专利名称：截短型溶血链球菌溶菌素o及利用其的检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种重组蛋白基因以及试剂盒。更具体而言，涉及一种截短型溶血链球菌溶菌素O重组蛋白与ASO检测试剂盒。
背景技术：
溶血链球菌溶血素O (Sti^ptolysin 0，SL0)是多种溶血性链球菌都会表达的一种分泌型蛋白，人在感染溶血性链球菌后会对SLO产生特异抗体。抗链球菌溶血素O (ASO)的检测，是临床诊断溶血性链球菌感染的重要指标之一。提纯的SLO主要来源于溶血链球菌中SLO的提纯，以及在大肠杆菌表达菌株中表达SLO蛋白并纯化。以上两种方法均存在一些局限性，从溶血链球菌中提纯SL0，得率低，难以大规模生产，同时存在生物安全隐 患；利用原核表达系统表达纯化SL0，由于SLO蛋白对细菌细胞具有毒性，一般难以大量表达。在现有技术中已有人报道了，每升细菌培养物(7-8g菌体湿重/升)能纯化出38. Smg左右蛋白，而其中目的蛋白的纯度只有40% (参见非专利文献I :Sandra Camprub' I,Marc Bruguera, Francesca Canalias. International Journal of BiologicalMacromolecules,38(2006)134-139)。 175-574全长SLO基因是含有571个氨基酸残基(aa)的蛋白，通过结构预测发现，这一蛋白大致可以分为前后三个区域。其中，第一段区域1-77个aa，是胞外分泌信号肽，具有细胞毒性；最后一段459-571aa具有细胞膜铆定功能，是SLO的毒性相关结构域(参见非专利文献 2 Silvia Weis, Michael Palmer. Biochimica et Biophysica Acta,1510(2001)292-299)。我们选择对101_400aa的片段进行克隆表达。现有技术中报道的表达方案，一般只去除蛋白的信号肽部分，表达剩余大部分蛋白，但因为剩余部分的毒性影响细胞生长，产量也不高。由非专利文献I的记载可知，每升细菌培养物(7_8g湿菌体/升)能纯化出38. Smg左右蛋白，而其中目的蛋白的纯度只有40%。
发明内容
本发明要解决的问题本发明的目的在于提供一种能在表达载体中大量表达SLO的基因以及基因工程菌，并利用该SLO制备ASO检测试剂盒。解决问题的手段本发明人将SLO的Domain I和4截去，将剩余的截短的SLO基因克隆到大肠杆菌等表达载体中，使之大量表达并利于纯化。具体而言，本发明人提供如下的技术方案。I. 一种DNA序列，其喊基序列如SEQ ID NO I所不。2. 一种DNA序列，其为编码如下蛋白质的序列(a)氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示；(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸序列且具有溶血链球菌溶血素O免疫原性的蛋白质。3. —种溶血链球菌溶血素0，其特征在于，(a)氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示；(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸序列且具有溶血链球菌溶血素O免疫原性的蛋白质。4. 一种表达载体,其含有权利要求I或2所述的DNA序列。5. 一种制备溶血链球菌溶血素O的方法，包括用技术方案4所述的表达载体转化宿主细胞，培养转化体，获得重组的制备溶血链球菌溶血素O。6.根据技术方案5所述的方法，其特征在于，宿主细胞是大肠杆菌。 7. 一种抗溶血链球菌溶血素O检测试剂盒，其特征在于，包含缓冲液、叠氮钠以及包被技术方案3所述的溶血链球菌溶血素O的胶乳。8. 一种抗溶血链球菌溶血素O检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包含如下工序a)将胶乳微球用缓冲液稀释，将缓冲液溶解的技术方案3所述的溶血链球菌溶血素O加入到所述胶乳微球的稀释液中，室温搅拌后，收集沉淀山)用缓冲液重悬所述沉淀，调整所述胶乳浓度至规定浓度。技术效果根据本发明，截短的SLO序列能使SLO蛋白的产量大大提高，每升细菌培养物能纯化得到150mg以上的SLO蛋白，纯度90%以上。将SLO重组抗原用来研制ASO胶乳增强试剂盒，发现研制的ASO试剂盒检测临床标本结果和对照ASO试剂盒测试结果相关性很好，证明表达的SLO依然保持了特异的免疫原性。
图I是ASO试剂定标曲线，曲线中的每一个点代表一个含量的校准品，X轴表示ASO含量，Y轴表示吸光度；图2是自制试剂和对照试剂测定50人份血清相关性分析相关性图表；图3是表不SLO基因的克隆的电泳图；图4是经IPTG的诱导过的截短型SLO蛋白电泳图，(+)表示经IPTG的诱导，(_)表示未经IPTG的诱导；图5是上清液和沉淀中的截短型SLO蛋白电泳图。
