专利名称：构建体、重组细胞及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域。具体地涉及一种构建体、重组细胞以及该重组细胞的用途。
背景技术：
芳香族化合物是一种具有苯环结构的化合物，它们结构稳定，不易分解，而且多种芳香族化合物具有致癌、致畸和致突变的效应，对人体健康和生态环境造成很大危害。这些污染物主要来源于石油、化工、农药、电子、纺织、造纸、化妆品及制药工业等，它们会通过多种途径进入环境，对水体、土壤和大气造成污染。因而，对于芳香族的检测是重要的。目前，对于芳香族化合物的测定通常采用分光光度法、高效液相色谱法和气相色谱法等。然而，采用分光光度法进行检测时，对样本质量的高要求以及光干扰物质的存在， 使得该方法的精确度低，并且应用范围小。关于液相和气相色谱检测，检测前需要对样品分离，分离过程通常需要繁琐和耗时的预处理，并且实施该方法的检测仪器昂贵，不方便携带，不能进行实时检测。因而，目前对芳香族化合物的检测有待改进。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个方面提供了一种构建体。根据本发明的实施例，该构建体包括第一核酸序列，所述第一核酸序列包括编码报告蛋白的序列，所述报告蛋白具有可检测的活性；以及第二核酸序列和第三核酸序列，所述第二和第三核酸序列分别位于所述第一核酸序列的5’侧和3’侧，所述第二核酸序列和第三核酸序列不同，并且分别独立地为宿主细胞芳香族化合物降解途径特异性基因的非功能片段。由于该构建体中含有的第二核酸序列和第三核酸序列不同，并且所述第二核酸序列和第三核酸序列分别独立地为宿主细胞芳香族化合物降解途径特异性基因的非功能片段，因此可以借助该构建体，将第一核酸序列引入宿主细胞中，构建重组细胞。进一步，第一核酸序列将受到宿主细胞芳香族化合物降解途径特异性基因调控机制的控制，从而可以利用该调控机制对芳香族化合物的应答机制， 通过所表达报告蛋白的活性的检测，实现对芳香族化合物进行检测。另外，根据本发明的实施例，上述构建体还可以具有如下附加的技术特征根据本发明的一个实施例，所述报告蛋白为选自发光蛋白、荧光蛋白、酶的至少一种。由此，可以根据常规的方法，对所述报告蛋白进行监测。根据本发明一些示例，所述报告蛋白为发光蛋白。可以通过对发光蛋白所发出的光进行检测实现对芳香族化合物的检测， 并且容易对发光蛋白的表达量进行定量，得到芳香族化合物的定量检测结果。根据本发明的一些示例，所述报告蛋白为LuxCDABE。由此，可以不需要借助特殊的仪器，就能够实现对报告蛋白的表达进行确定。根据本发明的一个实施例，所述第二和第三核酸序列分别独立地为邻苯二酚降解途径特异性基因的非功能片段。由此，可以通过邻苯二酚降解途径特异性基因的调控机制， 实现对多种芳香族化合物的检测。根据本发明的一些示例，所述第二和第三核酸序列分别独立地为catB基因的非功能片段。由此，可以高效、灵敏地对多种芳香族化合物进行检测。 根据本发明的一些示例，所述第二核酸序列和第三核酸序列分别为由如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示的序列构成。由此，可以提高构建体与宿主细胞基因组发生重组的效率。根据本发明的 一个实施例，所述宿主细胞为选自细菌细胞、真菌细胞、植物细胞和动物细胞的至少一种。根据本发明的一些示例，所述宿主细胞为细菌细胞。由此，能够得到重组细菌细胞，并且进一步提高重组细胞检测芳香族化合物的效率。根据本发明的示例，所述宿主细胞优选为不动杆菌(Acinetobacter baylyi)，最优选不动杆菌(Acinetobacter baylyi)ADPl。由此，可以实现高效、灵敏地检测芳香族化合物。根据本发明的一个实施例，进一步包括第四核酸序列，所述第四核酸序列位于所述第二核酸序列与所述第一核酸序列之间，并且包括宿主细胞芳香族化合物降解途径特异性基因的启动子，所述启动子与所述第一核酸序列可操纵地连接。由此，可以提高所获得的重组细胞对芳香族化合物的应答效率。根据本发明的一些示例，所述第四核酸序列包括邻苯二酚降解途径特异性基因的启动子，更优选包括catB基因的启动子。由此，所得到的重组细胞能够对多种芳香族化合物作出应答，进而提高利用重组细胞检测芳香族化合物的应用范围。根据本发明的一个实施例，进一步包括第五核酸序列，所述第五核酸序列位于所述第四核酸序列与所述第二核酸序列之间，并且编码调节蛋白，所述调节蛋白对于所述启动子是特异性的。由此，可以利用构建体为重组细胞提供调节蛋白，从而提高了所获得的重组细胞对芳香族化合物的应答效率。根据本发明的一些示例，所述第五核酸序列编码CatR 调节蛋白。由此，所得到的重组细胞能够对多种芳香族化合物作出应答，进而提高利用重组细胞检测芳香族化合物的应用范围。根据本发明的一个实施例，进一步包括筛选标记基因。由此，便于筛选重组细胞。 根据本发明的一些示例，所述筛选标记基因为药物抗性基因。由此，容易地通过重组细胞的抗药性来进行筛选。根据本发明的具体示例，所述筛选标记基因为卡那霉素抗性基因。由此，能够进一步提高筛选重组细胞的效率。在本发明的另一方面，提供了一种重组细胞。根据本发明的实施例的重组细胞包括第一核酸序列，所述第一核酸序列包括编码报告蛋白的序列，所述报告蛋白具有可检测的活性；以及芳香族化合物降解途径特异性基因的启动子，所述启动子位于所述第一核酸序列的5’侧，并且与所述第一核酸序列可操纵地相连。由于在该重组细胞中第一核酸序列的转录在芳香族化合物降解途径特异性基因的启动子的控制下，因而，在芳香族化合物存在的情况下，第一核酸序列的转录会被启动，从而表达报告蛋白，进而可以通过检测报告蛋白的活性，获得样本中芳香族化合物的信息。另外，根据本发明的实施例，上述重组细胞还可以具有如下附加的技术特征根据本发明的一个实施例，所述报告蛋白为选自发光蛋白、荧光蛋白、酶的至少一种。由此，可以根据常规的方法，对所述报告蛋白进行监测。根据本发明一些示例，所述报告蛋白为发光蛋白。可以通过对发光蛋白所发出的光进行检测实现对芳香族化合物的监测， 并且容易对发光蛋白的表达量进行定量，得到芳香族化合物的定量检测结果。根据本发明的一些示例，所述报告蛋白LuxCDABE。由此，可以不需要借助特殊的仪器，就能够实现对报告蛋白的表达进行确定。根据本发明的一个实施例，所述重组细胞包括邻苯二酚降解途径特异性基因的启动子，更优选包括catB基因的启动子。由此，所得到的重组细胞能够对多种芳香族化合物作出应答，进而提高利用重组细胞检测芳香族化合物的应用范围。