专利名称：一种单克隆抗体mcf2及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医学领域，涉及一株单克隆抗体mcf2及其应用，具体涉及心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体mcf2及其应用。
背景技术：
脂肪酸结合蛋白(FABPs)是一组多源性的小分子细胞内蛋白质，分子量为12 16KDa，广泛分布于哺乳动物的小肠、肝、脂肪、心、脑、骨骼肌等多种细胞中。有小肠型 (I-FABP)^lUjlS (H-FABP)、肝脏型(L-FABP)、肾脏型(K-FABP)等亚型。不同型 FABP 的序列有较大的同源性。心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)分子量为14 15KDa，等电点(PI) 为5. 1，可将脂肪酸从细胞质膜向发生酯化和氧化的部位运输，从而进入线粒体的能量代谢体系之中，使脂肪酸在此氧化分解并最终生成三磷酸腺苷(ATP)，为心肌收缩提供能量。人 H-FABP由132个氨基酸残基组成，在心肌中含量丰富，约占心脏全部可溶性蛋白的4% 8%，每克湿重心肌中含H-FABP约(0. 52士0. 06)mg。正常人的血浆和尿中不含有H-FABP或含量甚少。当心肌细胞受损时可快速释放到血和尿中。由于各型FABP具有各自特异的抗原决定簇，可以通过免疫学方法将H-FABP与其他型FABP相区分。随着FABP测定方法的研究和临床的应用，H-FABP已成为早期心肌损伤诊断的标志物(中国实验诊断学，2005年2 月第9卷第1期)。
发明内容
本发明的目的是提供分泌心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本发明的另一目的是提供心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体。本发明的又一目的是提供心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体的应用。一株分泌心脏型脂肪酸结合蛋白的杂交瘤细胞株MCF2，与2011年9月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO :C201181。所述的保藏号为CCTCC NO :C201181的杂交瘤细胞株MCF2分泌的抗人心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体mcf2。所述的保藏号为CCTCC NO :C201181的杂交瘤细胞株MCF2分泌的抗人心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体mcf 2在检测或纯化人心脏型脂肪酸结合蛋白中的应用。所述的保藏号为CCTCC NO :C201181的杂交瘤细胞株MCF2分泌的抗人心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体mcf2在制备人心脏型脂肪酸结合蛋白检测试剂中的应用。所述的人心脏型脂肪酸结合蛋白检测试剂优选检测检测人心脏型脂肪酸结合蛋白的Wfestern Blot试剂、ELISA检测试剂、胶体金检测试剂。本发明的有益效果本发明利用纯化的人H-FABP(心脏型脂肪酸结合蛋白)作为免疫原，经过皮下免疫、常规细胞融合、筛选及克隆化，获得了一株能够稳定分泌抗H-FABP单克隆抗体的杂交瘤细胞株MCF2(CCTCC NO :C201181)。经ELISA、免疫印迹等方法鉴定，该杂交瘤细胞所分泌的单克隆抗体能够特异性识别H-FABP (Hytest公司)，效价高、特异性强。本发明H-FABP单克隆抗体的应用如下(1)应用该抗体可Wfestern Blot检测心肌组织的H-FABP表达。(2)应用该抗体可建立金标试剂盒快速检测各种体液如血液、血浆、血清、尿的 H-FABP的水平。(3)应用该抗体可建立ELISA检测试剂盒定量检测各种体液如血液、血浆、血清、 尿的H-FABP的水平。(4)应用该抗体制备免疫亲和层析柱，来分离纯化H-FABP蛋白。(5)应用该抗体进行免疫组化检测心肌组织中H-FABP蛋白表达量。本发明还进一步确认了所述的单克隆抗体在体外用于检测体液或组织中H-FABP 的表达。例如用于检测各种体液如血液、血浆、血清及尿液的H-FABP的水平；还可以测定各种疾病如急性心肌梗死等急性心肌损伤疾病H-FABP的表达水平，作为临床诊断或辅助诊断的一个标志物。本发明制得的人H-FABP单克隆抗体mcf2，为H-FABP的基础研究和临床研究提供了有利的工具。
