专利名称：一种新型糖化酶vga及其基因和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种新型糖化酶VGA及其基因和应用。
背景技术：
糖化酶是世界上产量最大、应用范围最广的一种酶类，其应用历史悠久，我国早在 1500年前即开始采用糖化曲酿酒。糖化酶全称为葡萄糖淀粉酶(GAcoamylase，EC3. 2. 1. 3)，又称Y -淀粉酶，简称糖化酶。糖化酶是可以淀粉、糊精等为底物，在一定条件下从淀粉的非还原性未端开始依次水解α _1，4葡萄糖苷键产生葡萄糖的淀粉葡萄糖甘酶。糖化酶可应用于酒精、酿酒、葡萄糖、果葡糖浆、抗菌素、乳酸、有机酸、味精、棉纺厂等各个行业，其应用范围极广，对国民经济发展具有重大影响。糖化酶的主要生产菌种为霉菌，我国多用红曲霉、黑曲霉以及根霉，其中根霉以固体发酵为主，红曲霉和黑曲霉多以深层液体发酵生产。目前，对糖化酶特性方面的研究主要集中在热稳定性、ρΗ作用范围等方面。现在工业应用的糖化酶其耐受温度一般在85°C以下，超过该温度则酶活损失巨大，甚至完全失活； 另外，目前所生产及应用糖化酶普遍PH作用范围较窄，一般为4. 5 6. 5，这些均从一定程度上限制了糖化酶的应用。因此，有必要开发出一种新的糖化酶，在提高其产酶性能的同时，在一定程度上提高其耐热性能及PH作用范围。本发明即是采用分子生物学技术，构建出了一个高效糖化酶基因工程菌株，并利用该菌株进行糖化酶生产。本发明所提供的糖化酶基因，经序列比对，为一种新型的糖化酶基因，该基因所表达的糖化酶，具有比活高、耐高温、PH作用范围广等优点，可以广泛应用于各种工业生产，具有良好的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型糖化酶VGA。本发明的另一目的是提供编码上述新型糖化酶的基因VGA。本发明的另一目的是提供包含上述新型糖化酶基因VGA的重组载体。本发明的另一目的是提供包含上述新型糖化酶基因VGA的重组菌株。本发明的另一目的是提供制备上述新型糖化酶的方法。本发明的另一目的是提供上述新型糖化酶的应用。本发明的一种生产上述新型糖化酶VGA的黑曲霉AN070902 (Aspergi 1 Ius niger)，于2010年10月20日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为CGMCC No. 4235，其相关信息记载于申请号为CN201010566249. 0的专利申请中，已于2011年4月6日公开O
从上述菌株中分离得到--种糖化酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示
MFSRLSLLRPSLNEATVARTISKRATLDSW GLVCTGLANV NAILNIGADG
AffVSGADSGI60
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TVLPGAEFES600
VSEffSEDPRNTSATTVDWTRYETVQPAGCT KYFIIREDSD 640
该酶蛋白由640个氨基酉蹇组成，理论pI/Mw:4. 35/68617.06。
本发明还提供了编码上述糖化酶的基因，该基因的序列如SEQ ID NO. 2所示
atgttctcgcgactatctctcctgaggcccagcttgaacgaagcgaccgtggctcgtact60
atttccaagcgcgcgaccttggattcatggggcctcgtctgcacagggttggcaaatgtg120
aatgccatcctgaacatcggggcggacggtgcttgggtgtcgggcgcggactctggcatt180
gttgtcgctagtagccccacggataacccggactacttctacacctggactcgcgactct240
ttccgaaatgggtctcgtcctcaagaccctcgtcgatctcgagataccagtctcctctcc300
attgtccagggtatcagtaacccctctggtaccattgagaactacatctccgcccaggca360
gatctgtccagcggcgctggtctcggtgaacccaagttcaatgtcgatgagactgcctac420
tctactggttggcggggaccgcgacaggatgctggtccgctggcaagaactgctatgatc480
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ctcgttcccaacgacaggtcgtatgtgctgtacgctcaatggcagaacacagatggatat600
acgtttattgctcaagtgcaccttcgcgcctgggaactcgaaggcgtcaattcgtctttc660
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accggcttctggttcagcattaacctggcccccgaagcaatttacctctgcctgcagtcc780
