专利名称：提高衣藻产氢量的培养基及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种提高衣藻衣藻产氢量的培养基及其制备方法。
背景技术：
由于矿物资源的日益枯竭，寻找清洁的替代能源已成为一项迫切的课题。氢是宇宙间最简单同时也是最为丰富的元素，它的热值高达118. 4kJ/g，燃烧后只生成水，被普遍认为是一种最有吸引力的替代能源。新的产氢方法，特别是那些能利用可再生能源，大量生产的产氢方法倍受注目。藻类光合制氢是微藻利用太阳能裂解水释放氢气的生物过程，是实现氢能可持续生产的重要途径之一。为了尽可能提高产氢量，研究人员从不同角度出发，深入探讨提高产 氢量的可能性如提高氢酶耐氧性、遗传改造及寻找高产氢藻种等。衣藻是人们研究藻类产氢的常用藻种，目前，人们常用的为缺硫环境的放氢体系，大多数的研究也都基于此。缺硫体系中含有除硫元素以外的C、H、O、N、P、K等大量元素及少量微量元素，通过缺硫厌氧达到产氢的目的。尽管在此培养条件下，能得到较多的氢气，但仍不能达到实际应用的要求。另外，培养基配置所需药品也在衣藻产氢成本中占有一定比例。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种培养衣藻产氢的培养基。本发明提供的培养基，由如下13种物质组成NH4C1、MgCl2 · 6H20、K2HPO4, KH2PO4,Tris 碱、H3B04、Zn Cl2、MnCl2 ·4Η20,CoCl2 ·6Η20、αι Cl2 ·2Η20、(NH4)6Mo7O24 ·4Η20,FeCl2 ·4Η20和冰乙酸，所述NH4Cl、MgCl2 · 6H20、K2HPO4' KH2PO4' Tris 碱、H3BO4' Zn Cl2, MnCl2 · 4Η20、CoCl2 · 6H20、Cu Cl2 · 2H20、(NH4)6Mo7O24 · 4H20、FeCl2 · 4H20 和冰乙酸的配比为(0. 35-0. 45)g (0. 08-0. 15) g 0. 108g 0. 056g (2. 2-2. 5)g 0. 0114g 0. 0105g 0. 00506g 0.00161g 0. 001072g 0. OOllg 0. 003568g (0. 8-1. l)ml0所述NH4Cl、MgCl2 · 6H20、K2HPO4' KH2PO4' Tris 碱、H3BO4' Zn Cl2, MnCl2 · 4H20、CoCl2 · 6H20、Cu Cl2 · 2H20、(NH4)6Mo7O24 · 4H20、FeCl2 · 4H20 和冰乙酸的配比为(0. 35,0. 4或 0.45) g (O. 08、0· I 或 O. 15)g O. 108g 0. 056g (2· 2、2· 423 或 2. 5) g 0. 0114g0. 0105g 0. 00506g 0. 00161g 0. 001072g 0. OOllg 0. 003568g (0. 8、1 或 I. l)ml。所述衣藻为莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)。本发明的另一个目的是提供一种培养衣藻产氢的培养基。本发明提供的培养基，由溶质和溶剂组成,所述溶质由如下13种物质组成NH4C1、MgCl2 · 6H20、K2HPO4' KH2PO4' Tris 碱、H3BO4' ZnCl2' MnCl2 · 4H20、CoCl2 · 6H20、CuCl2 · 2H20、(NH4)6Mo7O24 · 4H20、FeCl2 · 4H20 和冰乙酸组成，
所述NH4Cl在所述培养基中的终浓度为O. 35g/l-0. 45g/l ；所述MgCl2 · 6H20在所述培养基中的终浓度为O. 08g/l-0. 15g/l ；所述K2HPO4在所述培养基中的终浓度为O. 108g/l ；所述KH2PO4在所述培养基中的终浓度为O. 056g/l ；所述Tris碱在所述培养基中的终浓度为2. 2g/l_2. 5g/l ；所述H3BO4在所述培养基中的终浓度为O. 0114g/l ；所述ZnCl2在所述培养基中的终浓度为O. 0105g/l ；所述MnCl2 · 4H20在所述培养基中的终浓度为O. 00506g/l ；
