专利名称：一种中温β-葡萄糖苷酶BglA1及其基因和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种中温β-葡萄糖苷酶BglAl及其基因和应用。
背景技术：
生物质的再生和降解是自然界中一个重要的环节，自然界中每年大约有15%的总碳通过植物被固定，其中50%的固定碳形成了结构多糖和木质素，通常将这一部分称为木质纤维素。木质纤维素是植物通过光合作用产生的地球上最丰富的生物质。结构上，木质纤维素是由木质素、纤维素和半纤维素构成的高分子复合物。纤维素大约占细胞干重的 40 45%，其结构由葡萄糖通过β-1，4-糖苷键连接而成的线状结构分子(Martinez AT, Ruiz-Duenas FJ,Martinez MJ,et al. (2009)Enzymatic delignification of plant cell wall :from nature to mill. Curr Opin Biotechnol, 20)。纤维素的降解是三类酶协同作用的结果，包括内切纤维素酶(endo-1， 4-^-D-glucanase, EC 3.2. 1. 4，简称EG)，这类酶首先作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机水解β -1，4-糖苷键，将长链纤维素分子切割产生大量带非还原性末端的小分子纤维素；外切纤维素酶(θχο-1,4-β -D-glucanase 或 cellobiohydrolase, EC3. 2. 1. 91， 简称CBH)，这类酶作用于纤维素线状分子末端，水解β -1，4糖苷键，每次降解产生一个纤维二糖分子；β-葡糖苷酶(β-D-glucosidase, EC 3.2. 1. 21，简称BG)，这类酶作用于纤维二糖或纤维寡糖的非还原端，产生葡萄糖分子(Sanchez, C. (2009). Lignocellulosic residues :biodegradation and bioconversion by fungi. Biotechnology Advances 27(2) :185-194.)。其中BG通常不直接作用于纤维素，但是它可以降解对纤维素降解起抑制作用的纤维二糖，所以它是快速降解纤维素过程中所必须的酶类。根据氨基酸序列相似性，它主要分为三个家族GH1包括β-glucosidases和phospho-0-glucosidases ； GH9 ( β -glucosidases)主要来自于细菌，植物和哺乳动物)，还有GH3 ( β -glucosidase) 主要来自酵母，霉菌和瘤胃细菌(Henrissat，B. Α. (1991) classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem J, 280 :309-316.)。β-葡萄糖苷酶有着广泛的应用，例如在食品工业，β-葡萄糖苷酶能改良果汁风味，β-葡萄糖苷酶的水解可以释放出其中潜在的芳香成分，从而可以增加植物芳香物质的提取量，对于天然香精香料工业有着重要意义。在生物能源工业，纤维素转化为葡萄糖过程中葡萄糖苷酶起到关键作用，对纤维素的有效降解的决定因素。在医学方面，葡萄糖苷酶在某些疾病的诊断、治疗起到重要作用。另外，利用葡萄糖苷酶的转糖苷活性，可用于生产日化工业的非离子表面活性剂烷基糖苷(潘利华，罗建平Ο006) “β-葡萄糖苷酶的研究及应用进展”《食品科学》12，803-806)目前工业上应用的是来源于木霉属的葡萄糖苷酶，但其热稳定性较差，不能满足长时间的中高温工业处理，因此获得新型具有良好耐热性的β -葡萄糖苷酶的研究具有重大意义。克隆和分离具有中温、热稳定性好的葡萄糖苷酶可以更好的应用于生物能源、
3纺织等领域。本发明中来源于瓶霉属Wiialophora sp. XH6的β -葡萄糖苷酶BglAl具有以下性质最适PH 6.0，在ρΗ 5 7范围内具有50%以上的酶活力，最适温度50°C，良好的热稳定性，在50°C处理2个小时酶活几乎没有损失。在低温和中温范围内具有较高酶活力的特性使其在食品和能源工业应用上具有很大的潜力。
发明内容
本发明的目的是提供一种中温β-葡萄糖苷酶BglAl。本发明的再一目的是提供编码上述中温β-葡萄糖苷酶的基因BglAl。本发明的另一目的是提供包含上述中温葡萄糖苷酶基因的重组载体。本发明的另一目的是提供包含上述中温葡萄糖苷酶基因的重组菌株。本发明的另一目的是提供一种制备上述中温葡萄糖苷酶方法。本发明的另一目的提供上述中温葡萄糖苷酶的应用。本发明分离筛选出一种生产上述中温β-葡萄糖苷酶BglAl的瓶霉 ΧΗ6 (Phialophora sp.)，于2011年10月21日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为CGMCC No. 5368。本发明提供了一种葡萄糖苷酶BglAl，其氨基酉I序列如SEQ ID NO. 1所示
MSLPKDFLffGFATASYQIEGAVDADGRGPSIffDTFCKIPGKIADKSSGVT
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其中，该酶包括476个氨基酸和一个终止密码子，,不包含信号肽，因此，成熟的
β -葡萄糖苷酶BglAl的理论分子量为54. IkDa本发明的BglAl常温下，在中温的范围内均具有高活性。本发明的β-葡萄糖苷酶，其最适PH值为6.0，在ρΗ 5.0 7.0的范围内维持50%以上的酶活性；最适温度为 50°C，在50V下半衰期为他。本发明提供了编码上述中温葡萄糖苷酶的基因BglAl。具体地，该基因的序列如SEQID NO. 2所示
atgtctctgccaaaggatttCttgtgggggtttgcgacggcttcgtaccagattgaggga60
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ccgctcgacttcgagcactatgcccgcgtggtgttcaaggcgatccccaagtgcaagcac480
tggatcacgttcaacgagccgtggtgctcgtccatcctcggatacaacagcggctacttc540