根据本发明的一个实施例，所述重组细胞为选自细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、 植物细胞和动物细胞的至少一种。根据本发明的一些示例，所述重组细胞为细菌细胞。由此，能够进一步提高重组 细胞检测芳香族化合物的效率。根据本发明的示例，所述宿主细胞优选为不动杆菌(Acinetobacter baylyi),更优选不动杆菌(Acinetobacter baylyi) ADPl，最优选按照保藏号CCTCC M 2011270保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国湖北省武汉市武汉大学)的重组细胞不动杆菌(Acinetobacter baylyi)ADPl-Cat。由此， 利用重组细胞可以实现高效、灵敏地检测芳香族化合物。根据本发明的一个实施例，进一步包括第五核酸序列，所述第五核酸序列包括编码调节蛋白的序列，所述调节蛋白对于所述启动子是特异性的。由此，可以利用调节蛋白提高所获得重组细胞对芳香族化合物的应答效率。根据本发明的一些示例，所述第五核酸序列编码CatR调节蛋白。由此，所得到的重组细胞能够对多种芳香族化合物作出应答，进而提高利用重组细胞检测芳香族化合物的应用范围。本发明的又一方面提供了一种制备上述重组细胞的方法。根据本发明的实施例， 制备上述重组细胞的方法包括使用根据本发明的实施例的构建体转化宿主细胞。根据本发明的实施例，还可以包括借助构建体上所包含的筛选标记基因，从经过转化的细胞中筛选发生同源重组的宿主细胞，从而可以提高获得重组细胞的效率。本发明的再一方面提供了一种检测样本中芳香族化合物的方法。根据本发明的实施例，检测样本中芳香族化合物的方法包括下列步骤将所述样本与根据本发明实施例的重组细胞接触；将所述重组细胞在适于所述报告蛋白表达的条件下进行培养；以及检测所述报告蛋白的活性。根据本发明的方法，能够有效地对样本中的芳香族化合物进行检测。另外，根据本发明的实施例，上述检测样本中芳香族化合物的方法还可以具有如下附加的技术特征根据本发明的一个实施例，重组细胞处于适于报告蛋白表达的培养基中，更优选所述重组细胞处于适于报告蛋白表达的液体培养基中。由此，可以在将重组细胞与待测样本接触后，原位即可对重组细胞进行培养，由此，可以提高检测效率。根据本发明的一个实施例，可以对所述报告蛋白的活性进行定量检测。由此，能够实现对样本中芳香族化合物进行定量检测。根据本发明的一个实施例，所述芳香族化合物为选自水杨酸、苯甲酸和邻苯二酚的至少一种，更优选所述芳香族化合物为邻苯二酚。根据本发明的实施例的检测样本中芳香族化合物的方法能够对这些芳香族化合物进行十分有效地检测。根据本发明的一个实施例，进一步包括将所述报告蛋白的活性与预定的芳香族化合物浓度标准曲线进行比较，以确定所述样本中芳香族化合物的含量。由此，能够有效地通过检测报告蛋白的活性来确定样本中芳香族化合物的含量。根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种用于检测样本中芳香族化合物的试剂盒。根据本发明的实施例，用于检测样本中芳香族化合物的试剂盒包括根据本发明的上述重组细胞以及适于报告蛋白表达的培养基。利用根据本发明的实施例的用于检测样本中芳香族化合物的试剂盒，能够有效地对样本中的芳香族化合物进行检测。根据本发明一些示例，所述重组细胞呈选自干粉、固定在载体上或者悬浮液至少一种的状态。根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种用于检测样本中芳香族化合物的系统。根据本发明的实施例，用于检测样本中芳香族化合物的系统包括反应模块，所述反应模块内设置有根据本发明的上述重组细胞，以便与待检测的样品接触，并启动所述重组细胞表达报告蛋白；以及报告蛋白活性检测模块，用于对所述重组细胞所表达的报告蛋白 的活性进行检测。利用根据本发明实施例的用于检测样本中芳香族化合物的系统，能够利用报告蛋白活性对样本中的芳香族化合物的响应，有效地对样本中的芳香族化合物进行检测。另外，根据本发明的实施例，上述用于检测样本中芳香族化合物的系统还可以具有如下附加的技术特征根据本发明的一个实施例，所述芳香族化合物可以为选自水杨酸、苯甲酸和邻苯二酚的至少一种，更优选所述芳香族化合物为邻苯二酚。根据本发明的实施例的检测样本中芳香族化合物的系统能够对这些芳香族化合物进行十分有效地检测。 根据本发明的一个实施例，还可以进一步包括数据处理模块，所述数据处理模块内预存有芳香族化合物浓度标准曲线，并且所述数据处理模块与所述报告蛋白活性检测模块相连，所述数据处理模块根据所述报告蛋白活性的检测结果得到量化的芳香族化合物检测结果；和任选地显示模块，所述显示模块与所述数据处理模块相连，用于显示所述芳香族化合物检测结果。由此，通过将定量检测的报告蛋白活性与标准曲线进行比较，可以有效地获得样本中芳香族化合物的含量，并且可以将结果输出。根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种筛选具有降解芳香族化合物活性的制剂的方法。根据本发明的实施例，筛选具有降解芳香族化合物活性的制剂的方法包括下列步骤将含有芳香族化合物的样本与怀疑具有降解芳香族化合物活性的制剂以及根据本发明的上述重组细胞接触，并测定所述重组细胞的报告蛋白活性，得到第一活性；将含有芳香族化合物的样本在不存在所述制剂时与所述重组细胞接触，并测定所述重组细胞的报告蛋白活性，得到第二活性；第一活性低于所述第二活性是所述制剂具有降解芳香族化合物活性的指示。报告蛋白的活性可以反映样本中芳香族化合物的含量，如果第一活性低于第二活性，则说明在与怀疑具有降解芳香族化合物活性的制剂接触后，含有芳香族化合物的样本中芳香族化合物的含量得到降低，进而证明制剂具有降解芳香族化合物的活性。另外，根据本发明的实施例，上述筛选具有降解芳香族化合物活性的制剂的方法还可以具有如下附加的技术特征根据本发明的一个实施例，所述芳香族化合物为选自水杨酸、苯甲酸和邻苯二酚的至少一种，更优选所述芳香族化合物为邻苯二酚。利用根据本发明实施例的方法，能够有效地筛选可以降解这些芳香族化合物的制剂。根据本发明的一个实施例，可以将所述含有芳香族化合物的样本与所述怀疑具有降解芳香族化合物活性的制剂以及所述重组细胞在适于所述报告蛋白表达的培养基中进行混合，并实时检测所述芳香族化合物含量的变化。由此，可以通过实时检测所述芳香族化合物含量的变化，来反映所述制剂是否具有降解芳香族化合物的活性。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。生物材料保藏说明 在本发明实施例1中的所构建的重组细胞不动杆菌(Acinetobacter baylyi) ADPl-Cat已经于2010年7月27日按照保藏号CCTCC M 2011270保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国湖北省武汉市武汉大学)。