图1心肌粗提液kphadex G75凝胶过滤柱层析洗脱曲线。图2心肌粗提液kphadex G75经凝胶过滤柱层析后各组分(Tricine) -SDS-PAGE 电泳。A 第36号管开始于M15000附近出现清晰蛋白条带；B 第41管至71管均可见M15000附近有清晰蛋白条带；C 第91管之后Ml5000附近蛋白条带明显变浅。图3心脏型脂肪酸结合蛋白QS^harose Fast Flow阴离子交换柱层析洗脱曲线。图4纯化的心脏型脂肪酸结合蛋白电泳结果A 制备的心脏型脂肪酸结合蛋白，B 经kphadex G75凝胶过滤柱层析后收集液图5制备的心脏型脂肪酸结合蛋白Western Blot分析A ASkphadex G75凝胶过滤柱层析后收集液；B 制备的心脏型脂肪酸结合蛋白。图6为Wfestern Blot检测MCFl单克隆抗体与H-FABP的特异性反应其中泳道1为纯化的H-FABP 2 μ g蛋白+mcfl单克隆抗体泳道2为Hytest的H-FABP 2 μ g蛋白+mcfl单克隆抗体泳道3为脑组织勻浆液SygSS +mcfl单克隆抗体泳道4为骨骼肌勻浆液SygSS +mcfl单克隆抗体图7为Wfestern Blot检测MCF2单克隆抗体与H-FABP的特异性反应其中泳道1为骨骼肌勻浆液8 μ g蛋白+mcf2单克隆抗体泳道2为脑组织勻浆液SygSS +mcf2单克隆抗体泳道3为Hytest的H-FABP 2 μ g蛋白+mcf2单克隆抗体泳道4为纯化的H-FABP 2 μ g蛋白+mcf2单克隆抗体图8为金标试剂盒检测Hytest-H-FABP蛋白结果其中第1，2条为检测阴性对照，
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第3，4 条为检测 10ng/ml Hytest-H-FABP 蛋白，第5，6 条为检测 20ng/ml Hytest-H-FABP 蛋白。生物材料保藏信息杂交瘤细胞株MCF1，于2011年9月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称 CCTCC，保藏地点为中国武汉武汉大学，保藏号为CCTCC NO :C201170。杂交瘤细胞株MCF2，于2011年9月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称 CCTCC，保藏地点为中国武汉武汉大学，保藏号为CCTCC NO. C201181。
具体实施例方式实施例1. H-FABP纯化心脏型脂肪酸结合蛋白纯化80g人左心室肌(来自于江苏省人民医院器官捐赠者)于400mL缓冲液A(15mm0l/L磷酸盐缓冲液，10mmol/Li3-巯基乙醇，pH 7.0)中勻浆。 勻浆液4°C，2600g离心lOmin，沉淀用150mL缓冲液A重悬。4°C，2600g离心lOmin，合并 2次离心后上清液，40C，75600g离心120min,离心后上清液用400g/L (NH4) 2S04盐析，4°C， IOOOOg,离心 25min，上清液再以 800g/L (NH4) 2S04 盐析，4°C，IOOOOg,离心 25min。弃上清，沉淀以IOmL缓冲液A溶解，于缓冲液A中4°C透析过夜，得到IOmL粗提液，蛋白定量。5mL粗提液于已用缓冲液A平衡的kphadexG-75柱(2. OcmXlOOcm)中层析，收集流出液，测定各管收集液A280值，至A值低于0.05时停止收集。将收集液进行蛋白电泳，电泳条件为三羟甲基氨基甘氨酸(Tricine)-SDS-PAGE,分离胶浓度为16%，积层胶浓度为10%，浓缩胶浓度为4%，30mA恒流电泳池。凝胶以考马斯亮蓝染色，Bio-Rad凝胶成像系统分析。结果显示在第31 86管出现蛋白峰(见图1)，电泳显示其主蛋白条带位于10000 17000， 本实施例制备的心脏型脂肪酸结合蛋白相对分子质量约为15000 (见图2)，将31 86管合并，共计得到收集液50mL(l. 9g/L)。Q Sepharose Fast Flow 柱 QOmL)用缓冲液 B (5mmol/L 咪唑，lmmol/L 乙二胺四乙酸，2mmol/Li3-巯基乙醇，pH 7.0)平衡后，以50mL上述收集液上样，缓冲液B洗柱，以 AKTA蛋白纯化系统监测流出液A280值，待平衡后，以缓冲液B和20mmol/LNaCl进行梯度洗脱，洗脱总量为3倍柱体积，流速0. 5mL/min。监测流出液A280值，合并蛋白峰管1-101(见图3)。合并液以Mr 35000聚乙二醇包埋行浓缩处理，以缓冲液B透析12h，共获得6mL纯化的心脏型脂肪酸结合蛋白(1. 8g/L)(见图4)。Western Blot检测参照文献(汪家政，范明.蛋白质技术手册[M].北京北京科学出版社，2002，166-184)进行。纯化的心脏型脂肪酸结合蛋白经Tricine-SDS-PAGE 电泳，以30mA恒流过夜转膜，牛奶封闭。加一抗为鼠抗人心脏型脂肪酸结合蛋白抗体 H86101M(BI0DESIGN公司)，以1 600稀释，室温反应lh，洗涤三次。随后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG (SIGMA公司)室温反应lh，洗涤三次，ECL两种底物1 1等体积混合后将其覆盖在膜表面使其均勻，用保鲜膜把膜包起来，在暗室中将X光片覆盖在膜的上面，显影，定影。结果显示在Mrl5000附近位置有特异性印迹条带(见图5)，提示纯化的蛋白系心脏型脂肪酸结合蛋白。实施例2.杂交瘤细胞系的建立步骤1、免疫动物