agcttcgatagcggccgttccgacaaggcaaccaacctcggaagcctgatccacaccttt840
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ctattcattctcaacgacactctcggtagtcacaacaaggttgtagaggaccgctcatct960
ttctggctgtgcgctaccttggccgcagaggagcctgacacgtactacaacggcaacccg1020
gaggacagcgttgcggctgtgggtcggtactaccagttggatctagcttactggcaggac1080
gggaagcagtcggagttggtcgtgacagatgactcgctgttcaagttcgcactgtacagc1140
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aaggtgactgccgatttcggctctttcgtcgctgatgctggcaccacttactcttcgtcc1260
atgtcctcctaccaagaggactctgataagcagtccgagggccttgctcgcgacctgacc1320
tacacgcgttccaacgtcgtggcttctcctggcacctgtgcggcctctacaggtgccatt1380
tggtattctgctctggctctgaacaccgccagtccgatcgtgactgctggcaccggcact1440
tacagcaccgtgactagtgtcacctcgtggggctgggagaccgcctctagcgtgagcccc1500
acgacggctaccactcccggaagctccggcaccgtgtcgaccaagagcaccactaccgcg1560
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tccactagcgacctcccgtgggtctatactactgtgctgccgggtgctgagtttgagtcg1800
gtgtccgagtggagtgaggatccccgaaacacctcggcgacgactgtggactggacccgg1860
tacgaaaccgttcagcctgcgggatgcacgaagtactttatcattcgcgaggatagcgac1920
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经检测，该酶在PH 2.0 7. 5的条件下酶活稳定，对淀粉的水解效果显著，另外，
该糖化酶的耐高温性能较好，在85°C水溶液中处理lOmin，其酶活损失低于15%，完全符合各种工业需求，适合作为一种新型耐高温糖化酶进行应用。本发明还提供了包含上述新型糖化酶基因VGA的重组载体，优选为 pPICz α A-VGA。将本发明的新型糖化酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间， 使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的糖化酶基因插入到质粒PPICzaA上的EcoR I和)(ba I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOXl启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒 pPICz αA-VGA。本发明还提供了包含上述新型糖化酶基因VGA的重组菌株，优选重组菌株是毕赤酵母菌株X33。本发明还提供了一种制备酶VGA。上述新型糖化酶VGA的方法，包括以下步骤1)用上述重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；2)培养重组菌株，诱导重组糖化酶VGA的表达；以及3)回收并纯化所表达的糖化其中，步骤2、中，重组菌株在发酵罐中的发酵过程可分为3个阶段第一阶段为菌体培养阶段，按10%比例接入种子，培养18 M小时，以补完葡萄糖、PH及DO上升为标志；第二阶段为饥饿阶段，当葡萄糖补完之后，不流加任何碳源，当溶氧上升至80%以上即表明该阶段结束，为期约30 60min ；
第三阶段为诱导表达阶段，流加诱导培养基，并且保持溶氧在20 %以上，整个培养时间为180 200小时之间。发酵结束后，发酵液可通过陶瓷膜或超滤膜处理后获得粗酶液。本发明还提供了上述新型糖化酶VGA的应用，优选该酶在水解淀粉及在食品、制药工业中的应用。利用本发明的方法高效表达上述的新型重组糖化酶，可达到125000U/mL左右的发酵水平，同目前已有的现有技术相比，本发明的新型糖化酶通过高效表达后能够达到较高的发酵水平，在工业生产中可大大降低生产成本，使其在食品、制药等工业中显示出更大的应用潜力。该酶在PH 2.0 7. 5的条件下酶活稳定，对淀粉的水解效果显著，另外，该糖化酶的耐高温性能较好，在85°C水溶液中处理lOmin，其酶活损失低于15%，完全符合各种工业需求，适合作为一种新型耐高温糖化酶进行应用。
