表中序列7的第44-103 位。第二种扩增产物的核苷酸序列如序列表中序列8所示，其中短串联重复序列 (STR)的核心序列是(AGAT)18，重复次数N为18，位于序列表中序列8的第44-115位。将含有第一种扩增产物的重组克隆载体(命名为V-1043-1)和含有第二种扩增产物的重组克隆载体(命名为V-1043-幻保存备用。六、基因座D7S820等位基因(N = IO(GATA)ltl)的获得Forward Primer :ACTGCAACCTCCGCTTCTTReverse Primer GCATCAGTTTTCACACCAGAA按照步骤一中的方法，用本步骤引物对，从提取的人唾液的基因组DNA中进行PCR 扩增，经跑胶、回收、纯化后的PCR产物片段插入pGEM-T，重组后的克隆载体转入大肠杆菌 DH5 α，经蓝白斑筛选阳性克隆，并进行质粒DNA的提取，经酶切鉴定后，进行PCR片段的测序。测序结果表明扩增产物的核苷酸序列如序列表中序列9所示，其中短串联重复序列(STR)的核心序列是(GATA)ltl，重复次数N为10，位于序列表中序列9的第216-255位。将含有扩增产物的重组克隆载体(命名为V-820)保存备用。七、基因座D8S1179等位基因(N = 16 (TCTA)16)的获得Forward Primer TTAGGTAAAGCTGAGTCTGAAGTAAGReverse Primer CGTATGTATTCTTGTTTCCAGTTTCT按照步骤一中的方法，用本步骤引物对，从提取的人唾液的基因组DNA中进行PCR 扩增，经跑胶、回收、纯化后的PCR产物片段插入pGEM-T，重组后的克隆载体转入大肠杆菌 DH5 α，经蓝白斑筛选阳性克隆，并进行质粒DNA的提取，经酶切鉴定后，进行PCR片段的测序。测序结果表明扩增产物的核苷酸序列如序列表中序列10所示，其中短串联重复序列(STR)的核心序列是(TCTA)16，重复次数N为16，位于序列表中序列10的第196-259 位。将含有扩增产物的重组克隆载体(命名为V-1179)保存备用。八、基因座D13S317 等位基因(N = IO(TATC) 10 ；N = Il(TATC)11)的获得Forward Primer :ATCACAGAAGTCTGGGATGTGGAGGA
Reverse Primer :ATATTCAGAGAGCTTGAATTGTTGG按照步骤一中的方法，用本步骤引物对，从提取的人唾液的基因组DNA中进行PCR 扩增，结果得到两种PCR产物，经跑胶、回收、纯化后的PCR产物片段分别插入pGEM-T，重组后的克隆载体转入大肠杆菌DH5 α，经蓝白斑筛选阳性克隆，并进行质粒DNA的提取，经酶切鉴定后，进行PCR片段的测序。测序结果表明第一种扩增产物的核苷酸序列如序列表中序列11所示，其中短串联重复序列(STR)的核心序列是(TATC)ltl，重复次数N为10，位于序列表中序列11的第 105-144 位。第二种扩增产物的核苷酸序列如序列表中序列12所示，其中短串联重复序列 (STR)的核心序列是(TATC)11,重复次数N为11，位于序列表中序列12的第105-148位。将含有第一种扩增产物的重组克隆载体(命名为V-317-1)和含有第二种扩增产物的重组克隆载体(命名为V-317-幻保存备用。九、基因座D16S539 等位基因(N = 11 (GATA) η ；N = 12 (GATA) 12 的获得Forward Primer :ACTCTCAGTCCTGCCGAGGTReverse Primer CAAGCGAAAGTGATGCCATA按照步骤一中的方法，用本步骤引物对，从提取的人唾液的基因组DNA中进行PCR 扩增，结果得到两种PCR产物，经跑胶、回收、纯化后的PCR产物片段分别插入pGEM-T，重组后的克隆载体转入大肠杆菌DH5 α，经蓝白斑筛选阳性克隆，并进行质粒DNA的提取，经酶切鉴定后，进行PCR片段的测序。测序结果表明第一种扩增产物的核苷酸序列如序列表中序列13所示，其中短串联重复序列(STR)的核心序列是(GATA)11，重复次数N为11，位于序列表中序列13的第 232-275 位。第二种扩增产物的核苷酸序列如序列表中序列14所示，其中短串联重复序列 (STR)的核心序列是(GATA)12，重复次数N为12，位于序列表中序列14的第232-279位。将含有第一种扩增产物的重组克隆载体(命名为v-539-l)和含有第二种扩增产物的重组克隆载体(命名为ν-539-2)保存备用。十、基因座D18S51 等位基因(N = 14 (AGAA) 14 ；N = 13 (AGAA) 13)的获得Forward Primer GTGGATCAATTGAGCTCAGGAReverse Primer CAGAAGAAATCCTTGTGCGTA按照步骤一中的方法，用本步骤引物对，从提取的人唾液的基因组DNA中进行PCR 扩增，结果得到两种PCR产物，经跑胶、回收、纯化后的PCR产物片段分别插入pGEM-T，重组后的克隆载体转入大肠杆菌DH5 α，经蓝白斑筛选阳性克隆，并进行质粒DNA的提取，经酶切鉴定后，进行PCR片段的测序。