专利名称：一株产雷公藤甲素的内生真菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株产雷公藤甲素 的内生真菌。
背景技术：
自1898年Vogl从黑麦草种子内分离出第一株内生真菌以来，植物内生菌作为一种新的微生物资源受到了广泛的关注，从内生菌中寻找和发现新的活性化合物已成为国内外研究的又一热点。有研究表明，内生真菌存在于所有植物种类当中，药用植物内生真菌能够产生与宿主植物相同或相似的药用活性成分，特别是还发现许多新的活性成分， 这些活性成分被证明具有明显的抗癌、抗菌、抗氧化等活性。随着对药用植物资源研究的不断深入，一些寄生于药用植物体内的内生真菌被发现不但对宿主次生代谢产物的产生具有明显的促进作用，而且自身也会代谢产生相同或类似的植物源药用物质。自Strobel小组于1993年首次从红豆杉植物上分离出产紫杉醇的内生真菌以来，从药用植物内部筛选与开发具有药用价值的真菌资源，寻找新的抗菌活性物质，进而为植物源药物的生产开辟新途径已成为该领域的研究重点与热点。药用植物内生真菌有望部分代替药用植物作用，从而解决药用植物资源短缺的问题。因此，利用药用植物内生真菌开发新药源具有极大的可能性。同时，内生真菌易于发酵培养，便于组织工业化生产，利用内生真菌发酵实现生物活性物质的工业化生产，可以提高产量、降低产品成本，满足市场的需求；另外，从内生真菌中提取单体代替以前的从植物中提取单体，还可解决许多植物因作为药用资源而被大量采伐引起的资源和生态危机，有利于珍稀濒危药用植物资源的保护。雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook. f.)为卫矛科雷公藤属木质藤本植物， 是我国重要的传统药用植物。然而，雷公藤药用成分含量极低，加之野生资源蕴藏量少，人工栽培又存在生长缓慢，收获期长的问题，远远无法满足市场需求，已成为我国珍贵紧缺中药材。所以对雷公藤内生真菌的提取具有非常重要的意义，但是此方面的研究却未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一株产雷公藤甲素的内生真菌。本发明提供的一株能产生雷公藤甲素的功能内生真菌从雷公藤组织上分离、纯化获得，其在平面培养基上，正面灰绿色，背面黄褐色，单个圆形；菌丝体有隔，分生孢子梗和孢子无色，末端生小梗，小梗直立，单胞，卵圆形，表面光滑，分生孢子梗自菌丝单个地发生， 成帚状特征结构；该菌株为歧皱青霉stedii)菌株NS-12，于2011年6月10 号保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No. 4928。所述内生真菌产雷公藤甲素的发酵培养条件为使用PDA液体培养基(装液量为100ml/500ml)，150r/min摇床振荡培养，培养温度为28°C，培养时间为72 144h。通过悬浮培养发现该菌株能在短时间内(72小时)向胞外分泌相当数量的雷公藤甲素(0. 0508g/L),明显优于传统植物栽培的获取途径，具有良好的工业化应用前景。
图1为雷公藤甲素标准品液相色谱检测图
图2为NS-12菌株培养液中雷公藤甲素含量的液相色谱检测图。图3为NS-12菌株的 雷公藤甲素生成情况。图4为NS-12菌株的平板图。
具体实施例方式菌株NS-12的分离、筛选如下
(1)雷公藤植物组织的准备该菌株主要从野外雷公藤植株的不同组织器官获取，将植物分主根、侧根、主枝、侧枝、叶及叶柄进行采集。(2)植物材料的表面消毒叶片消毒采用70%酒精浸泡40s、0. 升汞浸泡90s， 枝茎消毒采用70%酒精浸泡30s、0. 升汞浸泡60s，根部消毒采用70%酒精浸泡50s、 0. 升汞浸泡120s ；
(3)雷公藤组织的表面无菌检测将所采集的雷公藤组织经表面消毒后，直接种植于固体培养基上，置恒温箱培养72h，从中选出表面无任何菌种生长的组织体。该过程使用 PDA固体培养基，配方为新鲜土豆200 g/L，葡萄糖25g/L，琼脂15g/L，其它为无菌水，pH 7. 0-7. 2，培养温度为28°C，培养方式为平板培养，培养时间为72h ；