图1新型重t&糖化酶在50L罐中的发酵过程曲线。
图2新型重t&糖化酶的最适反应温度。
图3新型重t&糖化酶的最适反应PH值。
图4新型重t&糖化酶的耐热性能曲线。
图5新型重t&糖化酶的PH耐受性能。
具体实施例方式以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》 (第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行； 所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。实验材料和试剂1、菌株与载体大肠杆菌菌株!"opIO、毕赤酵母X33、载体pPICzalphaA购自hvitrogen公司。黑曲霉AN070902 (Aspergi Ilus niger)，于 2010 年 10 月 20 日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为CGMCC No. 4235，其相关信息记载于申请号为 CN201010566249. 0的专利申请中，已于2011年4月6日公开。2、酶与试剂盒逆转录酶superscript III、RNA提取试剂盒购自hvitrogen公司。质粒DNA提取试剂盒，胶回收试剂盒，PCR纯化试剂盒购自上海生工公司。限制性内切酶购自！^rmentas 公司。3、培养基基本盐培养基磷酸二氢铵5%、磷酸二氢钾0. 5%、七水硫酸镁1. 5%、硫酸钾 1.95%、硫酸钙0. 1%、氢氧化钾0. 1%、消泡剂0.03%。高压后每升加4. 35毫升PTMl
PTMl (微量盐溶液)硫酸铜0. 6 %、碘化钾0. 018 %、一水硫酸锰0. 3 %、二水钼酸钠0. 02 %、硼酸0. 002 %、六水氯化钴0. 05 %、氯化锌2 %、七水硫酸铁6. 5 %、浓硫酸0. 5%、生物素 0. 02%。实施例1、黑曲霉(Aspergillus niger)的产酶特性试验采用筛选出的产糖化酶黑曲霉(保藏编号=CGMCC No. 4235)进行摇瓶发酵实验， 其发酵培养基如下玉米淀粉10%、豆饼粉 2%、玉米浆 1.5%、MgSO4 0.1%, K2HPO4 0. 1%发酵培养基在121°C、0. IMI^a下灭菌20min，冷却后接种，于32°C、200rpm条件下培
养2-3天。发酵结束后，将发酵液离心，取上清液进行糖化酶的反应温度、耐热性能、pH作用范围等酶学性质测试。测试结果表明，该霉菌所产的糖化酶最适反应温度为40°C左右，并具有良好的耐热性能，经85°C水溶液状态下处理lOmin，酶活保存率仍可达到80%左右，另外该糖化酶还具有PH作用范围广等特点，这些方面的特性均较大程度上优于现有的糖化酶产品，更适于各行业生产的需求。由于该黑曲霉的糖化酶生产性能不高，因此，需要对该菌种进行相应的改造，以提高其生产性能。实施例2、黑曲霉(Aspergillus niger)糖化酶VGA基因的克隆运用RNA提取试剂盒，提取黑曲霉(Aspergillus niger)总RNA，按照逆转录酶 superscript III Reverse Transcriptase 操作说明合成第一链 cDNA。以 cDNA 为模板， 设计糖化酶引物进行PCR扩增，将PCR产物由EcoRI和)(baI进行双酶切，然后与经过同样酶切的毕赤酵母表达载体pPICzalphaA相连接，连接产物转化大肠杆菌ToplO感受态细胞， 经抗生素&0(^11筛选后，获得阳性克隆。提取阳性克隆的质粒。送样到上海英骏生物公司测序，测序结果表明，所获得克隆DNA插入片段含有糖化酶基因完整的开放阅读框。该糖化酶基因VGA，全长1923bp(SEQ ID NO. 2)，编码640个氨基酸(SEQ ID NO. 1)。得到的重组表达载体命名为pPICz α A-VGA。扩增所用引物如下VGA 5EcoRI 5，AATGAATTCTCACCGCCAGGTGTCAG3，VGA 3XbaI 5，CAACTCTAGAATGTCCGAGCAATACG3，实施例3、包含新型糖化酶基因VGA的毕赤酵母工程菌的构建优化后的新型糖化酶基因VGA，采用EcoRI和)(baI进行双酶切，重新连接到经相同双酶切的载体PPICz α A上，获得重组表达载体pPICz α A-VGA。然后采用McI进行线性化，线性化后的重组载体电击转化毕赤酵母X33，电转化后涂布于YPDGe0+)平板上进行筛选，得到毕赤酵母重组菌株。实施例4、新型糖化酶重组菌株的高效表达将筛选获得的新型糖化酶重组菌株X33-9/pPICZ α A-VGA进行高密度发酵培养。配制20L基本盐培养基，在50L自动控制发酵罐中灭菌后，冷却至常温备用。用氨水和磷酸调节发酵液的PH值至4. 6，通过调节转速和空气流量控制溶氧大于20%以上，发酵温度为30°C。整个发酵过程分3个阶段