测序结果表明第一种扩增产物的核苷酸序列如序列表中序列15所示，其中短串联重复序列(STR)的核心序列是(AGAA)14，重复次数N为14，位于序列表中序列15的第 230-285 位。第二种扩增产物的核苷酸序列如序列表中序列16所示，其中短串联重复序列 (STR)的核心序列是(AGAA)13，重复次数N为13，位于序列表中序列16的第230-281位。将含有第一种扩增产物的重组克隆载体(命名为V-51-1)和含有第二种扩增产物的重组克隆载体(命名为V-51-幻保存备用。十一、基因座 D19S433 等位基因(N = 13 (AAGG)13 ；N = H(AAGG)14)的获得Forward Primer GAGGTTGAGGCTGCAAAAAGReverse Primer GATAACCAGACCCCAGAGCA按照步骤一中的方法，用本步骤引物对，从提取的人唾液的基因组DNA中进行PCR 扩增，结果得到两种PCR产物，经跑胶、回收、纯化后的PCR产物片段分别插入pGEM-T，重组后的克隆载体转入大肠杆菌DH5 α，经蓝白斑筛选阳性克隆，并进行质粒DNA的提取，经酶切鉴定后，进行PCR片段的测序。测序结果表明第一种扩增产物的核苷酸序列如序列表中序列17所示，其中短串联重复序列(STR)的核心序列是(AAGG)13，重复次数N为13，位于序列表中序列17的第 89-140 位。第二种扩增产物的核苷酸序列如序列表中序列18所示，其中短串联重复序列 (STR)的核心序列是(AAGG)143，重复次数N为14，位于序列表中序列18的第89-144位。将含有第一种扩增产物的重组克隆载体(命名为V-433-1)和含有第二种扩增产物的重组克隆载体(命名为V-433-幻保存备用。十二、基因座D21S11等位基因(N = 29 (TCTA) 4 (TCTG) 6 (TCTA) 3TA (TCTA) 3TCA (TCTA) 2TCCATA (TCTA) n)的获得Forward Primer :TTGTAGATGGTCTGTTATGGGACTReverse Primer :AGATGTTGTATTAGTCAATGTTCTCCA按照步骤一中的方法，用本步骤引物对，从提取的人唾液的基因组DNA中进行PCR 扩增，经跑胶、回收、纯化后的PCR产物片段插入pGEM-T，重组后的克隆载体转入大肠杆菌 DH5 α，经蓝白斑筛选阳性克隆，并进行质粒DNA的提取，经酶切鉴定后，进行PCR片段的测序。测序结果表明扩增产物的核苷酸序列如序列表中序列19所示，其中短串联重复序列(STR)的核心序列是(TCTA)4(TCTG)6(TCTA)3TA(TCTA)3TCA(TCTA)2TCCATA(TCTA)11，重复次数N为四，位于序列表中序列19的第74-208位。将含有扩增产物的重组克隆载体(命名为V-11)保存备用。十三、基因座FGA 等位基因(N = 21 (TTTC)3TTTT TTCT(CTTT) 13CTCC(TTCC)2 ；N = 18 (TTTC)3TTTT TTCT (CTTT) 10CTCC (TTCC) 2)的获得Forward Primer :ATAAAATAATTGAAATGCAATCAAACCReverse Primer :GACCACAGCCACATACTTACCT按照步骤一中的方法，用本步骤引物对，从提取的人唾液的基因组DNA中进行PCR 扩增，结果得到两种PCR产物，经跑胶、回收、纯化后的PCR产物片段分别插入pGEM-T，重组后的克隆载体转入大肠杆菌DH5 α，经蓝白斑筛选阳性克隆，并进行质粒DNA的提取，经酶切鉴定后，进行PCR片段的测序。测序结果表明第一种扩增产物的核苷酸序列如序列表中序列20所示，其中短串联重复序列(STR)的核心序列是(TTTC)3TTTT TTCT (CTTT)13CTCC (TTCC)2，重复次数N为21， 位于序列表中序列20的第Μ0-311位。第二种扩增产物的核苷酸序列如序列表中序列21所示，其中短串联重复序列(STR)的核心序列是(TTTC)3TTTT TTCT (CTTT)iqCTCC (TTCC)2，重复次数N为18，位于序列表中序列21的第240-323位。将含有第一种扩增产物的重组克隆载体(命名为V-FGA-1)和含有第二种扩增产物的重组克隆载体(命名为V-FGA-2)保存备用。十四、基因座Penta D 等位基因(N = 9 (AAAGA)9 ；N = 13 (AAAGA) 13)的获得Forward Primer :GAAGGTCGAAGCTGA AGTGReverse Primer :AGAATTCTTTAATCTGGACACAAG按照步骤一中的方法，用本步骤引物对，从提取的人唾液的基因组DNA中进行PCR 扩增，结果得到两种PCR产物，经跑胶、回收、纯化后的PCR产物片段分别插入pGEM-T，重组后的克隆载体转入大肠杆菌DH5 α，经蓝白斑筛选阳性克隆，并进行质粒DNA的提取，经酶切鉴定后，进行PCR片段的测序。