所述CoCl2 · 6H20在所述培养基中的终浓度为O. 00161g/l ；所述CuCl2 · 2H20在所述培养基中的终浓度为O. 001072g/l ；所述(NH4)6Mo7O24 · 4H20在所述培养基中的终浓度为O. 0011g/l ；所述FeCl2 · 4H20在所述培养基中的终浓度为O. 003568g/l ；所述冰乙酸在所述培养基中的终浓度为O. 8ml/l-l. lml/1 ；所述溶剂为水。所述NH4Cl在所述培养基中的终浓度为O. 35g/l、0. 4g/l或O. 45g/l ；所述MgCl2 · 6H20在所述培养基中的终浓度为O. 08g/l、0. lg/1或O. 15g/l ；所述Tris碱在所述培养基中的终浓度为2. 2g/l、2. 423g/l或2. 5g/l ；所述冰乙酸在所述培养基中的终浓度为O. 8ml/l、lml/1或I. lml/1。所述培养基的pH值为6. 8-7. 3，所述培养基的pH值具体为6. 8、7或7. 3 ;所述衣藻为莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)。本发明的第三个目的是提供一种培养基的制备方法。本发明提供的方法，包括如下步骤将所述13种物质按照所述配比混合，得到所
述培养基。本发明的第四个目的是提供一种培养基的制备方法。本发明提供的方法，包括如下步骤将所述溶质中的13种物质均溶于水达到所述终浓度，得到所述培养基。所述的培养基在促进衣藻产氢中的应用；所述衣藻具体为莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)。本发明的第五个目的是提供一种利用衣藻制备氢气的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤将衣藻在权利要求1-8中任一所述的培养基中培养，收集培养产物，即得到氢气；所述培养温度为25°C，所述培养时间为7天(168小时左右);所述培养的光照强度为 200 μ Εβ 上述莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)均为莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)CC400。本发明的实验证明，本发明通过对现有放氢培养基配方(缺硫TAP培养液)进行优化后，发现在缺硫缺钙TAP培养液中，衣藻CC400的产氢量比现有缺硫体系下提高三分之二左右，而且减少了一种培养基组成，降低了成本。同时，由于在该缺硫培养基配方中，钙元素仅存在CaCl2 · 2H20中，因此可以较为方便的通过除去该化合物而控制实现缺硫缺钙的环境，操作方便。总之，与原有的衣藻产氢培养体系相比，本发明中的改进体系不但可以节约药品用量，而且放氢量也有所提高，这对于实现藻类低成本产氢的目标，又向前迈进了一
止/J/ O
图I为产氢量的结果图
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例I、藻种CC400产氢检测 一、材料莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii),藻种CC400从杜克大学藻种库莱茵衣藻(Chlamy center, http://www. chlamy. org/)购买；二、培养基(下述培养基中的各种组分均可从商业途径购买)I、正常 TAP 培养液=NH4Cl O. 4g/L ；MgS04 · 7H20 O. lg/L ；CaCl2 · 2H20 0. 05g/L ；K2HPO4 0. 108g/L ；KH2PO4 0. 056g/L ；Tris 碱 2. 423g/L ;亨特微量元素(Hunter，s traceelements) lml/L,冰乙酸 lml/L,其余为水。亨特微量兀素(Hunter，strace elements) H3BO4 11. 4g/L, ZnSO4 · 7H20 22. Og/L, MnCl2 · 4H20 5. 06g/L, CoCl2 · 6H20 I. 61g/L, CuSO4 · 5H20 I. 57g/L, (NH4)6Mo7O24 · 4H20I. 10g/L，FeSO4 · 7H20 4. 99g/L，其余为水。固体TAP培养基在正常TAP培养液中加I. 5%的琼脂粉。培养基的pH值均为7。