具体实施例方式本发明的截短型溶血链球菌溶菌素O基因本发明提供一种碱基序列如SEQ ID NO 1所示的DNA序列，以及编码如SEQ IDNO :2所示的氨基酸序列的DNA序列。根据简并密码子原理，简并密码子之间的突变并不改变氨基酸序列，这种突变不会影响蛋白质本身的性质，因此，这一类的变异也属于本申请的专利保护范围之内。此外，与本发明提供的DNA序列对应的RNA序列也可实现本发明的效
果O作为本发明的对象的基因序列，并不限于前述SEQ ID NO :1所示的DNA序列以及其中的简并密码子突变序列，还包括编码与该蛋白质具有同等功能的蛋白质的其他基因序列。作为具有同等功能的蛋白质，例如可以为在SEQ ID NO :2限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸序列且具有SLO免疫原性的蛋白质。本发明的基因序列可以通过PCR方式从链球菌(Streptococcus pyogenes)的基因组DNA中扩增，或可通过基因合成获得，国内可以进行基因合成的公司有上海生工，上海旭冠，北京英骏等。本发明的蛋白质本发明还提供一种溶血链球菌溶血素0，其特征在于，(a)氨基酸序列如SEQ IDN0:2所示；(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸序列且具有SLO免疫原性的蛋白质。此类蛋白质可以为由SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添 加上述数量的氨基酸残基后的氨基酸序列组成，且具有SLO免疫原性的蛋白质。此外，此类蛋白质还可以为具有与SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列有约70%以上、更优选为80%以上、进一步优选为90%以上、最优选为95%以上的同一性的氨基酸序列且具有SLO免疫原性的蛋白质。此类蛋白质可通过使用《MolecularCloning 3》、《Current Protocols inMolecular Biology))等记载的定点诱变法获得。本发明中，在蛋白质的氨基酸序列中取代、缺失或添加一个或几个氨基酸序列，是指在同一序列中的任意I个或多个氨基酸序列的位置上的I个或多个氨基酸残基取代、缺失或添加，并且可同时发生取代、缺失或添加中的两种以上。下面例举可互相取代的氨基酸残基，同一组中包含的氨基酸残基可互相取代。A组亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、O-甲基丝氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、环己基丙氨酸组天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸；(组天冬酰胺、谷氨酰胺山组赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2，4- 二氨基丁酸、2，3- 二氨基丙酸；E组脯氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸；F组丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸；G组苯丙氨酸、酪氨酸。本发明的蛋白质也可以通过Fmoc法(芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等化学合成法合成。并且，也可以利用Advanced Chem Tech公司、钼金埃尔默(PerkinElmer) >Pharmacia 公司、Protein Technology Installment 公司、Synthecell-Vega 公司、PerSeptive公司、岛津制作所等制造的肽合成仪进行化学合成。本发明的载体及使用该载体转化的大肠杆菌本发明提供含有上述基因序列的载体，所述载体是指携带靶DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。作为载体，可例举出质粒、噬菌体、病毒、粘粒等生物工程领域中常用的载体。本发明的载体通常包括表达盒，该表达盒含有的结构要素为(I)在宿主细胞内可转录的启动子；(2)在该启动子的正义方向或反义方向上连接的上述基因序列；以及