测序结果表明第一种扩增产物的核苷酸序列如序列表中序列22所示，其中短串联重复序列(STR)的核心序列是(AAAGA)9，重复次数N为9，位于序列表中序列22的第 91-155 位。第二种扩增产物的核苷酸序列如序列表中序列23所示，其中短串联重复序列 (STR)的核心序列是(AAAGA) 13，重复次数N为13，位于序列表中序列23的第91-135位。将含有第一种扩增产物的重组克隆载体(命名为V-PentaD-I)和含有第二种扩增产物的重组克隆载体(命名为V-PentaD-幻保存备用。十五、基因座Penta E 等位基因(N = 12 (AAAGA) 12 ；N = 18 (AAAGA) 18)的获得Forward Primer TTACCAACATGAAAGGGTACCAATAReverse Primer :TGGGTTATTAATTGAGAAAACTCCTTACAATTT按照步骤一中的方法，用本步骤引物对，从提取的人唾液的基因组DNA中进行PCR 扩增，结果得到两种PCR产物，经跑胶、回收、纯化后的PCR产物片段分别插入pGEM-T，重组后的克隆载体转入大肠杆菌DH5 α，经蓝白斑筛选阳性克隆，并进行质粒DNA的提取，经酶切鉴定后，进行PCR片段的测序。测序结果表明第一种扩增产物的核苷酸序列如序列表中序列M所示，其中短串联重复序列(STR)的核心序列是(AAAGA)12，重复次数N为12，位于序列表中序列M的第 321-380 位。第二种扩增产物的核苷酸序列如序列表中序列25所示，其中短串联重复序列 (STR)的核心序列是(AAAGA)18，重复次数N为18，位于序列表中序列25的第321-410位。将含有第一种扩增产物的重组克隆载体(命名为V-PentaE-I)和含有第二种扩增产物的重组克隆载体(命名为V-PentaE-幻保存备用。十六、基因座THOl等位基因(N = 9 (CATT)9 ；N = 7 (CATT)7)的获得Forward Primer CTAGTCAGCACCCCAACCAGReverse Primer CAGGGAGCCCAAGGTTCT按照步骤一中的方法，用本步骤引物对，从提取的人唾液的基因组DNA中进行PCR 扩增，结果得到两种PCR产物，经跑胶、回收、纯化后的PCR产物片段分别插入pGEM-T，重组后的克隆载体转入大肠杆菌DH5 α，经蓝白斑筛选阳性克隆，并进行质粒DNA的提取，经酶切鉴定后，进行PCR片段的测序。
14
测序结果表明第一种扩增产物的核苷酸序列如序列表中序列洲所示，其中短串联重复序列(STR)的核心序列是(CATT)9，重复次数N为9，位于序列表中序列沈的第 170-197 位。第二种扩增产物的核苷酸序列如序列表中序列27所示，其中短串联重复序列 (STR)的核心序列是(CATT)7，重复次数N为7，位于序列表中序列27的第170-201位。将含有第一种扩增产物的重组克隆载体(命名为V-ThOl-I)和含有第二种扩增产物的重组克隆载体(命名为v-Thoi-幻保存备用。十七、基因座VWA 等位基因(N = 14TCTA (TCTG)4 (TCTA) 9 ；N = 18TCTA (TCTG) 4 (TCTA) 13)的获得Forward Primer TGTGAACTCCTCAGACTGATCCReverse Primer CAGATGATAAATACATAGGATGGATG按照步骤一中的方法，用本步骤引物对，从提取的人唾液的基因组DNA中进行PCR 扩增，结果得到两种PCR产物，经跑胶、回收、纯化后的PCR产物片段分别插入pGEM-T，重组后的克隆载体转入大肠杆菌DH5 α，经蓝白斑筛选阳性克隆，并进行质粒DNA的提取，经酶切鉴定后，进行PCR片段的测序。测序结果表明第一种扩增产物的核苷酸序列如序列表中序列28所示，其中短串联重复序列(STR)的核心序列是TCTA (TCTG)4 (TCTA)9，重复次数N为14，位于序列表中序列 28 的第 143-214 位。第二种扩增产物的核苷酸序列如序列表中序列四所示，其中短串联重复序列 (STR)的核心序列是TCTA(TCTG)4(TCTA)13，重复次数N为18，位于序列表中序列29的第 143-198 位。将含有第一种扩增产物的重组克隆载体(命名为V-Vwa-Ι)和含有第二种扩增产物的重组克隆载体(命名为为V-Vwa-2))保存备用。十八、基因座TPOX等位基因(N = 8 (GAAT)8)的获得Forward Primer :CTCATGTTCCCACTGCTGACReverse Primer :GCTCAAACGTGAGGTTGACTC按照步骤一中的方法，用本步骤引物对，从提取的人唾液的基因组DNA中进行PCR 扩增，经跑胶、回收、纯化后的PCR产物片段插入pGEM-T，重组后的克隆载体转入大肠杆菌 DH5 α，经蓝白斑筛选阳性克隆，并进行质粒DNA的提取，经酶切鉴定后，进行PCR片段的测序。