专利名称：交变电场提高磷酸腺甙水解酶催化活性的方法
技术领域：
本发明涉及一种催化化学反应方法。具体是涉及采用交变电场来提高磷酸腺甙水解酶的催化活性的工艺方法。
背景技术：
酶是一种高效的生物催化剂。即使如此，以人工的方法进一步提高酶催化的活性仍然是酶工程所追求的目标，同时也是现代酶学探究酶催化机制的一种重要手段。研究发现，酶蛋白结构中的结合部位和催化部位并不是刚性的(Hammes-khiffer S.Biochemistry 2002,41,13335-13343 ；Eisenmesser EZ, Science 2002,295, 1520-1523)。除了蛋白质构象的柔性能够产生许多构象亚态之外，活性部位并不只是由于底物分子的诱导才能与底物分子完美契合的。事实上，在没有底物的情况下，蛋白质的构象就会在不同的亚态之间转换(Eisenmesser EZ, et al. Nature 2005,438,117-121 ；Huang, Y.P.，et al. Nature 2005，438，36-37)，底物是在这种转换中进出活性部位的。如果在反应体系中外加一个交变电场，底物、产物和蛋白质分子就会沿电场的方向进行极化，并向电极迁移。如果进一步施加交变电场，底物和产物分子就会进行振动运动。当振动频率与进出活性部位的频率接近时就可能促进酶的催化能力。由于电场会对离子产生影响，所以交变电场与各种离子通道及相应生物膜的相互作用是显而易见的(Liu DS, et al. J.Biol. Chem. 1990，265，7260-7267 ；Markin VS.，et al. J. Membr. Biol. 1992,126 137-145)。但是， 电场对水解酶所存在的影响还尚未得到证实。另一方面，弱电磁场对生物体的影响与噪声一样可能对公众的健康造成严重的影响(Weaver JC, Astumian RD. Science 1990，247，459-462)。细胞或生物体在长期进化后具备了感受极弱机械振动、电磁周期信号和低浓度化学信使分子的能力，并能够对由这些信号所产生的微小扰动作出响应。这一机制可以用酶蛋白对交变电场的响应作为基础。
发明内容
本发明的目的之一是建立一种改善酶催化环境的方法。本发明的目的之二是为研究电磁污染的生物效应提供一种化学实验方法。本发明的目的之三是为研究酶的催化机制提供一种实验方法。为了达到上述目的，本发明建立了一种适用于在磷酸腺甙水解酶(即三磷酸腺甙 / 二磷酸腺甙酶)催化下三磷酸腺甙和二磷酸腺甙水解反应的体系，采用交变电场来加快反应速率的工艺方法。具体工艺如下用来源于马铃薯的三磷酸腺甙/ 二磷酸腺甙酶来考察上述方法。此酶可催化三磷酸腺甙钠的水解，释放二磷酸腺甙和磷酸，进一步的催化则释放单磷酸腺甙和磷酸。通过对反应体系pH值的测量可在线监测磷酸的释放量，从而估算反应进程随时间的变化。将两个钼电极置于反应体系中，电极连接到函数信号发生器上。调节交变电场的频率在10 IOfiHz范围内，电场强度1 20V/cm范围内，交变电场的波形为正弦波。体系温度维持在37°C。磷酸的浓度是由酸度计测量体系pH值来推算，每间隔5min测定一次pH 值；电刺激持续40min，然后加入酶抑制剂停止反应，并测定终态pH值。酶水解三磷酸腺甙和二磷酸腺甙生成单磷酸腺甙和磷酸。在常规的酶催化条件下，三磷酸腺甙和二磷酸腺甙的水解是自发进行的。电场并不影响反应的化学平衡。但它将通过与活化能垒的相互作用来改变反应速率。对于底物而言的决速步，活化能垒是处于振荡状态的。测定结果表明，磷酸腺甙水解酶的催化活性随着外加交变电场的峰电压的升高而出现先升后降的走势。就是说，电场强度从lV/cm开始，酶催化下的反应速率常数随电场强度的上升而增加。当电场强度达到5V/cm时，反应速率达到极大值。进一步增大电场强度，反应速率反而呈现出下降的趋势。这是由于高场强一旦超过氧化还原反应的电极电位， 便会引发产物的电化学反应，从而干扰了测试结果。另外，磷酸腺甙水解酶的催化活性随着交变电场频率的升高也呈现出一个峰。当频率为6500Hz时，反应速率达到极大值。在磷酸腺甙水解酶催化三磷酸腺甙和二磷酸腺甙的水解过程中，在电场强度5V/cm，频率6500Hz 的正弦交变电场作用下，与无电场刺激相比，其速率常数从1.82ym0l/mg min上升到 2. 