2、缺硫 TAP 培养液(g/L):将正常培养液中的硫化物以等摩尔换成相应的氯化物=MgSO4 ·7Η20 (MgCl2 ·6Η20)、ZnSO4 · 7Η20 (Zn Cl2)、CuSO4 · 5H20 (CuCl2 · 2Η20)、FeSO4 · 7Η20 (FeCl2 · 4Η20)，括号中为替换后的对应的氯化物；具体如下缺硫TAP 培养液由如下物质组成=NH4Cl O. 4g/L ；MgCl2 · 6H20 O. lg/L ；CaCl2 · 2Η200· 05g/L ；Κ2ΗΡ04 0. 108g/L ；KH2P04 0. 056g/L ；Tris 碱 2. 423g/L ；H2B040.0114g/L、Zn Cl2 0. 0105g/L、MnCl2 · 4H20 0. 00506g/L、CoCl2 · 6H20 0. 00161g/L、CuCl2 · 2H200. 001072g/L、(NH4)6Mo7O24 · 4H20 0. 001 lg/L、FeCl2 · 4H20 0. 003568g/L，冰乙酸lml/L，其余为水。培养基的pH值均为7。3、缺钙TAP培养液(g/L):将正常TAP培养液中的CaCl2 · 2H20除去；培养基的pH值均为7。4、缺硫缺钙TAP培养液(g/L):将正常TAP培养液中的硫化物以等摩尔换成相应的氯化物，同时除去正常培养液中的CaCl2 · 2H20。具体如下缺硫缺钙TAP培养液I按照如下方法制备将NH4Cl、MgCl2 · 6H20、K2HPO4, KH2PO4,Tris 碱、H3B04、ZnCl2、MnCl2 ,OXoCl2 .6H20、Cu Cl2 ·2Η20、(NH4)6Mo7O24 ·4Η20,FeCl2 ·4Η20、冰乙酸和水混合，NH4Cl在培养基中的终浓度为O. 4g/l ；MgCl2 · 6H20在培养基中的终浓度为O. 08g/在2即04在培养基中的终浓度为O. 108g/l ;1(!^04在培养基中的终浓度为O. 056g/I ;Tris碱在培养基中的终浓度为2. 423g/l ;Η3Β04在培养基中的终浓度为0.0114g/l ；ZnCl2在培养基中的终浓度为O. 0105g/l ；MnCl2 · 4H20在培养基中的终浓度为O. 00506g/I ;CoCl2 · 6H20在培养基中的终浓度为O. 00161g/l ；CuCl2 · 2H20在培养基中的终浓度为O. 001072g/l ； (NH4)6Mo7O24 · 4H20 在培养基中的终浓度为 O. 001 lg/1 ；FeCl2 · 4H20 在培养基中的终浓度为O. 003568g/l ;冰乙酸在培养基中的终浓度为lml/1 ;培养基的pH值为7 ;
缺硫缺钙TAP培养液2按照如下方法制备与缺硫缺钙TAP培养液I基本相同，不同的是NH4Cl在培养基中的终浓度为O. 35g/l ；MgCl2 ·6Η20在培养基中的终浓度为O. lg/Ι ；Tris碱在培养基中的终浓度为2. 2g/l ;冰乙酸在培养基中的终浓度为O. 8ml/l ;培养基的pH值为6.8 ；缺硫缺钙TAP培养液3按照如下方法制备与缺硫缺钙TAP培养液I基本相同，不同的是=NH4Cl在培养基中的终浓度为O. 45g/l ；MgCl2 ·6Η20在培养基中的终浓度为O. 15g/ I ;Tris碱在培养基中的终浓度为2. 5g/l ;冰乙酸在培养基中的终浓度为I. lml/1，培养基的pH值为7.3。二、衣藻放氢量的测定方法I、衣藻预培养用TAP 固体培养基培养(25 °C, 200 μ Es 1Iii2)莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)CC400。固体培养时，将单克隆转到TAP固体培养基上划线培养。配制TAP液体培养液，121°C高压灭菌20分钟，待培养液温度降到室温(25°C )后，用接种针从固体培养基上挑取莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)CC400单克隆到液体TAP培养液中，置于恒温光照培养箱中的摇床上连续光照培养(25 °C，60rpm,200 μ Es-1HT2)，悬浮培养CC400衣藻细胞，培养约两天(48小时左右)，处于指数生长期。2、衣藻培养及放氢量的测定①液体培养将步骤I中处于指数生长期的CC400衣藻细胞接到盛150ml正常TAP培养液的三角瓶中，当OD75tl值达到I. 5时，再将其转到已加入磁转子的500ml正常TAP培