gcgcccggccacacgtcggatcgctccaagtcggccgtcggcgacagtgcgcgcgagccg600
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ccgtgggacccagaggacccggccgacgtcgaggcgtgcgaccgcaagatcgagttcgcc780
atcagctggttcgccgaccccatctacttcggcaagtacccggactcgatgctcaagcag840
ctcgggaaccggctgccgacgttcacggacgaggagcgcgcgctggtgcagggcagcaac900
gacttctacggcatgaaccactacacggccaactacatcaaacacaagacgggcacgccg960
cccgaggacgacttcctgggcaacctcgag acgctgttctacagcaaggccggcgagtgc1020
atcgggcccgagacgcagtcgttctggctgcgcccgaacgcgcaggggttccgcaacctg1080
ctcaactggctcagcaatcgctacggccgtcccaagatct acgtcacgga aaacggcacg1140
tcgctcaagggcgagaacgacatgccgctg gagcagatcctcgaggacga cttccgcgtc1200
cagtacttccacgactacgcgcacgccatg gccaaggccg tgtccgagga cggcgtcgac1260
CtCCgggggtacatggcctggtcgctcatg gacaactttg agtgggccga gggttacgag1320
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agcgccaggagcctcaagccgctgttcgac agcctgatca agaaggacta g1431
本发明通过PCR的方法分离克隆了中温β-葡萄糖苷酶cDNA基因BglAl，cDNA全序列分析结果表明，中温葡萄i糖苷酶BglAl的结构基因BglAl全长1431bp。成熟蛋白理论分子量为Μ. lkDa，将β-葡萄糖苷酶基因BglAl序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对，该基因与性质鉴定来源于Hypocrea jecorina的 β -glucosidase氨基酸序列一致性为73%。说明BglAl是一种新的β -葡萄糖苷酶。本发明还提供了包含上述中温β-葡萄糖苷酶基因BglAl的重组载体，命名为 pPIC9-BglAl。将本发明的葡萄糖苷酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的β-葡萄糖苷酶基因插入到质粒PPIC9上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOXl启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒 pPIC9-BglAl。本发明还提供了包含上述中温β -葡萄糖苷酶基因BglAl的重组菌株，所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为毕赤酵母菌株GS115。本发明还提供了一种制备上述中温葡萄糖苷酶BglAl的方法，包括以下步骤1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；2)培养重组菌株，诱导重组β -葡萄糖苷酶BglAl的表达；以及3)回收并纯化所表达的β-葡萄糖苷酶BglAl。其中，所述宿主细胞为毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichia past0ris)GS115，得到重组菌株GS115/BglAl。本发明还提供了上述中温β-葡萄糖苷酶BglAl的应用，优选其在水解β-葡萄糖苷酶及在食品、能源工业中的应用。本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、 适合于在食品、能源工业中应用新的葡萄糖苷酶。本发明的葡萄糖苷酶最适PH为 6. 0，在pH5. 0 7. 0都有较高的酶活性。最适温度为50°C，其耐热特性，可使其在需求耐热环境的工业生产上应用。本葡萄糖苷酶可应用于食品、能源工业，纤维物质转化为可发酵糖的过程。
图1重组β -葡萄糖苷酶的最适ρΗ。图2重组β -葡萄糖苷酶的ρΗ稳定性。图3重组β -葡萄糖苷酶的最适温度。图4重组β -葡萄糖苷酶的热稳定性。瓶霉ΧΗ6 (Phialophora sp.)，于2011年10月21日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所， 100101)，其保藏号为CGMCC No. 5368。
具体实施例方式试验材料和试剂1、菌株及载体本发明从瓶霉(Phialophora sp. XH6 CGMCC 3328)(保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为CGMCC No. 5368。)中分离得到一种新的中温β -葡萄糖苷酶BglAl。毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GSl 15购自于hvitrogen公司。2、酶类及其它生化试剂内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自hvitrogen公司。 购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。3、培养基(I)Phialophora sp. XH6 CGMCC 33 培养基为马铃薯培养基IOOOmL 200g 土豆煮汁，IOg葡萄糖，25g琼脂，ρΗ 5. 0。(2)大肠杆菌培养基LB (1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、NaCl，pH 7.0)。(3) BMGY 培养基1 % 酵母提取物，2 % 蛋白胨，1. 34 % YNB，0. 