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中图1是根据本发明实施例的构建体的结构示意图；图2是不动杆菌(Acinetobacter baylyi)ADPl中芳香族化合物的代谢路线示意图；图3是根据本发明又一实施例的构建体的结构示意图；图4是根据本发明一个实施例的用于检测芳香族化合物的系统的示意图；图5是根据本发明又一个实施例的用于检测芳香族化合物的系统的示意图；图6是根据本发明实施例1构建的重组细胞不动杆菌(Acinetobacter baylyi) ADPl-Cat的部分染色体示意图；图7是根据本发明一个实施例，在暗室中拍摄的邻苯二酚诱导重组菌的发光照片，从上至下，邻苯二酚标准品的浓度依次为0、0. 001,0. 01,0. l、lmM。图8-图10分别根据本发明一个实施例，为不同浓度的邻苯二酚(图8)、水杨酸 (图9)和苯甲酸(图10)标准样品处理不动杆菌(Acinetobacter baylyi)ADPl-Cat后，不动杆菌(Acinetobacter baylyi)ADPl-Cat发光强度随时间变化的曲线。图11为根据本发明一个实施例，将不动杆菌(Acinetobacter baylyi)ADPl-Cat 对环境样品中芳香族化合物含量(地表水)检测的结果。图12显示了根据本发明的一个实施例，利用纯水和水库水作为溶剂配制的邻苯二酚样品，检测不动杆菌(Acinetobacter baylyi)ADPl-Cat响应的结果比较。
具体实施例方式下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，一体地连接，也可以是可拆卸连接；可以是机械连接或电连接，也可以是两个元件内部的连通；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语的具体含义。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。术语“第一”、“第二”等仅用于方便描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。构津体 根据本发明的一个方面，本发明提出了一种用于构建重组细胞的构建体。参考图 1，根据本发明的实施例的构建体包括第一核酸序列、第二核酸序列和第三核酸序列。其中， 第一核酸序列包括编码报告蛋白的序列，并且根据本发明的实施例，报告蛋白具有可检测的活性。第二核酸序列和第三核酸序列分别位于第一核酸序列的5’侧和3’侧，并且第二核酸序列和第三核酸序列的序列不同，第二核酸序列和第三核酸序列分别独立地为宿主细胞芳香族化合物降解途径特异性基因的非功能片段。由于该构建体中含有的第二核酸序列和第三核酸序列不同，并且分别独立地为宿主细胞芳香族化合物降解途径特异性基因的非功能片段，因此，在将构建体引入宿主细胞中后，第二核酸序列和第三核酸序列能够与宿主细胞基因组上的相应基因序列发生重组，从而，可以通过同源重组机制，将第一核酸序列引入到宿主细胞的基因组中，使得第一核酸序列能够处于宿主细胞芳香族化合物降解途径特异性基因的调控机制的控制下。由此，在将重组细胞与芳香族化合物进行接触后，芳香族化合物会启动相应的基因调控机制，从而启动第一核酸序列转录和表达，进而表达相应的报告蛋白，实现通过对报告蛋白的表达进行检测来实现对芳香族化合物的检测，并且能够通过对报告蛋白进行定量检测来实现对芳香族化合物的定量检测。根据本发明的实施例，第一核酸序列中并不包含报告蛋白的表达启动子，因而，报告蛋白的表达完全受控于芳香族化合物降解途径特异性基因的调控机制，进而，可以提高所获得重组细胞检测芳香族化合物的精确度和灵敏度。在本发明中所使用的术语“构建体”是指这样的一种遗传载体，其包含特定核酸序列，并且能够将目的核酸序列转入宿主细胞中与宿主细胞的基因组发生同源重组以获得重组细胞。根据本发明的实施例，构建体的形式不受特别限制。根据本发明的实施例，其可以为质粒、噬菌体、人工染色体、粘粒(Cosmid)、病毒的至少一种。根据本发明的具体示例，构建体呈质粒的形式。质粒作为遗传载体，具有操作简单，可以携带较大片段的性质，便于操作和处理。质粒的形式也不受特别限制，既可以是环形质粒，也可以是线性质粒，即可以是单链的，也可以是双链的。本领域技术人员可以根据需要进行选择。在本发明中所使用的术语“5’侧”可以与“上游”互换使用，“3’侧”可以与“下游” 互换使用。第二核酸序列和第三核酸序列分别位于第一核酸序列的5’侧和3’侧，即指的是第二核酸序列和第三核酸序列分别位于第一核酸序列的上游和下游，可以是分别独立地与第一核酸序列直接相连，即分别紧邻设置在第一核酸序列的5’末端和3’末端，也可以是通过媒介物，例如核酸接头序列与第一核酸序列相连。在本发明中所使用的术语“核酸”可以是任何包含脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于经过修饰的或者未经修饰的DNA、RNA，其长度不受任何特别限制。对于用于构建重组细胞的构建体，优选所述核酸为DNA，因为DNA相对于RNA而言，其更稳定，并且易于操作。在本发明中所使用的术语“报告蛋白”是指这样的一种蛋白质，其在表达后，能够产生可以直接或者间接检测的信号，进而能够反映芳香族化合物是否启动了相应的调节机制。根据本发明的实施例，报告蛋白的种类并不受特别限制，只要其具有可检测的活性即可。根据本发明的实施例，报告蛋白可以是一种能够产生光学信号的蛋白质例如发光蛋白或者荧光蛋白例如绿色荧光蛋白等。或者报告蛋白可以是一种能够与底物相互作用以产生可检测信号的酶，例如IacZ基因编码的β _半乳糖苷酶。β -半乳糖苷酶能催化一系列底物转化成极易检测的不同颜色的产物。但是IacZ在细胞内表达本底较高，并且检测需要破碎细胞壁，从而限制了其应用。因而，根据本发明的一些实施例，报告蛋白可以为选自发光蛋白、荧光蛋白、酶的至少一种。