养液中。②待OD75tl值达到I. 5左右时，25°C，2500rpm，离心5分钟。③倒掉上清液，将得到的细胞分成三组，分别用缺硫TAP培养液、缺钙TAP培养液、缺硫缺钙TAP培养液漂洗细胞两次。 ④将上述3组漂洗过的细胞分别用20ml缺硫TAP培养液、缺钙TAP培养液、缺硫缺钙TAP培养液I分别重悬细胞。⑤每组分别取20 μ I悬浮细胞，加入980 μ I对应的培养液(缺硫TAP培养液、缺钙TAP培养液或缺硫缺钙TAP培养液I)，再加入4ml丙酮，混匀，5000rpm，离心5分钟。⑥分别收取三组离心后的上清液，测定663nm和645nm处的吸光值,根据下面的公式计算总叶绿素含量(Chi (a+b))Chl (a+b) = 8· 02 X 0D663+20. 21 X OD645⑦分别采用3个IOOml放氢瓶，培养体系为90ml的放氢瓶，按照上述⑥的方法计算最终叶绿素浓度达到25μ g/ml所需的④步骤中的细胞原液体积，分别加入④步骤得到的三组重悬细胞，用对应的培养液(缺硫TAP培养液、缺钙TAP培养液或缺硫缺钙TAP培养液I)补足到90ml，得到缺硫TAP培养液组、缺钙TAP培养液组和缺硫缺钙TAP培养液I组。⑧用石蜡封住三组的瓶口，以防止气体外漏。⑨分别将三组放氢瓶置于25°C，200 μ EiT1nT2培养箱中的磁力搅拌器上连续光照培养7天，分别取不同的时间点测定放氢量。采用SHIMADZU GC-2014气相色谱测定氢气含量，载气为氮气。测定时用250ul注射器吸取放氢瓶气体部分IOOul左右，注入进样孔，甲烷外标法计算气体体积。实验重复三次，结果取平均值。结果如图I所示(产氢量为在培养7天得到)，其中，CC400_Ca为缺钙TAP培养液组，CC400-S为缺硫TAP培养液组，CC400-S-Ca为缺硫缺钙TAP培养液I组，
CC400-Ca 的产氢量为 O. 50 ±O. 08ml/L，CC400-S 的产氢量为 125. 97± 11. 89ml/L,CC400-S-Ca 的产氢量为 203. 94±18. 48ml/L。从上述可以看出，通过对现有放氢培养基配方(缺硫TAP培养液)进行优化后，发现在缺硫缺钙TAP培养液中，衣藻CC400的产氢量比现有缺硫体系下提高三分之二左右，而且减少了一种培养基组成，降低了成本。同时，由于在该缺硫培养基配方中，钙元素仅存在CaCl2 · 2H20中，因此可以较为方便的通过除去该化合物而控制实现缺硫缺钙的环境，操作方便。采用同样的方法检测缺硫缺钙TAP培养液2和缺硫缺钙TAP培养液3，结果与缺硫缺钙TAP培养液I无显著差异。
权利要求
1.一种培养衣藻产氢的培养基，由如下13种物质组成=NH4Cl、MgCl2 · 6H20、K2HPO4,KH2PO4' Tris 碱、H3BO4' ZnCl2' MnCl2 · 4H20、CoCl2 · 6H20、CuCl2 · 2H20、(NH4)6Mo7O24 · 4H20、FeCl2 · 4H20和冰乙酸，所述 NH4CU MgCl2 · 6H20、K2HPO4, KH2PO4, Tris 碱、H3B04、Zn Cl2, MnCl2 · 4H20、CoCl2 · 6H20、Cu Cl2 · 2H20、(NH4)6Mo7O24 · 4H20、FeCl2 · 4H20 和冰乙酸的配比为(0. 35-0. 45)g (0. 08-0. 15) g 0. 108g 0. 056g (2. 2-2. 5)g 0. 0114g 0. 0105g 0. 00506g 0.00161g 0. 001072g 0. OOllg 0. 003568g (0. 8-1. l)ml0
2.根据权利要求I所述的培养基，其特征在于所述 NH4CUMgCl2 ·6Η20、K2HPO4'KH2PO4'Tris 碱、H3B04、Zn Cl2、MnCl2 ·4Η20,CoCl2 ·6Η20、Cu Cl2 · 2Η20、(NH4)6Mo7O24 · 4Η20、FeCl2 · 4Η20 和冰乙酸的配比为(O. 35,0. 4 或 O. 45)g (O. 08、0· I 或 O. 15)g O. 108g O. 056g (2· 2、2· 423 或 2· 5) g O. 0114g O. 0105g O. 00506g 0. 00161g 0. 001072g 0. OOllg 0. 003568g (0. 8、1 或 I. l)ml。