测序结果表明扩增产物的核苷酸序列如序列表中序列30所示，其中短串联重复序列(STR)的核心序列是(GAAT)8，重复次数N为8，位于序列表中序列30的第沈3-四4位。将含有扩增产物的重组克隆载体(命名为V-TP0X)保存备用。十九、基因座Amel等位基因的获得Forward Primer :ACCTCATCCTGGGCACCCTGGReverse Primer :AGGCTTGAGGCCAACCATCAG按照步骤一中的方法，用本步骤引物对，从提取的人唾液的基因组DNA中进行PCR 扩增，经跑胶、回收、纯化后的PCR产物片段插入pGEM-T，重组后的克隆载体转入大肠杆菌 DH5 α，经蓝白斑筛选阳性克隆，并进行质粒DNA的提取，经酶切鉴定后，进行PCR片段的测序。测序结果表明扩增产物的核苷酸序列如序列表中序列31所示，其中第1-21位与第192-212位是引物序列。将含有扩增产物的重组克隆载体(命名为V-Amel)。实施例2、STR分型的标准物质的制备将实施例1中步骤一至步骤十九制备得到的31个重组克隆载体逐步混合，随着等位基因DNA片段的增加，由于DNA分子内部存在竞争机制，各个等位基因片段的相对平衡控制存在一定的难度，需不断调整带有不同等位基因DNA片段的重组质粒至最适比例，经反复实验最终建立多个DNA片段间的相对平衡状态，最终形成满足要求的DNA标准物质。其中31个重组克隆载体中的重组克隆载体V-CSFl 重组克隆载体V-1338-1 重组克隆载体V-1338-2 重组克隆载体V-1358-1 重组克隆载体V-1358-2 重组克隆载体V-818 重组克隆载体V-1043-1 重组克隆载体V-1043-2 重组克隆载体V-820 重组克隆载体V-1179 重组克隆载体V-317-1 重组克隆载体V-317-2 重组克隆载体V-539-1 重组克隆载体V-539-2 重组克隆载体V-51-1 重组克隆载体V_51_2 重组克隆载体 V-433-1 重组克隆载体V-433-2 重组克隆载体V-Il 重组克隆载体V-FGA-I 重组克隆载体V-FGA-2 重组克隆载体V-PentaD-I 重组克隆载体V-PentaD_2 重组克隆载体V-PentaE-I 重组克隆载体V-PentaE_2 重组克隆载体V-ThOl-I 重组克隆载体 V-ThO 1-2 重组克隆载体V-Vwa-I 重组克隆载体V-Vwa_2 重组克隆载体V-TPOX 重组克隆载体 V-Amel 的摩尔比为 2 :1:1:1:1:2:1:1:2:2:1:1:1:1:1:1:11 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2。标准物质实际制备过程中，上述顺序的31个重组克隆载体是分别以 1. OlX 10_9pmol>0. 505X K^pmol、0· 505X 10力pmol、0· 505X K^pmol、0· 505X 10_9pmol> 1. OlX l(TViol、0. 505 X I(TiW)I、0· 505 X K^pmol、1· 01 X 10_9pmol > 1· OlX 10_9pmol> 0. 505Xl(T9pmol、0. 505X 10_9pmol>0. 505X K^pmol、0. 505X K^pmol、0. 505X 10_9pmol> 0. 505X KTi3Pmol、0. 505X 10_9pmol>0. 505X K^pmol、1. 01 X K^pmol、0. 505X 10_9pmol> 0. 505Xl(T9pmol、0. 505X 10_9pmol>0. 505X K^pmol、0. 505X K^pmol、0. 505X 10_9pmol>
0.505X 10_9pmol>0. 505X 10_9pmol>0. 505X 10力pmol、0. 505X K^pmol、1. OlX 10_9pmol>
1.OlX 10_9pmol保存在小于IOul的TE或水中。实施例3、标准物质的验证步骤一至步骤四的扩增实验中的扩增体系均是10ul。一、Typer 15 试剂盒扩增以实施例2实际制备的标准物质作为DNA模板，采用TyperTM15荧光复合扩增试剂盒(公安部物证鉴定中心)进行按照操作说明书进行扩增。其DNA检验图谱如图1所示， 其中图谱清晰、峰型尖锐与预先设定的结果一致。二、Identifilier 试剂盒扩增以实施例2实际制备的标准物质作为DNA模板，采用Identifilier 荧光复合扩增试剂盒(美国ABI公司)进行按照操作说明书进行扩增。扩增参数设定为95°C，5min ； 940C lmin, 59°C lmin,72°C Imin ( 个循环)；60°C 60min ;4°C永久保存。其 DNA 检验图谱如图2所示，其中图谱清晰、峰型尖锐与预先设定的结果一致。三、PowerPlex16 试剂盒扩增