由此，可以根据常规的方法，对所述报告蛋白进行监测。例如可以采用比色法、荧光法、生物发光法、化学发光法、酶联免疫法(ELISA)及原位染色法对报告蛋白进行检测。这其中，优选发光蛋白，因为发光蛋白能够发出特定波长的光，因而能够容易对发光蛋白进行检测，并且容易对其进行定量检测。根据本发明的实施例，发光蛋白的种类并不受到特别限制，根据本发明的具体示例，最优选所采用的发光蛋白是LuxCDABE， 编码LuxCDABE的LuxCDABE基因可从许多发光菌中克隆获得。申请人发现，采用LuxCDABE 作为报告蛋白，其活性容易检测，通过肉眼就能够对LuxCDABE进行检测并且能够与多种宿主细胞兼容，当LuxCDABE基因整合到宿主细胞例如不动杆菌的基因组上时，宿主细胞上的其他基因的表达并不会干扰报告蛋白的表达，并且LuxCDABE基因的表达也不会干扰宿主细胞其他基因的表达和功能。当然，本领域技术人员能够理解的是，还可以采用本领域技术人员已知的其他发光蛋白，例如可以采用LuxAB作为报告蛋白，LuxAB具有荧光脂酶活性，其在长链脂肪醛、还原型黄素单核苷酸(FMNH2)及O2存在时催化脂肪醛氧化，生成脂肪酸等产物，同时产生波长约490nm的蓝绿色生物光。但这些报告蛋白的检测条件相对于 LuxCDABE而言比较苛刻，例如IuxAB作为报告蛋白，在检测发光时需要破壁，并且添加底物脂肪醛如癸醛等，而LuxCDABE作为报告蛋白，其检测在细胞原位状态即可完成，简单方便， 并且能够实现对芳香族化合物的连续、实时检测。本领域技术人员能够理解的是，可以采用多种报告蛋白的组合来对芳香族化合物进行检测，例如可以采用这样的一种核酸序列作为第一核酸序列，该核酸序列串联了多种发光蛋白的编码核酸序列，在芳香族化合物的启动下，能够表达多种发光蛋白。 根据本发明的实施例，第二核酸序列和第三核酸序列的种类不受特别限制，只要能够介导构建体 与宿主细胞的基因组发生同源重组即可。在本发明中所使用的术语“宿主细胞芳香族化合物降解途径特异性基因”是指在宿主细胞中芳香族化合物降解途径中特有的基因，由此能够将第一核酸序列整合到芳香族化合物降解途径中特定基因所在的位置， 从而受到芳香族化合物途径中特定基因的调控机制的控制，进而提高重组细胞对芳香族化合物应答的特异性，以提高检测芳香族化合物的精确度和灵敏度。本发明中所使用的术语 “非功能片段”应做广义理解，其是指这样的一种片段，该片段一方面可以通过与宿主细胞基因组中的相应位点发生同源重组将第一核酸序列整合到宿主细胞的基因组中，另一方面该片段在宿主细胞中并不会表达或者表达所生成的产物并不会影响第一核酸序列所编码的报告蛋白的活性，从而能够提高利用重组细胞检测芳香族化合物的精确度和灵敏度。根据本发明的实施例，宿主细胞芳香族化合物降解途径特异性基因的类型并不受特别限制， 根据本发明的一些示例，第二和第三核酸序列分别独立地为邻苯二酚降解途径特异性基因的非功能片段。在众多宿主细胞中，邻苯二酚是各种芳香族化合物降解途径中的共同中间产物，例如图3示出了不动杆菌(Acinetobacter baylyi)ADPl中芳香族化合物的代谢路线示意图。由此，可以通过邻苯二酚降解途径特异性基因的调控机制，实现对多种芳香族化合物的检测。根据本发明的一些示例，第二和第三核酸序列分别独立地为catB基因的非功能片段。catB基因是邻苯二酚降解途径中的特有基因，并且是邻苯二酚降解进入三羧酸循环代谢途径的关键基因，因而，可以高效、灵敏地对多种芳香族化合物进行检测。根据本发明的实施例，第二核酸序列与第三核酸序列的长度并不受特别限制，只要能够足以发生同源重组即可。根据本发明的一些示例，第二和第三核酸序列分别为由如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示的序列构成。申请人发现，当采用SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示的序列构成第二核酸序列和第三核酸序列时，宿主细胞中发生同源重组的概率得到极大提高，并且采用这两种核酸序列所得到的重组细胞，其检测芳香族化合物的效率得到显著提高，尤其是可以用于检测邻苯二酚、水杨酸和/或苯甲酸。在本发明中所使 用的术语“宿主细胞”应做广义理解，其是任何能够与构建体发生同源重组，并且能够在外加芳香族化合物的调控下表达活性报告蛋白的细胞或者亚细胞组分，可以是天然细胞，也可以是人工构建的细胞。根据本发明的实施例，宿主细胞的种类并不受特别限制，根据本发明的一个实施例，所述宿主细胞为选自细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、植物细胞和动物细胞的至少一种。这些宿主细胞能够自主地代谢芳香族化合物，因而可以直接用于检测芳香族化合物。根据本发明的一些示例，所述宿主细胞为细菌细胞。细菌细胞扩增快，培养容易，并且容易通过常规方法进行遗传操作得到重组细菌细胞，进而进一步提高重组细胞检测芳香族化合物的效率。根据本发明的示例，所述宿主细胞优选为不动杆菌(Acinetobacter baylyi)，最优选不动杆菌(Acinetobacter baylyi)ADPl。发明人 RMr^MfM (Acinetobacter baylyi) ；fc胃if云力木干胃(Acinetobacter baylyi)ADPl 菌株对芳香族化合物的应答非常灵敏，因而，利用不动杆菌(Acinetobacter baylyi)尤其是不动杆菌(Acinetobacter baylyi) ADPl构建的重组细胞可以实现更高效、灵敏地检测芳香族化合物。根据本发明的实施例，构建体还可以存在其他的元件，以便于构建重组细胞，或者便于提高重组细胞检测芳香族化合物的效率。参考图3，根据本发明的一个实施例，构建体可以进一步包括第四核酸序列。该第四核酸序列位于第二核酸序列与第一核酸序列之间，并且包括宿主细胞芳香族化合物降解途径特异性基因的启动子，所述启动子与所述第一核酸序列可操纵地连接。在本发明中所使用的术语“启动子”指的是这样一种核酸序列，其能够指导与其可操纵地连接的核酸分子的转录。在本发明中所使用的术语“可操纵地”指的是核酸表达控制序列例如启动子、信号序列、增强子等与目标核酸序列之间的功能连接，其中当合适的分子例如转录活化分子与表达控制序列结合时，表达控制序列影响着对应于目标核酸序列的核酸的转录和/或翻译。由此，可以直接通过构建体在宿主细胞中引入特定的启动子，并且该启动子可以用于启动第一核酸序列的转录和表达，由此，可以提高所获得的重组细胞对芳香族化合物的应答效率，并且扩大了宿主细胞的选择范围。