94 μ mol/mg -min,酶的活性被刺激升高了 61.5%。而在这一交变电场刺激下无酶的反应体系并没有观察到反应速率的提高。因此可见，电催化可以进一步提高磷酸腺甙水解酶的催化活性，这一效应对电场强度和交变频率具有依赖性。三磷酸腺甙和二磷酸腺甙的水解反应有着很大的自由能驱动，AG大约为-MkT， 所以反应并不需要能量补给。交变电场并不影响反应热力学，只是促进了动力学上反应活化能垒的振荡。本发明的优点在于1.交变电场能够进一步提高水解酶的催化活性。通过电刺激底物更容易向酶分子的活性部位扩散，产物也易于从酶分子中扩散出来。电场同时也对酶构象产生一定的影响。2.本发明所述的方法可对电磁场污染研究，以及电场对细胞和生物体的效应等研究提供实验基础。3.本发明所述的方法可对离子通道的研究提供实验基础。4.本发明所述的方法可对酶催化反应机制的研究提供实验基础。
具体实施例方式实施例1 将来源于马铃薯的三磷酸腺甙/ 二磷酸腺甙酶(等级VI，冻干粉，> 200unit/mg 蛋白质)加入到含0. 1 %非离子表面活性剂NP40和4mM的MgCl2的组氨酸缓冲液中(30mM， PH值为7. 4)。然后，加入4mM的底物三磷酸腺甙钠引发水解反应，利用酸度计每间隔5min 监测记录系统的PH值，用以跟踪磷酸的释放。交变电场的刺激在插有两个钼电极的4mm比色皿中进行，电极连接到函数信号发生器，交变电场的频率为6500Hz，电场强度为5V/cm， 波形为正弦波。体系温度维持在37°C。酶催化反应持续40min，然后加入三氯乙酸停止反应，测定终态。每个数据点是3次测定数据的平均值。相应的反应速率常数来自于用线性最小二乘法回归方法对曲线初始斜率的计算。实施例2 将三磷酸腺甙/ 二磷酸腺甙酶加入到含0. 1 %非离子洗涤剂NP40和4mM的MgCl2 的30mM组氨酸缓冲液中( !1值为7.4)。然后，加入4mM的底物三磷酸腺甙钠甙引发水解反应，利用酸度计每间隔5min监测记录系统的pH值，用以跟踪磷酸的释放。体系温度维持在 37°C。酶催化反应持续40min，然后加入三氯乙酸停止反应，测定终态。每个数据点是3次测定数据的平均值。相应的反应速率常数来自于用线性最小二乘法回归方法对曲线初始斜率的计算，记为无电场刺激的空白反应。实施例3 在含0. 1 %非离子洗涤剂NP40和4mM的MgCl2的30mM组氨酸缓冲液中(pH值为 7. 4)中，加入4mM的底物三磷酸腺甙钠引发水解反应，利用酸度计每间隔5min监测记录系统的PH值，用以跟踪磷酸的释放。交变电场的刺激在插有两个钼电极的4mm比色皿中进行，电极连接到函数信号发生器，交变电场的频率为6500Hz，电场强度为5V/cm，波形为正弦波。体系温度维持在37°C。酶催化反应持续40min，然后加入三氯乙酸停止反应，测定终态。每个数据点是3次测定数据的平均值。相应的反应速率常数来自于用线性最小二乘法回归方法对曲线初始斜率的计算，记为无酶的空白反应。
权利要求
1.一种采用交变电场提高酶水解反应速率的工艺方法，其特征在于所述的工艺方法是在反应器的水解反应中施加一种交变电场，通过刺激底物和产物有机分子在酶活性部位中的运动来促使水解反应速率的提高。
2.根据权利要求1所述的一种采用交变电场提高酶水解反应速率的工艺方法，其特征在于交变电场的外加峰电压为5V，频率为1600Hz，波形为正弦波。
3.根据权利要求1所述的一种采用交变电场提高酶水解反应速率的工艺方法，其特征在于底物有机分子为三磷酸腺甙和二磷酸腺甙，生物催化剂为磷酸腺甙水解酶。
全文摘要
本发明公开了一种采用交变电场刺激酶，用于进一步提高酶催化磷酸腺甙水解反应活性的工艺方法。所述的工艺方法是在电解池中进行水解反应，以5V的峰电压和1600Hz的频率作用于三磷酸腺甙/二磷酸腺甙酶存在下的三磷酸腺甙和二磷酸腺甙水解体系。底物、产物和酶分子在交变电场下被极化和受迫迁移，增大了底物分子进入酶活性部位的概率；同时促进产物分子离开活性部位，从而进一步加速了酶水解反应的速率。实施此方法操作简单、无污染，可在酶工程、电磁污染研究和医学检测方面得到进一步的应用。
文档编号C12N13/00GK102321607SQ20111026435
公开日2012年1月18日 申请日期2011年9月8日 优先权日2011年9月8日
发明者邢达杰, 黄积涛, 黄薇 申请人:南开大学