以实施例2实际制备的标准物质作为DNA模板，采用PowerPlex 16 荧光复合扩增试剂盒(美国Promega公司)进行按照操作说明书进行扩增。其DNA检验图谱如图3所示，其中图谱清晰、峰型尖锐与预先设定的结果一致。四、Sinofiler 试剂盒扩增以实施例2实际制备的标准物质作为DNA模板，采用Sinofiler 荧光复合扩增试剂盒(美国ABI公司)进行按照操作说明书进行扩增。其DNA检验图谱如图4所示，其中图谱清晰、峰型尖锐与预先设定的结果一致。
权利要求
1.一种作为STR分型标准物质的DNA混合物，包括如下1) -31)的31个DNA片段1)核苷酸序列至少为序列表中序列1的第271-318位所示的DNA片段、2)核苷酸序列至少为序列表中序列2第190-261所示的DNA片段、3)核苷酸序列至少为序列表中序列 3第190-265所示的DNA片段、4)核苷酸序列至少为序列表中序列4第65-1 所示的DNA 片段、5)核苷酸序列至少为序列表中序列5第65-132所示的DNA片段、6)核苷酸序列至少为序列表中序列6第96-139所示的DNA片段、7)核苷酸序列至少为序列表中序列7第 44-103所示的DNA片段、8)核苷酸序列至少为序列表中序列8第44-115所示的DNA片段、 9)核苷酸序列至少为序列表中序列9第216-255所示的DNA片段、10)核苷酸序列至少为序列表中序列10第196-259所示的DNA片段、11)核苷酸序列至少为序列表中序列11第 105-144所示的DNA片段、12)核苷酸序列至少为序列表中序列12第105-148所示的DNA 片段、13)核苷酸序列至少为序列表中序列13第232-275所示的DNA片段、14)核苷酸序列至少为序列表中序列14第232-279所示的DNA片段、15)核苷酸序列至少为序列表中序列 15第230-285所示的DNA片段、16)核苷酸序列至少为序列表中序列16第230-281所示的 DNA片段、17)核苷酸序列至少为序列表中序列17第89-140所示的DNA片段、18)核苷酸序列至少为序列表中序列18第89-144所示的DNA片段、19)核苷酸序列至少为序列表中序列19第74-208所示的DNA片段、20)核苷酸序列至少为序列表中序列20第240-311所示的DNA片段、21)核苷酸序列至少为序列表中序列21第240-323所示的DNA片段、22)核苷酸序列至少为序列表中序列22第91-155所示的DNA片段、23)核苷酸序列至少为序列表中序列23第91-135所示的DNA片段、24)核苷酸序列至少为序列表中序列M第321-380所示的DNA片段、25)核苷酸序列至少为序列表中序列25第321-410所示的DNA片段、26)核苷酸序列至少为列表中序列26第170-197所示的DNA片段、27)核苷酸序列至少为序列表中序列27第170-201所示的DNA片段、28)核苷酸序列至少为序列表中序列观第143-214 所示的DNA片段、29)核苷酸序列至少为序列表中序列四第143-198所示的DNA片段、30) 核苷酸序列至少为序列表中序列30第沈3-294所示的DNA片段和31)核苷酸序列至少为序列表中序列31第22-191所示的DNA片段。2.如权利要求1所述的DNA混合物，其特征在于它是由所述1)-31)的31个DNA片段组成。3.如权利要求1或2所述的DNA混合物，其特征在于所述1)DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列1所示、所述2)DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列2的所示、所述3)DNA 片段的核苷酸序列如序列表中序列3所示、所述4) DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列4 所示、所述5) DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列5所示、所述6) DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列6所示、所述7) DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列7所示、所述8) DNA 片段的核苷酸序列如序列表中序列8所示、所述9) DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列 9所示、所述10)DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列10所示、所述11)DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列11所示、所述12)DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列12所示、 