根据本发明的一些示例，第四核酸序列包括邻苯二酚降解途径特异性基因的启动子，更优选包括catB基因的启动子。关于邻苯二酚降解途径特异性基因尤其是catB基因的特点，前面已经进行了详细地描述，在此不再赘述。申请人发现，正如在本申请实施例2和3所示的，当采用如SEQ ID NO :3所示核酸序列构成的启动子时，所得到的重组细胞能够具有显著突出的检测灵敏度和精确度，能够精确地检测出低至0. OlmM或者0. llmg/L的芳香族化合物。另外，根据本发明的实施例2和4所示的，利用根据本发明实施例构建体所构建的重组细胞针对芳香族化合物尤其是邻苯二酚，具有响应特异性，参见图12。需要说明的是，该第四核酸序列位于第二核酸序列与第一核酸序列之间的设置方式并不受特别限制，既可以是分别独立地直接地或者间接地与第一核酸序列和第二核酸序列相连。 根据本发明的一个实施例，构建体可以进一步包括第五核酸序列(图中未示出)。 第五核酸序列位于第四核酸序列与所述第二核酸序列之间，并且编码调节蛋白，调节蛋白对于启动子是特异性的。这里所使用的术语“调节蛋白”是指这样的一种蛋白质，其能够启动在芳香族降解途径特异性基因启动子控制下的核酸序列的表达。由此，可以利用构建体为重组细胞提供调节蛋白，从而提高了所获得的重组细胞对芳香族化合物的应答效率，并且扩大了宿主细胞的选择范围。根据本发明的一些示例，所述第五核酸序列编码CatR调节蛋白。通常在宿主细胞中，例如在不动杆菌中，邻苯二酚在catA编码的邻苯二酚1，2_双加氧酶的作用下生成顺顺_粘康酸，调控基因catR受顺顺-粘康酸诱导，可激活catB的转录。申请人发现当采用包含编码CatR调节蛋白的第五核酸序列的构建体，将报告基因整合入宿主细胞的基因组中后，所得到重组细胞对芳香族化合物检测的精确度和灵敏度得到显著提高，并且由此所得到的重组细胞能够对多种芳香族化合物作出应答，进而提高利用重组细胞检测芳香族化合物的应用范围。根据本发明的一个实施例，进一步包括筛选标记基因(图中未示出)。在本发明中所使用的术语“筛选标记基因”指的是这样的一种基因，其编码的产物能够赋予连同载体接受该基因的细胞一种特殊的性质，该特殊的性质使得接受该基因的细胞与未接受该基因的细胞很容易被区分开。由此，便于筛选重组细胞。根据本发明的实施例，筛选标记基因的类型不受特别限制，根据本发明的一些示例，所述筛选标记基因为药物抗性基因。由此，容易地通过重组细胞的抗药性来进行筛选，例如在培养基中添加杀菌剂例如青霉素、卡那霉素等，则相应连同载体接受并表达杀菌剂抗性基因的细胞将在培养基上能够存活下来。根据本发明的具体示例，所述筛选标记基因为卡那霉素抗性基因。由此，能够进一步提高筛选重组细胞的效率。上面对根据本发明实施例的构建体进行了描述。当然，本领域技术人员能够理解的，构建体还可以包含其他常规的元件以促进构建体被转入宿主细胞中并且整合到宿主细胞的基因组上，正常发挥功能，例如复制起点、多克隆位点等。在此对这些元件不再赘述。重组细胞在本发明的另一方面，提供了一种重组细胞。根据本发明的实施例的重组细胞包括第一核酸序列以及芳香族化合物降解途径特异性基因的启动子。其中，第一核酸序列包括编码报告蛋白的序列，所述报告蛋白具有可检测的活性；以及芳香族化合物降解途径特异性基因的启动子位于第一核酸序列的5’侧，并且该芳香族化合物降解途径特异性基因的启动子与所述第一核酸序列可操纵地相连。因而，在重组细胞中，第一核酸序列的转录在芳香族化合物降解途径特异性基因的启动子的控制下，进而在芳香族化合物存在的情况下， 第一核酸序列的转录会被启动，从而表达报告蛋白，进而可以通过检测报告蛋白的活性，获得样本中芳香族化合物的信息。除非特别说明，在重组细胞的描述中所采用的术语的理解应与在前面关于构建体的描述中进行详细解释的术语的含义相同，在此不再赘述。如同构建体，根据本发明的实施例，重组细胞所编码的报告蛋白的种类并不受特别限制，只要其具有可检测的活性即可。在根据本发明的一个实施例，报告蛋白为选自发光蛋白、荧光蛋白、酶的至少一种。由此，可以根据常规的方法，对所述报告蛋白进行监测。根据本发明一些示例，所述报告蛋白为发光蛋白。可以通过对发光蛋白所发出的光进行检测实现对芳香族化合物的监测，并且容易对发光蛋白的表达量进行定量，得到芳香族化合物的定量检测结果。根据本发明的一些示例，所述报告蛋白为LuxCDABE。申请人发现，采用 LuxCDABE作为报告蛋白，其活性容易检测，通过肉眼就能够对LuxCDABE进行检测并且能够与多种宿主细胞兼容，当LuxCDABE基因整合到宿主细胞例如不动杆菌的基因组上时，宿主细胞上的其他基因的表达并不会干扰报告蛋白的表达，并且LuxCDABE基因的表达也不会干扰宿主细胞其他基因的表达和功能。当然，本领域技术人员能够理解的是，还可以采用本领域技术人员已知的其他发光蛋白，例如可以采用LuxAB作为报告蛋白，LuxAB具有荧光脂酶活性，其在长链脂肪醛、还原型黄素单核苷酸(FMNH2)及O2存在时催化脂肪醛氧化，生成脂肪酸等产物，同时产生波长约490nm的蓝绿色生物光。但这些报告蛋白 的检测条件相对于LuxCDABE而言比较苛刻，例如IuxAB作为报告蛋白，在检测发光时需要破壁，并且添加底物脂肪醛如癸醛等，而LuxCDABE作为报告蛋白，其检测在细胞原位状态即可完成，简单方便，并且能够实现对芳香族化合物的连续、实时检测。本领域技术人员能够理解的是，可以采用多种报告蛋白的组合来对芳香族化合物进行检测，例如可以采用这样的一种核酸序列作为第一核酸序列，该核酸序列串联了多种发光蛋白的编码核酸序列，在芳香族化合物的启动下，能够表达多种发光蛋白。根据本发明的实施例，重组细胞中芳香族化合物降解途径特异性基因的类型并不受特别限制，根据本发明的一些示例，重组细胞包括邻苯二酚降解途径特异性基因的启动子，更优选包括catB基因的启动子。在众多细胞中，邻苯二酚是各种芳香族化合物降解途径中的共同中间产物，例如图2示出了不动杆菌(Acinetobacter baylyi)ADPl中芳香族化合物的代谢路线示意图。由此，可以通过邻苯二酚降解途径特异性基因的调控机制，实现对多种芳香族化合物的检测。所得到的重组细胞能够对多种芳香族化合物作出应答，进而提高利用重组细胞检测芳香族化合物的应用范围。catB基因是邻苯二酚降解途径中的特有基因，并且是邻苯二酚降解进入三羧酸循环代谢途径的关键基因，因而，可以高效、灵敏地对多种芳香族化合物进行检测。