(3)涉及RNA分子的转录终止以及多聚腺苷化作用，在宿主内起作用的信号。本发明中，优选表达载体为pET28b载体，优选宿主为大肠杆菌DH5a、DE3，但本发明的载体和宿主并不限于此。分子克隆技术通常特指基因克隆(gene cloning)或DNA重组技术(recombinantDNA technology)。基因克隆主要包括①连接外源基因和克隆载体，构建重组DNA分子，②将重组DNA分子转入受体细胞，使外源基因随受体细胞分裂而得以复制、繁殖。基因克隆的基本方法主要有以下操作和结果(I)包括有目的基因在内的DNA片断插入到空载体中，空载体包括可以包括多种常见的检测标记(例如荧光标记、抗生素标记等报告基因)和酶切位点。重组载体可以采用空载体本身多克隆位点的多种核酸内切酶(如Ndel、NcoI、EcoRI、HindIII，BamHI等)，可以先用酶线性化空载体，与采用相同核酸内切酶处理的目的基因片段相连接，构建本发明的重组表达载体。本发明选用NcoI和XhoI双酶切pET28b及其连接的PCR产物片段，经连接酶连接，构建本发明的重组pET28b-SL0。(2)重组载体pET28b_SL0可以通过生物分子学领域常见的方法重组表达质粒转化、转导或者转染到宿主细胞中，如氯化钙法化学转化，高压电击转化，本发明优选化学法进行转化；所述的宿主细胞可以为原核细胞或者真核细胞，包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母细胞或者动植物细胞，本发明优选大肠杆菌细胞BL21 (DE3)。 (3)将重组表达质粒pET28b-SL0转化至BL21 (DE3)细胞中后，即得到生产SLO抗原的基因工程菌株，基因工程菌株经过大量培养、诱导后，可以通过离心方法分析重组细胞和培养基，用高压匀浆或者超声的方法破碎细胞，用离心或者过滤方法去除细胞碎片，用亲和层析方法从上清液中纯化SLO抗原。对纯化的SLO抗原可以用如下方法进行纯度确定，如电泳分析法(SDS-PAGE)、抗原抗体法、蛋白质谱法、扩散分析、恒溶度法等。本发明的ASO检测试剂盒以及使用方法本发明所述SLO抗原基因工程菌的构建方法和一种可以定量检测溶血素“O”试剂盒。优选的情况下,本发明的试剂盒包括SLO抗原、聚苯乙烯微球和牛血清白蛋白等，聚苯乙烯微球在试剂盒中的作用是起到胶乳增强作用，牛血清白蛋白是起稳定试剂作用，由于用本发明所述的方法可以制备大量表达的SLO抗原，并且重组抗原的特异性很好，所以用本发明所述的SLO抗原制备的抗链球菌素O测定试剂盒具有灵敏度高的优点，并且可以进行规模化制备。免疫胶乳增强试剂盒由两种试剂组成试剂I为酸碱缓冲液+0. 1%BSA溶液，试剂2为将包被好的微球用试剂I充分悬浮的乳浊液。可以使用的缓冲液包括PH6. 0-8. O的磷酸盐缓冲液(50mM)，pH 8. 5-9. 5的硼酸缓冲液，pH 8. 0-9. 5的Tris-HCl缓冲液，pH 8. 0-9. 6的碳酸缓冲液。优选pH 7. 0-8. O的缓冲液，但不仅限于上述缓冲液组分。为了保证乳浊液的分散性，有时也可以添加O. 1% TritonX-IOO0为了保证目的蛋白在试剂盒中的稳定性，可加入一定比例的叠氮钠(O. 01% -O. 1% ), DTT(ImM)等试剂。抗链球菌素O测定试剂盒临床上用于测定人体血清或血浆中抗链球菌素O的含量。链球菌素O(SLO)是链球菌的一种胞外产物，它能溶解细胞膜从而导致溶血。抗链球菌素(ASO)是SLO的抗体。ASO测试能为早期的链球菌感染提供证据，主要应用于急性风湿热、链球菌感染后的血管球性肾炎、患有咽炎的个人以及其它急性感染的检验。上述ASO检测试剂盒的制备方法，包含如下工序a)用浓度为50mM的pH 7. O的磷酸盐缓冲液，将胶乳微球进行稀释，在分光光度计上检测OD值为2. 0-2. 5 (波长600nm，光径Icm),将缓冲液溶解的抗原加入到所述胶乳微球的稀释液中，以50rpm/min的搅拌速度，在室温下搅拌3小时，25000g条件下离心I小时，收集沉淀，；b)用含有O. I % BSA的pH为7. O的磷酸盐缓冲液重悬沉淀，并将浓度调整至OD值为I. 2-1. 4 (波长600nm，光径Icm)。实施例下面，通过实施例对本发明进行更进一步的说明，但是，本发明并不限于如下实施例。实验材料I 菌种本实验用到的大肠杆菌DH5 α和BL21 (DE3)购自天根公司。链球菌Streptococcus pyogenes由军事医学科学院提供。
2 载体本实验涉及到的表达载体pET28b由本实验室保存。3 引物本实验用到的引物SL0-1/SL0-2均为生工合成。SL0-1 ATCGCATATG AAACAAAACACTGCTAGTACAGAAAC,附加 NdeI 酶切位点；SL0_2 ATCGCTCGAG AGCTTCATTGCTGACACCTTTTC,附加 XhoI 酶切位点。4培养基LB培养基蛋白胨10g/L酵母粉5g/LNaCl10g/L121 20min 灭菌。5 其他本实施例中所用到的Taq酶与dNTP、限制性内切酶，修饰酶与连接酶等购自Takara 公司，镇柱购自 GE Company 的 HisTrap H. P。实施例I截短的SLO基因的克隆和表达载体的构建将链球菌菌种接种于肉浸液肉汤培养基(Meat Infusion Broth)，37 °C震荡培养18-24小时。离心收集菌体,沉淀重新悬浮于Iml ΤΕ(ρΗ8·0)中。