所述13) DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列13所示、所述14) DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列14所示、所述15)DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列15所示、所述16) DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列16所示、所述17) DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列17所示、所述18) DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列18所示、所述19) DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列19所示、所述20) DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列20所示、所述21) DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列21所示、所述22) DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列22所示、所述23)DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列23所示、所述 24) DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列M所示、所述25) DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列25所示、所述沈)DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列沈所示、所述27) DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列27所示、所述片段的核苷酸序列如序列表中序列 28所示、所述片段的核苷酸序列如序列表中序列四所示、所述30) DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列30所示、所述31)DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列31所示。4.如权利要求1-3中任一所述的DNA混合物，其特征在于所述1)DNA片段、2)DNA片段、3)DNA片段、4)DNA片段、5)DNA片段、6)DNA片段、7)DNA片段、8)DNA片段、9)DNA片段、 10) DNA 片段、11) DNA 片段、1 DNA 片段、1 DNA 片段、14) DNA 片段、1 DNA 片段、16) DNA 片段、17) DNA 片段、18) DNA 片段、19) DNA 片段、20) DNA 片段、21) DNA 片段、22) DNA 片段、23) DNA 片段、24)DNA 片段、25)DNA 片段、26)DNA 片段、27)DNA 片段、28)DNA 片段、29)DNA 片段、30) DNA片段和31)DNA片段的摩尔比是(1. 8-2. 2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0 .8-1.2) (1.8-2.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (1.8—2· 2) (1.8—2· 2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (1.8-2.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2)(0.8-1.2) (1.8-2.2) (1.8-2.2)；优选摩尔比是 2 :1:1:1:1:2:1:1:2:2: 1:1:1:1:1:1:1:1:2:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:2:2。5.一种重组质粒混合物，其特征在于它是通过如下方法制备将权利要求1-4中任一所述的1)-31)的31个DNA片段分别插入到31个载体中，得到分别含有1)-31)的31个DNA片段的31个重组载体；将所述31个重组载体混合，得到重组质粒混合物。6.如权利要求5所述的重组质粒混合物，其特征在于分别含有1)-31)的31个DNA片段的 31 个重组载体的摩尔比为(1.8-2.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1 .2) ((1.8-2.