选8-12周龄与骨髓瘤细胞同种系的Balb/c小鼠(上海斯莱克实验动物有限公司)，用实施例1纯化的120 μ 1 H-FABP(含蛋白质100 μ g)与120 μ 1福氏完全佐剂(SIGMA 公司)充分混勻，注入小鼠腹腔内，每隔2周IOOyg/只的H-FABP与等量福氏不完全佐剂 (SIGMA公司)充分混勻，注入小鼠腹腔内加强免疫，共3 4次。采用间接ELISA法检测免疫小鼠血清中H-FABP蛋白多抗的效价，效价高者进行下一步的细胞融合。步骤2、细胞融合无菌制备H-FABP免疫的小鼠脾细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0(来源于中科院上海细胞库)以6 1的比例在PEG1450(SIGMA公司)作用下融合，融合按常规法 (Nature. 1975 ；256 :495-497)，用Iml PEG, 1分钟内缓慢加完，反应时间为90秒，无血清的 DMEM(Gibco BRL公司)培养基终止反应，IOOOrpm离心lOmin，HAT (H次黄嘌呤、A氨基蝶呤、 T胸腺嘧啶核苷，(Gibco BRL公司)完全DMEM培养基调细胞浓度至lxl06/ml，加入已预先铺有饲养细胞(Balb/c小鼠的腹腔巨噬细胞)的96孔培养板，100μ 1/ml，于37°C，5% CO2 培养箱中培养，每隔3天观察并换液，10天后以HT DMEM (Gibco BRL公司)培养基换液，1 周后换完全DMEM培养基。步骤3、间接酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选阳性杂交瘤细胞以纯化H-FABP(1 μ g/ml)包被酶标96孔板，37°C反应2小时或4°C过夜；3%牛血清白蛋白(BSA)封闭，4°C过夜，加入待检杂交瘤细胞(上述步骤2制得的细胞)培养上清， 37°C孵育1小时，SP2/0培养上清为阴性对照；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(SIGMA公司)37°C孵育1小时；TMB底物液显色10min，2M H2SO4终止反应。每步完成均用含0. 05% Tween20 ^ PBSUltra Microplate Reader ((EL808 Ultra Microplate Reader BIO-TEK Instruments, Inc.，Winooski, VT)测 0D450 值。所测的 0D450 比阴性对照高 10 倍的克隆，进行亚克隆化，并进行扩增冻存。步骤4、阳性杂交瘤细胞的克隆化-采用有限稀释法将上述步骤3筛选得到的细胞用HT DMEM培养基稀释至每孔1个细胞，铺于U型 96孔细胞培养板，4小时内镜下观察每孔实际细胞数，记录单个细胞孔，待其长成克隆且 ELISA鉴定抗体分泌呈阳性，即获得单抗分泌株，大量扩增并冻存，长期传代培养后，以相同的方法再次克隆化鉴定之，从而获得了稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株MCFl和MCF2。 杂交瘤细胞株MCFl和MCF2于2011年9月6日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号分别为 CCTCC NO. C201170 和 CCTCC NO. C201181。实施例3.体外培养法制备单克隆抗体 将已经建立的阳性杂交瘤细胞MCFl (CCTCC NO. C201170)和MCF2 (CCTCCN0. C201181)分别扩大培养，待细胞浓度达105/ml时停止换液，持续培养直至细胞全部死亡。收集培养上清，1500rpm，离心10分钟，上清含有高水平的单克隆抗体，_20°C保存备用。实施例4.体内诱生腹水法制备单抗挑选经产Balb/c小鼠，腹腔内注射0. 5ml液体石蜡(SIGMA公司)，7天后每只小鼠腹腔内注射 0. 5ml 含 2X IO5 的 MCFl (CCTCC NO. C201170)或 MCF2 (CCTCC N0. 201181)杂交瘤细胞，7-10天后视小鼠腹部膨胀程度收集腹水，4°C离心，2500rpm离心20min，收集上清，分别得到单克隆抗体mcfl和单克隆抗体mcf2，将两种单抗分别分装并放置_70°C保存备用。实施例5单克隆抗体的特性鉴定
