专利名称：活性污泥中氨氧化菌实时荧光定量pcr检测方法
技术领域：
本发明涉及一种活性污泥中氨氧化菌实时荧光定量PCR检测方法，属于污水生物处理技术领域，用于对污水生物处理系统活性污泥中氨氧化菌的定量检测。
背景技术：
污水生物处理系统内的微生物学研究是污水生物处理中最基本、最重要的内容， 是污水生物处理系统高效稳定运行的保障。传统的微生物学研究方法过于依赖纯培养技术进行菌种分离，该方法对于研究污水生物处理系统内的微生物有一定的局限性。首先，污水生物处理系统内的微生物菌群是由多种微生物构成、具有一定空间分布的聚集体。这些微生物相互依存、相互竞争，具有复杂的种群关系。当进行菌种分离培养后，将无法获取自然条件下微生物菌群结构与空间分布的信息。其次，由于微生物的基因表达和代谢活性受外界环境因素的影响较大，菌种的分离培养将会改变微生物的生理生化特性，从而降低对实际工程实践的指导意义。此外，纯培养需要较长的时间，而且有些菌种(如硝化菌中的 Nitrospira)目前还无法通过纯培养技术实现纯种分离。水体富营养化的日趋严重迫使国家严格控制排放到天然水体的氮、磷浓度，从而使污水生物脱氮除磷新技术和微生物研究成为热点。污水生物脱氮涉及硝化和反硝化两个过程，其中硝化过程的主要功能微生物是硝化菌，包括氨氧化菌(ammonia oxidizing bacteria, A0B)和亚硝酸盐氧化菌(nitrite oxidizing bacteria，NOB)。AOB 作为污水生物脱氮的主要功能微生物之一，在污水生物处理系统内的生物活性和菌群分布的稳定性， 是保证污水生物脱氮系统稳定运行的关键因素。近年来，分子生物技术的快速发展为污水生物处理系统内微生物研究提供了新的分析方法和手段。因此，采用分子生物技术对不同工艺、水质条件下的AOB菌群结构、活性等进行研究分析，能够为污水生物脱氮系统的长期稳定运行提供有力保障。目前，以PCR为代表的分子生物技术在生物学领域得到了广泛应用。PCR是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的分子生物技术。PCR技术解决了从环境样品中提取的DNA 或RNA含量过低而不能进行相关分析的难题。实时荧光定量PCR是在普通PCR基础上诞生的一项新技术，它是通过荧光信号实时监测PCR扩增产物并进行解析的方法，至今已经成为基因定量和表达解析的必要手段。实时荧光定量PCR秉承和发展了普通PCR快速、高灵敏度检出等全部优点，同时克服了普通PCR不能准确定量、容易污染等的不足，可以说实时荧光定量PCR技术发生了质的飞跃，扩展了 PCR技术的应用范畴，是一种具有划时代意义的技术。本发明采用实时荧光定量PCR技术对污水生物处理系统活性污泥中的AOB进行定量检测。本发明在技术上不同于现有技术，主要体现在以下三方面(1)标准品DNA的来源。应用实时荧光定量PCR技术首先要建立标准品DNA含量与达到荧光域值时的循环数Ct值(Threshold Cycle)之间的标准曲线，这就涉及标准品 DNA的来源。现有技术主要是从纯培养的目标菌中提取基因组DNA或是化学合成DNA片段作为标准品。目标菌的纯培养需要较长的时间、费用较高，而且有些活性污泥微生物(如硝化菌中的Nitrospira)目前还无法实现纯培养。化学合成DNA片段作为标准品首先要通过基因测序知道目标基因序列，否则无法合成。而本发明采用的是来自污水处理厂的活性污泥，对活性污泥中的目标菌AOB进行富集培养，然后提取基因组DNA，无需纯培养和目标基因序列。(2)标准品DNA的制备方法。现有技术主要是采用含有目标DNA片段的质粒克隆。 利用质粒克隆建立的标准曲线的重现性好，但其操作较为繁琐，费用较高，对操作者的技术水平要求较高。对于生命科学、生物学、医学领域的技术人员能够达到这样的要求，但对于污水处理厂的技术人员实施起来难度较大，不便于对污水处理厂的日常运行进行监控，从而限制了在污水处理领域的应用。本发明采用基因组DNA两次常规PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳切胶纯化回收产物的方法制备标准品DNA，即能满足检测灵敏度和准确度的要求，又能减化操作，费用相对低廉，具有更强的适用性。(3)定量检测的环境样品。目前，实时荧光定量PCR主要应用于生命科学、医学等领域对病毒、致病菌的检测分析。如果将其应用于污水处理系统主要功能微生物AOB的检测，待测样品为污水处理系统中的活性污泥，样品本身具有极强的特殊性。由于活性污泥受废水污染，其中含有大量未知的有机、无机污染物、颗粒物、杂质等，还有其它与AOB共存于活性污泥中的菌胶团，对DNA的提取纯化干扰较大，并进而影响后续的PCR扩增。因此，活性污泥微生物基因组DNA的提取方法、PCR扩增体系及反应条件需要特殊确定，难度较大。