在本发明中所使用的术语“重组细胞”应做广义理解，其是指相对于天然存在的细胞，基因组发生改变的细胞，可以是完整细胞，也可以是亚细胞组分，可以是天然细胞，也可以是人工构建的细胞，只要能够在外加芳香族化合物的调控下表达活性报告蛋白。根据本发明的实施例，重组细胞的种类并不受特别限制，根据本发明的一个实施例，所述重组细胞为选自细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、植物细胞和动物细胞的至少一种。这些细胞能够自主地代谢芳香族化合物，因而可以直接用于检测芳香族化合物。根据本发明的一些示例，所述重组细胞为细菌细胞。细菌细胞扩增快，培养容易，并且容易通过常规方法进行遗传操作得到重组细菌细胞，进而进一步提高重组细胞检测芳香族化合物的效率。根据本发明的示例，所述宿主细胞优选为不动杆菌(Acinetobacter baylyi)，最优选不动杆菌 (Acinetobacter baylyi)ADPl。发明人发现，不动杆菌(Acinetobacter baylyi)尤其是不动杆菌(Acinetobacter baylyi) ADPl菌株对芳香族化合物的应答非常灵敏，因而，利用不动杆菌(Acinetobacter baylyi)尤其是不动杆菌(Acinetobacter baylyi) ADPl 构建的重组细胞可以实现更高效、灵敏地检测芳香族化合物。根据本发明的实施例，重组细胞还可以存在其他的元件，以便提高检测芳香族化合物的效率。根据本发明的一个实施例，进一步包括第五核酸序列，所述第五核酸序列包括编码调节蛋白的序列，所述调节蛋白对于所述启动子是特异性的。由此，可以利用调节蛋白提高所获得重组细胞对芳香族化合物的应答效率。根据本发明的一些示例，所述第五核酸序列编码CatR调节蛋白。通常在细胞中，例如在不动杆菌中，邻苯二酚在catA编码的邻苯二酚1，2_双加氧酶的作用下生成顺顺-粘康酸，调控基因catR受顺顺-粘康酸诱导，可激活catB的转录。申请人发现当采用包含编码CatR调节蛋白的核酸序列的重组细胞时， 重组细胞对芳香族化合物检测的精确度和灵敏度得到显著提高，并且由此所得到的重组细胞能够对多种芳香族化合物作出应答，进而提高利用重组细胞检测芳香族化合物的应用范围。上面对根据本发明实施例的重组细胞进行了描述。当然，本领域技术人员能够理解的，重组细胞还可以包含其他常规的元件以使得重组细胞正常发挥功能，在此对这些元件不再赘述。
制备本发明重组细胞的方法并不受特别限制。根据本发明的一个方面，提供了一种制备上述重组细胞的方法。根据本发明的实施例的制备上述重组细胞的方法包括使用根据本发明的实施例的构建体转化宿主细胞。如前对构建体所详细描述的，根据本发明实施例的构建体能够与宿主细胞的基因组发生同源重组，从而可以将编码报告蛋白的核酸序列整合到宿主细胞的基因组中，从而获得根据本发明实施例的重组细胞。利用构建体转化宿主细胞的方法在本发明中不受特别限制，包括但不限于显微注射、脂质体融合、基因枪、 磷酸钙法、电穿孔、病毒转染法。本领域技术人员可以根据具体情况选择适宜的转化方法。 根据本发明的实施例，还可以包括借助构建体上所包含的筛选标记基因，从经过转化的细胞中筛选发生同源重组的宿主细胞，从而可以提高获得重组细胞的效率。根据本发明的实施例，筛选标记基因的类型不受特别限制，根据本发明的一些示例，所述筛选标记基因为药物抗性基因。由此，容易地通过重组细胞的抗药性来进行筛选，例如在培养基中添加杀菌剂例如青霉素、卡那霉素等，则相应连同载体接受并表达杀菌剂抗性基因的细胞将在培养基上能够存活下来。根据本发明的具体示例，所述筛选标记基因为卡那霉素抗性基因。由此， 能够进一步提高筛选重组细胞的效率。检测样本中芳香族化合物的方法根据本发明的实施例的重组细胞能够在芳香族化合物的诱导下，启动报告蛋白的转录和表达。由此，通过检测报告蛋白的活性，可以反映芳香族化合物的存在或其量。因而，本发明的再一方面提供了一种检测样本中芳香族化合物的方法。根据本发明的实施例， 检测样本中芳香族化合物的方法包括下列步骤将样本与根据本发明实施例的重组细胞接触；将所述重组细胞在适于所述报告蛋白表达的条件下进行培养；以及检测所述报告蛋白的活性。在本发明中所使用的术语“接触”应做广义理解，只要能够使得重组细胞可以摄入芳香族化合物即可，例如包括但不限于将含有重组细胞的液体培养基与样品溶液进行充分混合、将样品溶液均勻涂布在接种有重组细胞的固体或半固体培养基上、将固定有重组细胞的固体载体加入到液体溶液中等。根据本发明的实施例，接触的时间不受特别限制，本领域技术人员可以根据具体的情况进行确定，例如通过针对不同的化合物进行一系列不同时间点的活性测试。根据本发明的实施例，可以采用的接触时间为100分钟以下，优选50分钟以下。由此，针对大多数芳香族化合物都能够体现出较好的剂量正相关性。在重组细胞与芳香族化合物接触后，芳香族化合物会通过重组细胞中的芳香族化合物降解途径特异性基因的启动子，启动表达报告蛋白，从而能够有效地对样本中的芳香族化合物进行检测。根据本发明的实施例，重组细胞的形态不受特别限制，根据本发明的一些示例，重组细胞处于适于报告蛋白表达的培养基中，更优选所述重组细胞处于适于报告蛋白表达的液体培养基中。由此，可以在将重组细胞与待测样本接触后，原位即可对重组细胞进行培养，由此，可以提高检测效率。
根据本发明的实施例，适于本发明实施例的重组细胞检测的芳香族化合物的种类并不受特别限制。根据本发明的实施例，术语“芳香族化合物”应做广义理解，是指任何含有至少一个苯环的化合物以及芳香族化合物在细胞内代谢进入三羧酸循环之前的任何中间产物。根据本发明的一个实施例，所述芳香族化合物为选自水杨酸、苯甲酸和邻苯二酚的至少一种，更优选所述芳香族化合物为邻苯二酚。根据本发明的实施例的检测样本中芳香族化合物的方法能够对这些芳香族化合物进行十分有效地检测。在本发明中所使用的术语 “培养基”应做广义理解，是指任何能够使得重组细胞保持活性并且能够对芳香族化合物做出应答的基质，可以是液体的，也可以是固体或者半固体的。本申请的发明人发现根据本发明的实施例的重组细胞在与芳香族化合物接触后，其报告蛋白尤其是发光蛋白特别是LuxCDABE，其活性例如发光强度与芳香族化合物的量呈正相关关系，因而可以通过报告蛋白活性的定量检测，来对芳香族化合物进行定量分析。为此，根据本发明的一个实施例，可以通过对报告蛋白的活性进行定量检测，并且将报告蛋白的活性与标准曲线即已知浓度芳香族化合物与报告蛋白活性的关系进行比较，以确定样本中芳香族化合物的含量。