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第一阶段为菌体培养阶段，将重组菌株X33-9/pPICZ α A-VGA按照10%的接种量接种至发酵罐中，流加已灭菌的4L 50%的葡萄糖，培养M 30小时，以补完葡萄糖为标志；第二阶段为饥饿阶段，当葡萄糖补完之后，不流加任何碳源，当溶氧上升至80%以上，ρΗ上升即表明该阶段结束，为期约30 60min ；第三阶段为诱导表达阶段，流加诱导培养基，并且保持溶氧在20%以上，培养时间在180 200小时之间。发酵液可通过陶瓷膜或超滤膜处理后获得酶液。在发酵过程中的不同时间点取样测定酶活，发酵过程中新型糖化酶的表达情况如图1所示，发酵19 的发酵液酶活为125000U/mL。实施例5、新型重组糖化酶的活性分析按中华人民共和国国家标准(GB 8276-2006)进行检测。1个酶活单位(U)定义为lmL酶液或Ig酶粉在40°C、pH 4. 6的条件下，1小时水解可溶性淀粉产生Img葡萄糖，即为一个酶活力单位。实施例6、新型重组糖化酶的性质测定1、新型重组糖化酶比活测定将上述发酵液中的耐高温糖化酶通过离子交换柱⑴Sepharose Fast Flow Ion Exchanger)纯化，采用改良型Bradford试剂盒(上海Sangon公司)测定蛋白浓度，得出该耐高温糖化酶比活为10420U/mg。2、新型重组糖化酶的最适反应温度及ρΗ测定最适反应温度将酶液稀释适当倍数，在不同温度(20 100°C )下反应，测定该糖化酶的酶活。以最高酶活力为100%，其它温度下测得的酶活与之相比，即得到该温度下的相对酶活。最适反应温度曲线见图2。最适反应ρΗ 将稀释后的酶液，与不同pH(2. 0 9. 0)检测条件下，检测该糖化酶的酶活力，并采用最高酶活为100%，其他检测结果与之相比，即得到不同PH检测条件下的相对酶活。最适反应PH曲线见图3。结果如图2和图3所示该新型重组糖化酶的最适反应温度为45°C，最适反应ρΗ 为 5. 0。3、新型重组糖化酶的耐热性能测定将酶液稀释适当倍数，在不同温度下处理IOmin后，以未处理的酶活力为对照 100%，测定耐高温糖化酶的相对酶活，结果见图4。结果显示该新型糖化酶的耐热性能良好，完全可达到工业用糖化酶的要求。4、新型重组糖化酶ρΗ稳定性测定将稀释后的酶液与不同ρΗ的缓冲液混合，室温放置2h，以未处理的酶液为对照， 测定耐高温糖化酶的相对酶活，结果如图5所示。该糖化酶的最适ρΗ为5. 0，并且在pH 2. 0 7. 5范围内相对酶活均可达到80% 以上，说明该新型糖化酶的PH作用范围广。5、金属离子和EDTA对新型重组糖化酶活力的影响将含有ImM K+、Mg2+、Ca2+、Zn2\ Fe2\ Fe3\ Mn2+、Co2+、Cu2+ 和 EDTA 的溶液与稀释适当倍数的酶液混合，室温放置30min，以未处理的酶液为对照，结果如表1所示。
结果表明，Mg2+、Fe2\ Ca2+、Mn2+对该糖化酶有一定的激活作用；K+、EDTA、Zn2+对酶活性没有什么影响；其余金属离子Cr3+、Cu2+和!^3+对酶活性均有不同程度的抑制作用，SDS 则完全抑制了酶的活性。表1金属离子和EDTA对重组糖化酶酶活力的影响
权利要求
1.一种新型糖化酶VGA，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.一种新型糖化酶基因VGA，其特征在于，编码权利要求1所述的糖化酶。
3.根据权利要求2所述新型糖化酶基因VGA，其特征在于，其碱基序列如SEQID NO. 2 所示。
4.包含权利要求2或3所述新型糖化酶基因VGA的重组载体。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于所述重组载体为pPICzα A-VGA。
6.包含权利要求2或3所述新型糖化酶基因VGA的重组菌株。
7.根据权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为毕赤酵母菌。
8.一种制备新型糖化酶VGA的方法，其特征在于，包括以下步骤1)用权利要求4的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；2)培养重组菌株，诱导重组糖化酶VGA的表达；以及3)回收并纯化所表达的糖化酶VGA。
9.权利要求1所述新型糖化酶VGA的应用。
全文摘要
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种新型糖化酶VGA及其基因和应用。本发明提供了一种新型糖化酶VGA，其具有如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列，且本发明还提供了编码上述新型糖化酶VGA的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，以及包含该基因的重组载体和重组菌株及其应用。本发明的新型糖化酶VGA在pH 2.0～7.5的条件下酶活稳定，对淀粉的水解效果显著，另外，该糖化酶的耐高温性能较好，在85℃水溶液中处理10min，其酶活损失低于15％，完全符合各种工业需求，适合作为一种新型耐高温糖化酶进行应用。
文档编号C12N1/19GK102382807SQ20111033551
公开日2012年3月21日 申请日期2011年10月28日 优先权日2011年10月28日
发明者李阳源, 罗长财, 钟开新 申请人:广东溢多利生物科技股份有限公司