(4)采用组织块法分离内生真菌将表面无菌的雷公藤组织样品在无菌条件下切成小片，其中叶片切成1 cmXl cm的小块，根、茎与枝取韧皮部切成0. 5 cm左右的小段，再移入PDA培养基平板中，置28°C恒温箱中避光培养72小时。为了抑制细菌和放线菌生长，在配制PDA时于灭菌前每升培养基中加入2ml氯霉素。待组织块周围长出菌丝后，挑取形态不同的菌落移至新的PDA培养基中进行点纯化。(5)点纯化方法将分离繁殖出的不同种类的内生真菌接入平板培养基进行纯化， 经过2-3次点接纯化，分离得到雷公藤内生真菌菌株；采用的点接种纯化技术将消毒后的接种环轻微点击菌体表面，然后将其点击接种面，该方法较传统的点植培养法更易控制接种量，从而提高对内生真菌的接种效率与检出率。(6)内生真菌的悬浮培养将从雷公藤不同组织分离得到的内生真菌接入液体培养基(IOOml装入500ml三角瓶内)，150r/min摇床振荡培养，培养温度为28°C，培养时间为 72 168h。待菌液培养完成，用双层无菌纱布在无菌条件下进行初过滤，取出菌块、孢子和杂质，经4°C冷冻离心(12000转，5分钟)获取真菌发酵液，再经0. 45um的有机微孔滤膜过滤后，将最终获取的发酵培养液用于雷公藤甲素的测定。液体培养基使用PDA液体培养基，其中新鲜土豆为200 g/L，葡萄糖25g/L，其它为无菌水，PH 7. 0-7. 2。(7)雷公藤甲素的测定利用高效液相色谱检测发酵培养液中雷公藤甲素的浓度， 雷公藤甲素标准品购于成都普瑞法科技开发有限公司。液相色谱仪的参数设置为流动相为70%甲醇，30%水；流速为lml/min，检测波长208nm。检测前将流动相，超纯水，甲素标准溶液和发酵液样品预先超声波处理半小时。通过发酵培养液与雷公藤甲素标准品的图谱比对，获得一株产雷公藤甲素的菌株。
具体操作如下
步骤(5)从雷公藤植物组织器官中共分离得到分属于22个不同形态型的雷公藤内生真菌菌株。其中由侧枝分离出8株，占总菌数的36. 36%，比例最高；其次是由主枝和叶柄分离出的菌株，各为4株，占总菌数的18. 18% ；由主根分离出3株，占总菌数的13. 64% ；由侧根和叶分别分离出2株和1株。利用PDA液体培养基分别对分离得到的22株雷公藤内生真菌进行悬浮培养，培养时间为168h，每24h取样对不同真菌发酵液甲素含量进行检测，结果发现NS-12菌株发酵产物中含有雷公 藤甲素，其雷公藤甲素的生成情况如图1、图2与图3所示。从中可知，NS-12 菌株从培养初期就可向体外代谢产生雷公藤甲素，当生长72h后，其产生的雷公藤甲素浓度最高，约为0. 0508g/L。NS-12菌株在平面培养基上，正面灰绿色，背面黄褐色，单个圆形；菌丝体有隔，分生孢子梗和孢子无色，末端生小梗，小梗直立，单胞，卵圆形，表面光滑，分生孢子梗自菌丝单个地发生，成帚状特征结构；根据上述特征，依据“真菌鉴定手册”，将NS-12菌株鉴定为船龍mPeniciIlium steckii),目前已保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 4928。
权利要求
1.一株产雷公藤甲素的内生真菌，其特征在于所述内生真菌为歧皱青霉 iPenicillium ^stedii )菌株NS-12，于2011年6月10号保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 4928。
2.如权利要求1所述的产雷公藤甲素的内生真菌，其特征在于所述内生真菌产雷公藤甲素的发酵培养条件为使用PDA液体培养基，150r/min摇床振荡培养，培养温度为 28 °C，培养时间为72 168h。
全文摘要
本发明提供了一株产雷公藤甲素的内生真菌。所述内生真菌为歧皱青霉(Penicilliumsteckii)菌株NS-12，保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.4928。所述内生真菌产雷公藤甲素的发酵培养条件为使用PDA液体培养基(装液量为100ml/500ml)，150r/min摇床振荡培养，培养温度为28℃，培养时间为72～144h。通过悬浮培养发现该菌株能在短时间内向胞外分泌相当数量的雷公藤甲素，明显优于传统植物栽培的获取途径，具有良好的工业化应用前景。
文档编号C12R1/80GK102321545SQ201110320850
公开日2012年1月18日 申请日期2011年10月21日 优先权日2011年10月21日
发明者吴承祯, 宋萍, 封磊, 朱留刚, 洪伟 申请人:福建农林大学