加入6μ1 50mg/ml的溶菌酶，37°C作用 2h，再加入 2mol/L NaCl 50 μ 1,10% SDS 110 μ 1，20mg/ml 的蛋白酶K 3μ 1，50°C作用15min。之后将菌液分到IOml离心管中，加等体积的酚氯仿异戊醇(25 24 1)，混匀后放置5min。12000rpm离心lOmin，吸取上清。重复抽提两次。在上清中加入0. 6倍体积的异丙醇,混勻，室温放置lOmin。12000rpm离心IOmin,沉淀用75%的乙醇洗涤、凉干后，溶于50 μ I ddH20中。按照SLO基因序列设计引物SL0-1/SL0-2，以纯化的链球菌DNA为模板，扩增SLO的第100-400位aa的基因序列，约0. 9kb，参见图3，预计表达得到的蛋白大小为30_35kD。将扩增正确的目的条带回收，用NcoI和XhoI消化后，连入同样酶切的pET28b载体。转化大肠杆菌DH5a，提取质粒并酶切鉴定，得到的阳性克隆命名为pET28b-SL0。将酶切鉴定为阳性的质粒转化表达菌种BL21(DE3)，然后涂布在含有卡那霉素(100ug/ml)的LB固体培养基上，经抗性筛选可以得到SLO抗原基因工程菌。酶切阳性的质粒测序，测序结果表明表达载体构建正确。实施例2截短型SLO蛋白的表达
从LB固体培养基上挑选SLO基因工程菌落，分别接种于含有100ug/ml的LB培养基中37°C过夜培养，第二天I : 1000稀释于LB培养基中，37°C培养至0D2. 0，加入终浓度ImM的IPTG进行诱导，4小时后收获菌液。将未加IPTG的菌液作为未诱导的对照。分别取诱导前后的菌液各500 μ 1，离心后去上清，菌体用200 μ I的蛋白上样缓冲液重悬，煮沸5min后离心，上清用于SDS-PAGE检测。考马斯亮蓝的染色结果显示，经过IPTG的诱导，在预测的分子量处有一条特异的浓集的蛋白条带，而未诱导的菌体则没有，具体结果请见图4。选择表达水平高的菌株为工程菌株。诱导后的细菌超声破碎后离心，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE检测，结果表明重组蛋白大部分以可溶形式存在于上清中，具体结果请见图5。SDS电泳结果表明，在预期大小(30_35kD)很大一部分SLO蛋白都以可溶的形式在上清中存在，因此可用镍柱亲和层析的方法将目的蛋白纯化。纯化后电泳检测结果表明，目的蛋白的纯度可以达到95%以上。IL培养基大约可纯化150mg目的蛋白。重组SLO蛋白的免疫原性测定本试验用ELISA方法验证了重组蛋白的免疫原性。ElISA吸光治读数如表I所示。以BSA包被的小孔为阴性对照，对照与样品各做3个重复，ASO的稀释度为I : 20000。ELISA数据表明，重组的SLO蛋白与ASO有很强的特异免疫反应。表ISLO重组蛋白的ELISA检测
权利要求
1.一种溶血链球菌溶血素O，其特征在于， (a)所述溶血链球菌溶血素O的氨基酸序列如SEQID NO 2所示；或者 (b)所述溶血链球菌溶血素O的氨基酸序列在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，并且所述溶血链球菌溶血素O具有溶血链球菌溶血素O免疫原性。
2.—种DNA，其序列编码权利要求I所述的溶血链球菌溶血素O。
3.根据权利要求2所述的DNA，其序列如SEQID N0:1所示。
4.一种表达载体，其含有权利要求2或3所述的DNA序列。
5.一种制备溶血链球菌溶血素O的方法，其包括用权利要求4所述的表达载体转化宿主细胞，培养转化体，获得重组的制备溶血链球菌溶血素O。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞是大肠杆菌。
7.一种抗溶血链球菌溶血素O检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含缓冲液、叠氮钠以及包被权利要求I所述的溶血链球菌溶血素O的胶乳。
8.根据权利要求7所述的抗溶血链球菌溶血素O检测试剂盒，其中，包含如下工序a)将胶乳微球用缓冲液稀释，将缓冲液溶解权利要求I所述的溶血链球菌溶血素O加入到所述胶乳微球的稀释液中，室温搅拌后，收集沉淀山)用缓冲液重悬所述沉淀，调整所述胶乳浓度至规定浓度。
全文摘要
本发明提供一种截短型溶血链球菌溶菌素O基因与ASO检测试剂盒。本发明人克隆部分SLO基因片段，将该部分的SLO基因克隆到大肠杆菌等表达载体中，使之产量表达并利于纯化。具体而言，本发明人提供一种DNA序列，其碱基序列如SEQ ID NO1所示。根据本发明，截短的SLO序列能使SLO蛋白的产量大大提高，每升细菌培养物能纯化得到150mg以上的SLO蛋白，纯度90％以上，经过免疫学实验证明，这一分段表达的SLO依然保持了特异的免疫原性。
文档编号C12N15/63GK102964435SQ20111025582
公开日2013年3月13日 申请日期2011年8月31日 优先权日2011年8月31日
发明者不公告发明人 申请人:北京利德曼生化股份有限公司研发中心