由此，能够有效地通过检测报告蛋白的活性来确定样本中芳香族化合物的含量。本领域技术人员能够理解，标准曲线可以通过常规方法绘制，例如通过设置一系列已知浓度的芳香族化合物样本，并分别将各个样本与重组细胞接触检测报告蛋白的活性，从而获得一系列报告蛋白活性的定量值，从而绘制出报告蛋白活性值相对于芳香族化合物浓度的曲线。试剂盒根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种用于检测样本中芳香族化合物的试剂盒。根据本发明的实施例，用于检测样本中芳香族化合物的试剂盒包括根据本发明的上述重组细胞以及适于报告蛋白表达的培养基。利用根据本发明的实施例的用于检测样本中芳香族化合物的试剂盒，能够有效地对样本中的芳香族化合物进行检测。在应用根据本发明实施例的根据本发明一些示例，所述重组细胞呈选自干粉、固定在载体上或者悬浮液至少一种的状态。申请人发现，呈干粉、固定在载体上或者悬浮液状态的重组细胞抵御外界不利影响的能量远大于固定化酶制剂。检测芳香族化合物的系统根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种用于检测样本中芳香族化合物的系统。参考图4，根据本发明的实施例的用于检测样本中芳香族化合物的系统1000包括反应模块100和用于检测报告蛋白活性的检测模块200。其中，在反应模块100内设置有根据本发明实施例的重组细胞(图中未示出)，以便与待检测的样品接触，并启动所述重组细胞表达报告蛋白。检测模块200用于对重组细胞所表达的报告蛋白的活性进行检测。由此， 可以利用该系统1000实施根据本发明实施例的利用重组细胞检测样本中芳香族化合物的方法，由此能够利用报告蛋白活性对样本中的芳香族化合物的响应，有效地对样本中的芳香族化合物进行检测。关于检测芳香族化合物的方法，前面已经进行了详细的描述，在此不再赘述。如同检测芳香族化合物方法的适用性，该系统1000适用的芳香族化合物的种类并不受特别限制。根据本发明的一个实施例，芳香族化合物可以为选自水杨酸、苯甲酸和邻苯二酚的至少一种，更优选所述芳香族化合物为邻苯二酚。根据本发明的实施例的检测样本中芳香族化合物的系统1000能够对这些芳香族化合物进行十分有效地检测。
根据本发明的实施例，用于检测样本中芳香族化合物的系统1000还可以包括其他组成模块。参考图5，根据本发明的一个实施例，用于检测样本中芳香族化合物的系统1000 还可以进一步包括数据处理模块300以及任选地包括显示模块400。其中，数据处理模块 300内预存有芳香族化合物浓度标准曲线，并且数据处理模块300与报告蛋白活性检测模块200相连，由此，数据处理模块300根据报告蛋白活性的检测结果得到量化的芳香族化合物检测结果。关于芳香族化合物浓度标准曲线，在前面已经进行了详细描述，在此不再赘述。显示模块400与数据处理模块300相连，用于显示芳香族化合物检测结果。由此，通过将定量检测的报告蛋白活性与标准曲线进行比较，可以有效地获得样本中芳香族化合物的含量，并且可以将结果输出。筛选具有降解芳香族化合物活性的制剂的方法根据本发明的又一方面，基于利用重组细胞检测芳香族化合物的方法，本发明还进一步提供了一种筛选具有降解芳香族化合物活性的制剂的方法。根据本发明的实施例， 筛选具有降解芳香族化合物活性的制剂的方法包括下列步骤将含有芳香族化合物的样本与怀疑具有降解芳香族化合物活性的制剂以及根据本发明的上述重组细胞接触，并测定所述重组细胞的报告蛋白活性，得到第一活性；将含有芳香族化合物的样本在不存在所述制剂时与所述重组细胞接触，并测定所述重组细胞的报告蛋白活性，得到第二活性；第一活性低于所述第二活性是所述制剂具有降解芳香族化合物活性的指示。如前所述，报告蛋白的活性可以反映样本中芳香族化合物的含量，因此，如果第一活性低于第二活性，则说明在与怀疑具有降解芳香族化合物活性的制剂接触后，含有芳香族化合物的样本中芳香族化合物的含量得到降低，进而证明制剂具有降解芳香族化合物的活性。根据本发明的实施例，这里所使用的术语“制剂”应做广义理解，可以是任何能够降解芳香族化合物的手段，既可以是物理手段，也可以是化学手段，还可以是生物手段，例如酶降解、微生物降解等。根据本发明的实施例的筛选方法的使用范围并不受特别限制。根据本发明的一个实施例，制剂可以是降解选自水杨酸、苯甲酸和邻苯二酚的至少一种的芳香族化合物的候选物，更优选芳香族化合物为邻苯二酚。申请人发现，利用根据本发明实施例的方法，能够更有效地筛选可以降解这些芳香族化合物的制剂。根据本发明的一个实施例，可以将所述含有芳香族化合物的样本与所述怀疑具有降解芳香族化合物活性的制剂以及所述重组细胞在适于所述报告蛋白表达的培养基中进行混合，并实时检测所述芳香族化合物含量的变化。由此，可以通过实时检测所述芳香族化合物含量的变化，来反映所述制剂是否具有降解芳香族化合物的活性。另外，还可以对所筛选到的制剂进行定量分析，例如通过对所筛选到的制剂的报告蛋白活性变化与已知活性制剂的相应报告蛋白活性变化进行比较，从而可以确定所筛选到的制剂与已知活性的制剂的比例，从而对所筛选到的制剂进行定量分析。本领域技术人员能够理解，可以利用根据本发明的用于检测芳香族化合物的试剂盒或者系统来实施根据本发明实施例的筛选降解芳香族化合物的制剂的方法。下面根据具体的实施例对本发明进行说明。需要说明的是，这些实施例仅仅是为了说明本发明，而不能以任何方式解释为对本发明的限制。另外，除非特别说明，在下面的实施例中所涉及的方法为常规方法，所涉及的材料和制剂也为市售可得的。实施例1菌株不动杆菌(Acinetobac ter baylyi) ADPl-Cat的构建1)在菌株不动杆菌(Acinetobacter baylyi)ADPl的catB基因中引入EcoRI限制性内切酶酶切位点通过NCBI Genbank数据库获得菌株不动杆菌(Acinetobacter baylyi)ADPl的基因组序列信息(序列号为NC 005966. 1)。利用表1中所示的引物通过PCR反应获得菌株不动杆菌(Acinetobacter baylyi) ADPl完整的catB基因的5，部分和3，部分。表 权利要求
