专利名称：快速检测瓠瓜品种种子纯度方法及其试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于作物生物技术领域，尤其属于利用诊断性SSR分子标记组合快速检测瓠瓜主要品种种子纯度的方法及其试剂盒。
背景技术：
瓠瓜是我国重要的夏季瓜类蔬菜，深受人民群众喜爱。我国从事瓠瓜育种、种子生产和经营的科研院所、企业众多，每年均有新的瓠瓜新品种育成推出。当前生产上应用的瓠瓜品种种类众多，商业品种间的遗传相似性愈来愈高，同种异名、同名异种现象日益严重， 种子知识产权和质量纠纷时有发生，有必要研究开发一种能早期、全年、快速、准确鉴定瓠瓜品种真伪和纯度的方法，以服务于瓠瓜育种、种子经营和生产的需要，并切实保护育种者的合法权利。目前我国蔬菜品种包括瓠瓜种子真伪与纯度鉴定大多依靠田间表现型鉴定。但该鉴定所需时间较长(一般需50-60天时间)，并受季节的限制，而且作物的表现型易随环境条件的变化而变化，特别是对于一些形态差异较小的品种间鉴定难度更大。DNA分子标记技术在国内外已被用于鉴别不同品种之间在分子水平上的差异。由于在同一物种的各个品种DNA间存在大量的多态性标记，每一品种均存在有区别于其它品种的独特标记，即一些特异性DNA片段的组合就称为该品种的DNA遗传指纹，各品种独特的指纹片段构成该物种的DNA指纹图谱。与传统的依据表型性状鉴定相比，基于DNA水平差异的指纹图谱技术，具有可以在植株生长的任何阶段进行，鉴定快速且不受基因表达和环境条件的影响等优点。SSR分子标记是利用真核生物基因组中存在的大量微卫星重复序列设计引物，通过PCR扩增串联的重复序列，依据微卫星的重复次数在同一物种不同基因型间的差异，揭示长度多态性。SSR由于分布广、稳定性和多态率高，操作简单、重复性好、对DNA质量要求较低等，被誉为第二代分子标记的明星。SSR分子标记技术克服了 RAPD稳定性和重复性差， AFLP技术费用昂贵、操作复杂、对DNA的纯度和内切酶的质量要求很高等缺点。通过对物种基因组的完全或部分测序可获得物种DNA序列信息进而设计开发SSR 引物。发明基于SSR分子标记技术的种子纯度快速检测方法，将对规范瓠瓜种子产业，保护瓠瓜育种者的合法权益和农民的切身利益，促进农业增产、农民增收具有重要意义。
发明内容
本发明目的是，针对目前瓠瓜品种种子纯度鉴定大多依靠田间表现型观察方法所存在的鉴定时间长、受季节性限制及作物的表现型易随环境条件变化等缺陷，提供一种能早期、全年、快速、准确鉴定瓠瓜品种真伪和纯度的检测方法；本发明的另一目的是提供一种便捷实施上述方法的试剂盒。本发明目的通过以下技术方案得以实现。1、快速检测瓠瓜品种种子纯度的方法，该方法按以下步骤进行
(一 )瓠瓜基因组DNA的部分测序和SSR引物开发设计1)以主栽瓠瓜品种“杭州长瓜”为材料，应用测序仪对其基因组DNA进行1/4通量的一次测序，获得150，253条测序序列；2)运行Newbler序列拼接程序，对所得序列进行序列拼接以去除重复，获得无冗余的DNA序列86，561条;3)运行Mr印s 2. 5SSR序列鉴定程序，鉴定DNA序列上含SSR的序列区段，同时设计出跨越SSR位点的PCR引物；交由上海桑尼生物技术公司合成100对SSR引物；(二)SSR引物多态性信息含量PIC计算和诊断性SSR引物组合筛选1)提取44个当前生产上主要的瓠瓜品种DNA，用合成的100对引物分别PCR扩增这些材料的DNA，PCR反应体积为12. 5微升，退火温度为52°C ；幻统计每对引物的扩增情况，对扩增条带进行0或1赋值，计算各引物的多态性信息含量即PIC ；3)从扩增条带的稳定性、多态性条带的易分辨程度和引物多态性PIC指数三个方面进行综合评价，选取 LSROl 1，LSROl5，LSR040, LSR045, LSR047, LSR056, LSR063, LSR077 共
8对引物作为诊断性引物组合，具体是
权利要求
1.快速检测瓠瓜品种种子纯度的方法，其特征在于按以下步骤进行(一)瓠瓜基因组DNA的部分测序和SSR引物开发设计1)以主栽瓠瓜品种“杭州长瓜”为材料，应用测序仪对其基因组DNA进行1/4通量的一次测序，获得150，253条测序序列；2)运行Newbler序列拼接程序，对所得序列进行序列拼接以去除重复，获得无冗余的 DNA 序列 86，561 条；3)运行Mr印s2. 5SSR序列鉴定程序，鉴定DNA序列上含SSR的序列区段，同时设计出跨越SSR位点的PCR引物；交由上海桑尼生物技术公司合成100对SSR引物；(二)SSR引物多态性信息含量PIC计算和诊断性SSR引物组合筛选1)提取44个当前生产上主要的瓠瓜品种DNA，用合成的100对引物分别PCR扩增这些材料的DNA，PCR反应体积为12. 5微升，退火温度为52°C ；2)统计每对引物的扩增情况，对扩增条带进行0或1赋值，计算各引物的多态性信息含量即PIC;3)从扩增条带的稳定性、多态性条带的易分辨程度和引物多态性PIC指数三个方面进行综合评价，选取 LSROl 1，LSROl5，LSR040，LSR045，LSR047，LSR056，LSR063，LSR077 共 8 对引物作为诊断性引物组合，具体是
2.快速检测瓠瓜品种种子纯度的试剂盒，该试剂盒包括盒体和12支印pondorf管，在其中4支中分别装有25mM MgCl2, IOmM dNTP, IOX PCR缓冲液及5U/μ L Taq DNA聚合酶， 其特征在于在其余8支印pondorf管中，分别装有含有正、反向的浓度为ImM的诊断性SSR 检测引物 LSROl 1，LSRO15，LSR040, LSR045, LSR047, LSR056, LSR063, LSR077 ；此外，盒体中还装有印有权利要求1步骤(三)所列瓠瓜‘浙蒲2号’、‘浙蒲6号’、‘安吉长瓜’、‘萧山地蒲’及‘杭州长瓜’ 5个主栽品种标准DNA指纹图谱的图片。
全文摘要
本发明公开了快速检测瓠瓜品种种子纯度方法及其试剂盒，属于作物生物技术领域。方法包括(一)瓠瓜基因组DNA的部分测序和SSR引物开发设计；(二)SSR引物多态性信息含量PIC计算和诊断性SSR引物组合筛选；(三)瓠瓜5个主栽品种标准DNA指纹图谱的制备；(四)待测瓠瓜样品的检测等步骤工艺。该方法应用自主设计的8对诊断性SSR引物，增强了鉴别近似品种的能力，提高了检测的效率，由传统田间表现型鉴定的50-60天缩短为4-5小时，降低了检测费用，约为传统方法的六分之一，并提高了鉴定的准确性。本发明可在育种和种子企业中推广应用。
文档编号C12Q1/68GK102251042SQ20111020745
公开日2011年11月23日 申请日期2011年7月22日 优先权日2011年7月22日
发明者刘永华, 吴晓花, 徐沛, 李国景, 汪宝根, 潘榆樱, 王莎, 鲁忠富 申请人:浙江省农业科学院