3.根据权利要求I或2所述的培养基，其特征在于所述衣藻为莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)。
4.一种培养衣藻产氢的培养基，由溶质和溶剂组成,所述溶质由如下13种物质组成NH4Cl' MgCl2 · 6H20、K2HPO4' KH2PO4' Tris 碱、H2BO4' ZnCl2, MnCl2 · 4H20、CoCl2 · 6H20、CuCl2 · 2H20、(NH4)6Mo7O24 · 4H20、FeCl2 · 4H20 和冰乙酸组成， 所述NH4Cl在所述培养基中的终浓度为O. 35g/l-0. 45g/l ； 所述MgCl2 · 6H20在所述培养基中的终浓度为O. 08g/l-0. 15g/l ； 所述K2HPO4在所述培养基中的终浓度为O. 108g/l ； 所述KH2PO4在所述培养基中的终浓度为O. 056g/l ； 所述Tris碱在所述培养基中的终浓度为2. 2g/l-2. 5g/l ； 所述H3BO4在所述培养基中的终浓度为O. 0114g/l ； 所述ZnCl2在所述培养基中的终浓度为O. 0105g/l ； 所述MnCl2 · 4H20在所述培养基中的终浓度为O. 00506g/l ； 所述CoCl2 · 6H20在所述培养基中的终浓度为O. 00161g/l ； 所述CuCl2 · 2H20在所述培养基中的终浓度为O. 001072g/l ； 所述(NH4)6Mo7O24 · 4H20在所述培养基中的终浓度为O. 0011g/l ； 所述FeCl2 · 4H20在所述培养基中的终浓度为O. 003568g/l ； 所述冰乙酸在所述培养基中的终浓度为O. 8ml/l-l. lml/1 ； 所述溶剂为水。
5.根据权利要求4所述的培养基，其特征在于 所述NH4Cl在所述培养基中的终浓度为O. 35g/l、0. 4g/l或O. 45g/l ； 所述MgCl2 · 6H20在所述培养基中的终浓度为O. 08g/l、0. lg/1或O. 15g/l ； 所述Tris碱在所述培养基中的终浓度为2. 2g/l、2. 423g/l或2. 5g/l ； 所述冰乙酸在所述培养基中的终浓度为O. 8ml/l、lml/1或I. lml/1。
6.根据权利要求4或5所述的培养基,其特征在于 所述培养基的PH值为6. 8-7. 3，所述培养基的pH值具体为6. 8、7或7. 3 ; 所述衣藻为莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)。
7.权利要求1-3中任一所述的培养基的制备方法，包括如下步骤将所述13种物质按照所述配比混合，得到所述培养基。
8.权利要求4-6中任一所述的培养基的制备方法，包括如下步骤将所述溶质中的13种物质均溶于水达到所述终浓度，得到所述培养基。
9.权利要求1-6中任一所述的培养基在促进衣藻产氢中的应用；所述衣藻具体为莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)。
10.一种利用衣藻制备氢气的方法，包括如下步骤将衣藻在权利要求1-6中任一所述的培养基中培养，收集培养产物，即得到氢气； 所述培养温度为25°C，所述培养时间为7天；所述培养的光照强度为ΖΟΟμΕ^πΓ2。
全文摘要
本发明公开了一种提高衣藻衣藻产氢量的培养基及其制备方法，本发明提供的培养基，由如下13种物质组成NH4Cl、MgCl2·6H2O、K2HPO4、KH2PO4、Tris碱、H3BO4、ZnCl2、MnCl2·4H2O、CoCl2·6H2O、Cu Cl2·2H2O、(NH4)6Mo7O24·4H2O、FeCl2·4H2O和冰乙酸组成。本发明的实验证明，本发明通过对现有放氢培养基配方(缺硫TAP培养液)进行优化后，发现在缺硫缺钙TAP培养液中，衣藻CC400的产氢量比现有缺硫体系下提高三分之二左右，而且减少了一种培养基组成，降低了成本。
文档编号C12P3/00GK102925490SQ201110230908
公开日2013年2月13日 申请日期2011年8月12日 优先权日2011年8月12日
发明者黄芳, 赵磊 申请人:中国科学院植物研究所