故本发明从富集培养氨氧化菌的活性污泥中提取基因组DNA，采用基因组DNA PCR 扩增片段切胶纯化回收产物法建立检测AOB的实时荧光定量PCR标准曲线，利用建立的标准曲线对污水全程生物脱氮和短程生物脱氮活性污泥中氨氧化菌进行定量检测，国内外未见相关研究报道。本发明为污水生物脱氮系统中主要功能微生物氨氧化菌的定量检测提供了一种经济、简便、可靠的分析方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种经济、简便、可靠的活性污泥中氨氧化菌实时荧光定量PCR检测方法，缩短标准品制备时间，简化操作步骤，并且可同时进行大批量的样本分析。与传统的利用质粒建立标准曲线的方法相比，检测时间明显缩短，可用于污水生物处理系统中氨氧化菌菌群数量的监控和鉴定，具有很好的应用前景。本发明的技术方案一种活性污泥中氨氧化菌实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于提取富集程度在80%以上的氨氧化菌的基因组DNA，经第一次常规PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳后，将含有116个碱基对的凝胶条带切下并提取其中的DNA扩增片段。提取的DNA片段再进行第二次常规PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，将第二次琼脂糖凝胶电泳中含116个碱基对的凝胶条带切下，提取其中的DNA扩增片段作为实时荧光定量PCR检测氨氧化菌数量的标准品，在实时荧光定量PCR仪上进行检测，建立标准曲线。并利用建立的标准曲线对活性污泥中氨氧化菌进行定量检测。上述两次常规PCR扩增体系及反应条件如下
权利要求
1. 一种活性污泥中氨氧化菌实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于提取富集程度在80%以上的氨氧化菌的基因组DNA，经第一次常规PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳后，将含有碱基对的凝胶条带切下并提取其中的DNA扩增片段；提取的DNA片段再进行第二次常规 PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，将第二次琼脂糖凝胶电泳中含碱基对的凝胶条带切下，提取其中的DNA扩增片段作为实时荧光定量PCR检测氨氧化菌数量的标准品，在实时荧光定量PCR 仪上进行检测，建立标准曲线；并利用建立的标准曲线对活性污泥中氨氧化菌进行定量检测；上述两次常规PCR扩增体系及反应条件如下组分体积无菌双蒸水37.75含Mg2+的10倍PCR反应缓冲液5脱氧核糖核苷酸dNTP (2.5 mM)4正向引物 CT0189fA/B 和 CT0189fC1(10umol/L)1反向引物 RTlr (10umol/L)1Taq 酶(5υ/μ1 )0.25DNA模板1总体积50上述常规PCR扩增条件如下94°C下预处理3min ；30个循环反应，每个循环包括95°C 45s,58°C 30s,72°C 45s ；最后 72°C 4min ；上述琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖质量百分比浓度为3%，电泳电压为75V，电泳时间为 90min ；上述实时荧光定量PCR扩增反应体系及反应条件为组分体积无菌双蒸水8.5正向引物 CT0189fA/B 和 CT0189fC (10umol/L) 0.75反向引物 RTlr (10umol/L)0.75探针 TMPl (3.125umol/L)1日本宝生物公司合成的Rox reference II0.52 倍 Taq 酶12.5DNA模板1总体积25扩增条件为95°C 30s ；40个循环反应，每个循环包括95°C 5s, 60°C 20s ； 上述正向引物CT0189fA/B和CT0189fC按摩尔比2 1混合。
全文摘要
本发明涉及活性污泥中氨氧化菌实时荧光定量PCR检测方法，属于污水生物处理技术领域，用于对污水处理厂活性污泥中的氨氧化菌的定量检测。目前，研究者多是采用等梯度稀释含有目标DNA片段的质粒制备标准品，进而建立定量标准曲线，但操作较为繁琐且成本较高。本发明采用基因组PCR扩增片段切胶纯化回收产物法建立检测氨氧化菌的实时荧光定量PCR标准曲线，初始模板数的对数与荧光域值的循环数Ct值之间呈现较好的线性关系，相关系数为0.999。利用建立的标准曲线对活性污泥中氨氧化菌进行定量检测。本发明为污水生物脱氮系统中主要功能微生物氨氧化菌的定量检测提供了一种经济、简便、可靠的分析方法。
文档编号C12R1/01GK102329874SQ201110305190
公开日2012年1月25日 申请日期2011年10月10日 优先权日2011年10月10日
发明者彭永臻, 曾薇, 李博晓, 李磊, 王向东 申请人:北京工业大学