专利名称：结核与非结核分枝杆菌快速检测试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及一种结核与非结核分枝杆菌快速检测试剂盒及检测方法。
背景技术：
结核病是严重危害我国人民健康的慢性传染病，它不仅是重要的公共卫生问题， 而且是一个复杂的社会经济问题，在一定程度上影响了社会经济的发展。其疫情的严重性主要表现为高感染率、高患病率、高死亡率、高耐药率、低递降率。尽管近年来我国在执行标准化治疗和提高治愈率上有了长足的进步，但仍然是结核病高负担国家。快速准确诊断技术的缺乏和病人发现的困难是我国控制结核病的最大障碍。我国依旧用落后的细菌学方法 (痰涂片及固体培养)作为结核病的实验室诊断工具，检出率低、漏检率高、时效性差，严重延误患者特别是耐多药结核病患者的最佳治疗时间。非结核分枝杆菌广泛存在于自然界， 当机体免疫受损时，也会引发肺内或肺外感染，其临床症状与结核病酷似，临床上固体培养阳性的分枝杆菌中，5% -10%为非结核分枝杆菌。目前国内外已建立了一些检测结核分枝杆菌的分子生物学方法，但非结核分枝杆菌的检测方法较少，同时检测结核与非结核分枝杆菌并能稳定应用于临床样本的检测方法更少。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术中的不足，提供一种快速检测试剂盒， 以及基于该试剂盒的检测方法。本发明通过对16S rRNA及新基因Rv0355的分析、引物的选择以及检测条件的优化，设计一种准确、灵敏、快速的双重PCR检测试剂盒及检测方法，以期提高我国结核与非结核分枝杆菌检测能力。本发明采用的技术方案是一种结核与非结核分枝杆菌快速检测试剂盒，主要包括样品DNA提取试剂、PCR反应试剂和特异性扩增引物，其特征在于所述特异性扩增引物由16S rRNA扩增引物MTC与 Rv0355扩增引物⑶192组成，所述引物序列如下弓丨物MTC (产物长度M3bp)上游引物MTC-I :5，-ACGGTGGGTACTAGGTGTGGGTTTC-3，下游引物MTC-2 5，-TCTGCGATTACTAGCGACTCCGACTTCA-3，引物CD192(产物长度 238bp)上游引物CD192-1 :5，-TCCGCTGCCGAGAATGTTGTAAT-3，下游引物CD192-2 :5，-CGCGGGCGTGCTGGTATC-3，。本发明的关键在于扩增引物的设计，试剂盒中其他组成，可按本领域常规进行选择。其中样品DNA提取试剂可包括稀释液和裂解液，PCR反应试剂包括PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，其中PCR缓冲液可采用市购商品，也可自行配制，例如将 Tris-HCl, KC1、MgCl2等按比例混合进行配制，进行检测时，将PCR反应试剂和扩增引物混说明书2/8页CN 102277440 A合，再加入待测样品或对照品，即可进行PCR扩增反应。为进一歩提高试剂盒检测准确性，所述试剂盒中还可包括结核分枝杆菌阳性对照 品和非结核分枝杆菌阳性对照品。具体的，所述试剂盒可由5个冻存管組成冻存管A装有裂解液5mL ；冻存管B装有PCR反应体系溶液，組成如下
权利要求
1.一种结核与非结核分枝杆菌快速检测试剂盒，主要包括样品DNA提取试剂、PCR反应试剂和特异性扩增引物，其特征在于所述特异性扩增引物由16S rRNA扩增引物MTC与 Rv0355扩增引物⑶192组成，所述引物序列如下引物MTC 上游引物 MTC-I :5’ -ACGGTGGGTACTAGGTGTGGGTTTC-3’ 下游引物 MTC-2 :5’ -TCTGCGATTACTAGCGACTCCGACTTCA-3’ 引物CD192 上游引物 CD192-1 :5’ -TCCGCTGCCGAGAATGTTGTAAT-3， 下游引物 CD192-2 :5，-CGCGGGCGTGCTGGTATC-3，。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还包括结核分枝杆菌阳性对照品和非结核分枝杆菌阳性对照品。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒由5个冻存管组成 冻存管A装有裂解液5mL;冻存管B装有PCR反应体系溶液，组成如下PCR buffer终浓度为1χTaq DNA polymerase0.05U/pLdNTP各 250μΜ引物MTC和CD192各ΙΟμΜ溶剂为水；冻存管C装有0. 2mL结核分枝杆菌阳性对照溶液； 冻存管D装有0. 2mL非结核分枝杆菌阳性对照溶液； 冻存管E装有稀释液5mL。
4.利用权利要求1所述试剂盒检测结核与非结核分枝杆菌的方法，所述方法包括(1)利用DNA提取试剂提取待测样品DNA；(2)以待测样品DNA为模板，加入PCR反应试剂和特异性扩增引物配制PCR反应体系， 进行PCR扩增；(3)扩增产物进行凝胶成像系统分析，若待测样品扩增出543bp和238bp两条条带，判断为结核分枝杆菌；若待测样品只扩增出543bp条带，则判断为非结核分枝杆菌。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述试剂盒由5个冻存管组成 冻存管A装有裂解液5mL;冻存管B装有PCR反应体系溶液，组成如下
全文摘要
本发明提供了一种结核与非结核分枝杆菌快速检测试剂盒，主要包括样品DNA提取试剂、PCR反应试剂和特异性扩增引物，所述特异性扩增引物由16S rRNA扩增引物MTC与Rv0355扩增引物CD192组成，所述引物序列如下MTC-15’-ACGGTGGGTA CTAGGTGTGGGTTTC-3’，MTC-25’-TCTGCGATTACTAGCGACTC CGACTTCA-3’；CD192-15’-TCCGCTGCCGAGAATGT TGTAAT-3’，CD192-25’-CGCGGGCGTGCTGGTATC-3’。本发明通过对结核与非结核分枝杆菌种属特异性基因的分析、引物的选择设计以及检测条件的优化后，提供的多重PCR检测试剂盒在应用中更加准确、灵敏、快速。
文档编号C12R1/32GK102277440SQ20111025344
公开日2011年12月14日 申请日期2011年8月30日 优先权日2011年8月30日
发明者丛黎明, 吴蓓蓓, 帅江冰, 王晓萌 申请人:浙江省疾病预防控制中心