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (1.8-2.2) (1.8-2.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2 )(0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (1.8-2.2) (0.8-1.2)(0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0 8-1.2) (1.8-2.2) (1.8-2.2)；优选摩尔比是2 :1:1:1:1:2:1:1:2:2:+1: 1:1:1:1:1:1:1:2:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:2:2。7.如权利要求5或6所述的重组质粒混合物，其特征在于所述载体为克隆载体，优选为T载体。8.权利要求1-4中任一所述的DNA混合物或权利要求5-7中任一所述的重组质粒混合物在STR分型扩增中作为标准物质的应用。9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述STR分型扩增的体系中，每IOul体系中，权利要求1-4中任一所述的1)-31)的31个DNA片段的摩尔数是1. 01 X l(T9pm0l、 0. 505X10_9pmol、0. 505X 10_9pmol>0. 505X 10力pmol、0· 505X K^pmol、1. OlX 10_9pmol> 0. 505Χ 10_9pmol>0. 505 X 10力pmol、1· 01 X 10力pmol、1· 01 X 10力pmol、0· 505 X 10力pmol、 0. 505Xl(T9pmol、0. 505X 10_9pmol>0. 505X K^pmol、0. 505X K^pmol、0. 505X 10_9pmol>0. 505X 10_9pmol>0. 505X K^pmol、1. 01 X 10力pmol、0· 505X K^pmol、0· 505X 10_9pmol> 0. 505X 10-9pmol>0. 505X K^pmol、0. 505X 1 (^pmol、0. 505X K^pmol、0. 505X l(T9pmol、 0. 505Xl(T9pmol、0. 505X l(T9pmol、0. 505X l(T9pmol、l. 01 X l(T9pmol、1. 01Xl(T9pmol。10.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述STR分型扩增的体系中，每IOul 体系中，权利要求5-7中任一所述的分别含有1)-31)的31个DNA片段的31个重组载体的摩尔数是 1. 01Xl(T9pmol、0. 505Xl(T9pmol、0. 505Xl(T9pmol、0. 505Xl(T9pmol、0.505X 10_9pmol>l· 01 X 10_9pmol >0. 505 X 10力pmol、0. 505 X K^pmol、1. 01 X 10力pmo 1、1.OlX 10_9pmol>0. 505X K^pmol、0. 505X 10力pmol、0. 505X K^pmol、0. 505X 10_9pmol> 0. 505X 10_9pmol>0. 505X 10_9pmol>0. 505X 10力pmol、0. 505X K^pmol、1. OlX 10_9pmol> 0. 505Xl(T9pmol、0. 505X 10_9pmol>0. 505X K^pmol、0. 505X K^pmol、0. 505X 10_9pmol>0.505Xl(T9pmol、0. 505X 10_9pmol>0. 505X K^pmol、0. 505X K^pmol、0. 505X 10_9pmol>1.01Xl(T9pmol、l. 01Xl(T9pmol。
全文摘要
本发明公开了一种STR分型标准物质。该STR分型标准物质是DNA混合物，包括核苷酸序列分别如1)-31)的31个DNA片段。本发明围绕目前法医分子遗传学中业已发现的STR基因座位点，调查研究中国人群在上述位点中存在的全部等位基因，并利用生物统计技术研究每个等位基因的基因频率分布。在此基础上综合利用分子遗传学、分子生物学、细胞生物学、基因工程等实验技术，首次研发建立等位基因DNA信息库，包含STR基因座位点全部等位基因DNA片段，进而建立我国自主研发的法医DNA标准参照物体系，形成特有的人工合成的STR标准物质。
文档编号C12N15/63GK102286476SQ20111019423
公开日2011年12月21日 申请日期2011年7月12日 优先权日2011年7月12日
发明者叶健, 赵兴春 申请人:公安部物证鉴定中心