00004 % Biotin, 1 % 甘油(V/V)。(4)BMMY培养基除以0. 5%甲醇代替甘油，其余成份均与BMGY相同，pH4. 0。说明以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J-萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。实施例1瓶霉Wiialophora sp. XH6分离及产酶特性瓶梅Wiialophora sp. XH6分离自云南矿区的锡矿废液，pH3. O。分离培养基为PDA 培养基，PH3.0，通过多次稀释涂板获得单菌。在PDA培养基14天菌落平展，紧凑，深褐色，直径1.5 2cm。菌丝体表生或埋生，菌丝淡褐色，光滑，具隔膜，分枝并形成网结。分生孢子梗短，有的呈瓶梗状，暗色，分生孢子梗单生或具轮枝。分生孢子半透明到暗色。单细胞。球形至卵圆形。该菌为Phialophora属，命名为XH6 (Phialophora sp.)。该菌株于 2011年10月21日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为CGMCC No. 5368。将瓶霉Phialophora sp. XH6 接种于产酶培养基((NH4) 2S04 5g/L，KH2PO4 lg/L， MgSO4 · 7H20 0. 5g/L, FeSO4 · 7H20 0. Olg/L, CaCl2 0. 2g/L，微晶纤维素 1%, pH 6. 0)，30°C 培养3 5d，观察其是否产葡萄糖苷酶。诱导5天后，测定到培养基上清中具有葡萄糖苷酶酶活，达到0. 5U/ml.实施例2瓶霉XH6 (Phialophora sp. ) β -葡萄糖苷酶编码基因BglAl的克隆提取瓶霉ΧΗ6 (Phialophora sp.)基因组 DNA 将PDB液体30°C培养5天的培养物离心收集菌体放入研钵中液氮研磨5min，加入 IOmLCTAB提取液，置于50mL离心管中，70°C水浴锅裂解汕以上，每隔20min混勻一次，在 4°C下IOOOOrpm离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇，于-20°C静置30min后，4°C下IOOOOrpm离心lOmin。弃上清，沉淀用70%的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入IOOul TE溶解，置于-20°C备用。根据第1家族β-葡萄糖苷酶基因的保守(YRFSLSW和IGITLN)序列设计合成了简并引物Ρ1，Ρ2:Pl 5' -TACAGGTTYTCNWTNTCNTG-3‘；Ρ2 5' -TYCAGCGCDATNCCDATYTSNC-3‘)。以ΧΗ6 (Phialophora sp.)总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为94°C变性 5min ；然后 94°C变性 30sec，45°C退火 30sec，72°C延伸 lmin，30 个循环后 72°C保温 lOmin。 得到一约500bp片段，将该片段回收后与PEASY-T3载体相连送博迈德公司测序。根据测序得到的核苷酸序列，设计上游和下游各三条TAIL-PCR特异性引物设计方向为需要扩增的未知区域方向，sp2的位置设计在spl的内侧，sp3位于sp2的内侧。每两个引物之间的距离没有严格规定，引物长度一般22 30nt，退火温度在60°C左右。并将它们分别命名为uspl、usp2、usp3(上游特异性引物)、dspl、dsp2、dsp3(下游特异性引物) 见表1。表1. β -葡萄糖苷酶BglAl TAIL-PCR特异性引物
权利要求
1.一种中温β-葡萄糖苷酶BglAl，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.一种中温葡萄糖苷酶基因BglAl，其特征在于，编码权利要求1所述的中温 β-葡萄糖苷酶BglAl。
3.根据权利要求2所述的中温β-葡萄糖苷酶基因BglAl，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
4.包含权利要求2或3所述中温β-葡萄糖苷酶基因BglAl的重组载体。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为pPIC9-BglAl。
6.包含权利要求2或3所述中温β-葡萄糖苷酶基因BglAl的重组菌株。
7.根据权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为毕赤酵母菌。
8.一种制备中温葡萄糖苷酶BglAl的方法，其特征在于，包括以下步骤1)用权利要求4的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；2)培养重组菌株，诱导重组葡萄糖苷酶BglAl的表达；以及3)回收并纯化所表达的葡萄糖苷酶BglAl。
9.权利要求1所述中温β-葡萄糖苷酶BglAl的应用。
10.瓶霉ΧΗ6(Phialophora sp.)，其特征在于，其保藏编号为CGMCC No. 5368。
全文摘要
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种中温β-葡萄糖苷酶BglA1及其基因和应用。本发明提供了一种新的中温β-葡萄糖苷酶BglA1，其具有如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列，且本发明还提供了编码上述中温β-葡萄糖苷酶BglA1的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，以及包含该基因的重组载体和重组菌株及其应用。本发明提供的中温β-葡萄糖苷酶BglA1最适pH为6.0，在pH 5.0～7.0都有较高的酶活性。最适温度为50℃，其耐热特性好，可使其在需求耐热环境的工业生产上应用。
文档编号C12N15/63GK102358898SQ20111033481
公开日2012年2月22日 申请日期2011年10月28日 优先权日2011年10月28日
发明者张菁, 詹志春 申请人:武汉新华扬生物股份有限公司