步骤1、滴度测定取实施例4制备的小鼠腹水做等比稀释，以H-FABP(Hytest公司)为检测抗原，间接ELISA法(同实施例2步骤3)测定实施例4制备的单克隆抗体mcfl和单克隆抗体mcf2 的滴度，并以SP2/0诱生的小鼠腹水为阴性对照，ELISA检测的结果均为1 106。步骤2、单克隆抗体IgG亚类鉴定取MCFl和MCF2杂交瘤细胞培养上清，用小鼠单克隆抗体分型试剂(SIGMA公司) 进行。具体方法如下(1)在已包被H-FABP蛋白(实施例1制备)的ELISA板中分别加入MCFl和MCF2 杂交瘤细胞培养上清，室温孵育2小时。(2)用含0. 05 % Tween 20的PBS洗板三次。分别加入羊抗鼠的IgGl，IgG2a, IgG2b，IgG3 (SIGMA公司)(用PBST 1 2000稀释)各100 μ 1/孔，每个样品双复孔。室
温孵育30分钟。(3)用含0. 05% Tween 20的PBS洗板三次。加入HRP偶联的兔抗羊IgG (SIGMA 公司)(用PBST做1 20000稀释)，100 μ 1/孔，室温孵育30分钟。(4)用含 0. 05% Tween 20 的 PBS 洗板三次，TMB 底物显色 lOmin。(5) 2M 终止反应。(6) ELISAReader 测 0D4S0 值，判断单抗 IgG 亚类。结果表明，MCFl和MCF2杂交瘤分泌的单抗mcfl和mcf2均为IgGl亚类免疫球蛋白。步骤3、单抗的纯化将实施例4制备的两种H-FABP单抗腹水mcfl和mcf2分别用0. Olmol/L, pH 7. 4 的PBS对倍稀释。利用Protein A(Amersham Pharmacia Biotech公司)亲和层析的方法 (按说明书操作)纯化H-FABP蛋白的单克隆抗体。将纯化的抗体进行SDS-PAGE电泳，按常规方法进行(分离胶为12.5%，浓缩胶为4.5%)。纯化的抗体放_70°C保存备用。步骤4、单抗稳定性的测定复苏杂交瘤细胞，收集传代3、4、5次数的细胞上清，并用ELISA方法检测其效价。 结果显示，效价稳定，表明MCFl (CCTCC NO. C201170)和MCF2 (CCTCC N0. 201181)细胞株不同传代次数的细胞均能够稳定的产生单克隆抗体。步骤5、单克隆抗体反应特异性(1)间接ELISA方法(同实施例2步骤3)检测所得的两株单克隆抗体mcfl和 mcf2与实施例1纯化的H-FABP和购买的Hytest的H-FABP特异性反应。实验结果见表1。 结果表明，单抗mcfl和单抗mcf2与实施例1纯化的H-FABP和Hytest公司的H-FABP均有特异性反应，且 OD 值高于 9F3 O^atty Acid Binding Protein (FABP)，目录编号4F29_9F3， Hytest 公司) 表IELISA检测mcfl和mcf2单抗与纯化H-FABP和Hytest-H-FABP的特异性反应
权利要求
1.一种分泌心脏型脂肪酸结合蛋白的杂交瘤细胞株MCF2，与2011年9月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO :C201181。
2.权利要求1所述的杂交瘤细胞株F2分泌的抗人心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体 mcf2。
3.权利要求2所述的抗人心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体mcf2在检测或纯化人心脏型脂肪酸结合蛋白中的应用。
4.权利要求2所述的抗人心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体mcf2在制备人心脏型脂肪酸结合蛋白检测试剂中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述的人心脏型脂肪酸结合蛋白检测试剂为检测检测人心脏型脂肪酸结合蛋白的Western Blot试剂、ELISA检测试剂、胶体金检测试齐LU
全文摘要
本发明属于生物医学领域，公开了一株单克隆抗体mcf2及其应用。一株分泌心脏型脂肪酸结合蛋白的杂交瘤细胞株MCF2，与2011年9月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No.C201181。所述的杂交瘤细胞株MCF2分泌的心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体mcf2，该单抗效价高、特异性强。所述的心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体mcf2可在检测或纯化人心脏型脂肪酸结合蛋白中的应用。
文档编号C12N5/20GK102358895SQ201110335959
公开日2012年2月22日 申请日期2011年10月28日 优先权日2011年10月28日
发明者卞智萍, 吴恒芳, 徐晋妉, 杨笛, 陈相健, 顾春荣 申请人:南京医科大学第一附属医院