1.一种构建体，其特征在于，包括第一核酸序列，所述第一核酸序列包括编码报告蛋白的序列，所述报告蛋白具有可检测的活性，所述报告蛋白优选为选自发光蛋白、荧光蛋白、酶的至少一种，更优选发光蛋白， 进一步优选为选自LuxCDABE、LuxAB的至少一种，更进一步优选LuxCDABE ；以及第二核酸序列和第三核酸序列，所述第二和第三核酸序列分别位于所述第一核酸序列的5’侧和3’侧，所述第二核酸序列和第三核酸序列不同，并且所述第二核酸序列和第三核酸序列分别独立地为宿主细胞芳香族化合物降解途径特异性基因的非功能片段，优选为邻苯二酚降解途径特异性基因的非功能片段，更优选catB基因的非功能片段，进一步优选所述第二核酸序列和第三核酸序列分别为由如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示的序列构成，优选所述宿主细胞为选自细菌细胞、真菌细胞、植物细胞和动物细胞的至少一种，优选细菌细胞，进一步优选不动杆菌，最优选不动杆菌ADPl。
2.根据权利要求1所述的构建体，其特征在于，进一步包括第四核酸序列，所述第四核酸序列位于所述第二核酸序列与所述第一核酸序列之间，并且包括宿主细胞芳香族化合物降解途径特异性基因的启动子，所述启动子与所述第一核酸序列可操纵地连接，优选包括邻苯二酚降解途径特异性基因的启动子，更优选包括catB基因的启动子，最优选所述第四核酸序列由SEQ ID NO 3所示核酸序列构成。
3.根据权利要求2所述的构建体，其特征在于，进一步包括第五核酸序列，所述第五核酸序列位于所述第四核酸序列与所述第二核酸序列之间，并且编码调节蛋白，所述调节蛋白对于所述启动子是特异性的，优选所述第五核酸序列编码CatR调节蛋白；以及优选进一步包括筛选标记基因，更优选所述筛选标记基因为药物抗性基因，最优选所述筛选标记基因为卡那霉素抗性基因。
4.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞包括第一核酸序列，所述第一核酸序列包括编码报告蛋白的序列，所述报告蛋白具有可检测的活性，优选所述报告蛋白为选自发光蛋白、荧光蛋白、酶的至少一种，更优选发光蛋白， 进一步优选LuxCDABE ；以及芳香族化合物降解途径特异性基因的启动子，优选包括邻苯二酚降解途径特异性基因的启动子，更优选包括catB基因的启动子，所述启动子位于所述第一核酸序列的5’侧，并且与所述第一核酸序列可操纵地相连，其中，优选所述重组细胞为选自细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、植物细胞和动物细胞的至少一种，优选细菌细胞，进一步优选不动杆菌，更优选不动杆菌ADPl，最优选按照保藏号CCTCC M 2011270保藏于中国典型培养物保藏中心的重组细胞不动杆菌(Acinetobacter baylyi) ADPl-Cat0
5.根据权利要求4所述的重组细胞，其特征在于，进一步包括第五核酸序列，所述第五核酸序列包括编码调节蛋白的序列，所述调节蛋白对于所述启动子是特异性的，优选所述第五核酸序列编码CatR调节蛋白。
6.一种制备权利要求4或5所述的重组细胞的方法，其特征在于，包括使用权利要求1-3任一项所述的构建体转化宿主细胞。
7.—种检测样本中芳香族化合物的方法，其特征在于，包括下列步骤将所述样本与根据权利要求4或5所述的重组细胞接触，优选所述重组细胞处于适于报告蛋白表达的培养基中，更优选所述重组细胞处于适于报告蛋白表达的液体培养基中； 将所述重组细胞在适于所述报告蛋白表达的条件下进行培养；以及检测所述报告蛋白的活性，优选对所述报告蛋白的活性进行定量检测， 其中，优选所述芳香族化合物为选自水杨酸、苯甲酸和邻苯二酚的至少一种，更优选所述芳香族化合物为邻苯二酚，优选进一步包括将所述报告蛋白的活性与预定的芳香族化合物浓度标准曲线进行比较，以确定所述样本中芳香族化合物的含量。
8.一种用于检测样 本中芳香族化合物的试剂盒，其特征在于，包括 根据权利要求4或5所述的重组细胞；以及适于报告蛋白表达的培养基，其中，任选地所述重组细胞呈选自干粉、固定在载体上或者悬浮液至少一种的状态。
9.一种用于检测样本中芳香族化合物的系统，其特征在于，包括反应模块，所述反应模块内设置有根据权利要求4或5所述的重组细胞，以便与待检测的样品接触，并启动所述重组细胞表达报告蛋白，优选所述重组细胞处于适于报告蛋白表达的培养基中，更优选所述重组细胞处于适于报告蛋白表达的液体培养基中；以及报告蛋白活性检测模块，用于对所述重组细胞所表达的报告蛋白的活性进行检测，优选对所述报告蛋白的活性进行定量检测； 其中，优选所述芳香族化合物为选自水杨酸、苯甲酸和邻苯二酚的至少一种，更优选所述芳香族化合物为邻苯二酚，优选进一步包括数据处理模块，所述数据处理模块内预存有芳香族化合物浓度标准曲线，并且所述数据处理模块与所述报告蛋白活性检测模块相连，所述数据处理模块根据所述报告蛋白活性的检测结果得到量化的芳香族化合物检测结果；和任选地显示模块，所述显示模块与所述数据处理模块相连，用于显示所述芳香族化合物检测结果。
10.一种筛选具有降解芳香族化合物活性的制剂的方法，其特征在于，包括下列步骤 将含有芳香族化合物的样本与怀疑具有降解芳香族化合物活性的制剂以及权利要求4或5所述的重组细胞接触，并测定所述重组细胞的报告蛋白活性，得到第一活性；将含有芳香族化合物的样本在不存在所述制剂时与所述重组细胞接触，并测定所述重组细胞的报告蛋白活性，得到第二活性； 其中，第一活性低于所述第二活性是所述制剂具有降解芳香族化合物活性的指示， 优选所述芳香族化合物为选自水杨酸、苯甲酸和邻苯二酚的至少一种，更优选所述芳香族化合物为邻苯二酚；优选将所述含有芳香族化合物的样本与所述怀疑具有降解芳香族化合物活性的制剂以及所述重组细胞在适于所述报告蛋白表达的培养基中进行混合，并实时检测所述芳香族化合物含量的变化。
全文摘要
本发明提供了一种构建体、重组细胞及其用途。其中，根据本发明实施例的构建体包括第一核酸序列，所述第一核酸序列包括编码报告蛋白的序列，所述报告蛋白具有可检测的活性；以及第二核酸序列和第三核酸序列，所述第二和第三核酸序列分别位于所述第一核酸序列的5’侧和3’侧，所述第二核酸序列和第三核酸序列不同，并且分别独立地为宿主细胞芳香族化合物降解途径特异性基因的非功能片段。利用该构建体构建的重组细胞能够有效地对芳香族化合物进行检测，另外，根据本发明的实施例还提供了检测样本中芳香族化合物的方法、系统、试剂盒以及筛选具有降解芳香族化合物活性的制剂的方法。
文档编号C12N1/19GK102352370SQ20111031026
公开日2012年2月15日 申请日期2011年10月13日 优先权日2011年10月13日
发明者张立通, 张耕耘, 徐俊光, 汪建, 王俊, 赵云, 郑仪, 金桃, 魏霞 申请人:深圳华大基因研究院, 深圳华大基因科技有限公司