专利名称：一种栉孔扇贝热休克蛋白基因启动子的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体地说是一种栉孔扇贝热休克蛋白基因启动子。
背景技术：
栉孔扇贝是我国重要的海水养殖种类，在我国北方有广大的养殖面积，具有重要的经济意义。当前，栉孔扇贝的养殖业存在着种质退化、病害频发的难题，严重制约了我国栉孔扇贝养殖业的健康发展(张福绥，杨红生.栉孔扇贝大规模死亡问题的对策及应急措施.海洋科学，1999，2 :1-5.)。转基因是物种种质改良的重要手段，其一般指将人工构建的基因功能元件导入到 生物体基因组中，达到改变生物体的性状的目的。当前，转基因技术在经济动植物的性状改良中表现出了巨大的潜在应用价值，如转抗病害基因农作物，转生长因子鲑鱼以及可以在乳腺中分泌药物的转基因动物(生物反应器)等。转基因技术在栉孔扇贝中也有着广阔的应用前景，如将抗病基因导入扇贝中，产生抗病品系，将有可能从根本上解决当前扇贝养殖业中夏季病害频发的顽疾；将生长因子类的基因导入扇贝中，有希望培育出高产、低生长周期的品系，缩小养殖成本，增加养殖效益。当前，在栉孔扇贝中尚无转基因的应用。除导入及整合方法的限制外，可用基因元件(包括扇贝源启动子和功能基因)的缺乏也是重要的限制因素之一。启动子是人工构建转基因载体的不可或缺的重要组成成份，它决定了所转入的基因的表达情况，如表达时间、部位、强度等等。热休克蛋白HSP70是一种重要的生物活性蛋白，参与了生物体内众多的生理过程。Hsp70基因表达的一个重要特征是呈诱导型表达，在高温或病原刺激下有明显的上调表达；而这种表达特征主要取决于hsp70基因的启动子组成。将hsp70基因的启动子元件应用于转基因研究中，可以通过控制温度的高低方便地改变导入基因的表达时机和表达量，使生物体的性状按照人类的意志进行改变，有重要的应用价值。
发明内容
本发明目的在于提供一种栉孔扇贝热休克蛋白基因启动子。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为—种栉孔扇贝热休克蛋白基因启动子栉孔扇贝热休克蛋白基因启动子为下述任一项(I)栉孔扇贝热休克蛋白基因启动子为序列表中SEQ ID NO. I碱基序列；(2)与序列表中SEQ ID NO. I限定的DNA序列具有80%以上同源性的DNA序列；(3)是序列表中SEQ ID NO. I的片段、遗传变体或缺失体，且能控制下游基因转录的DNA分子。所述启动子作为启动海洋生物组织特异性地表达目标基因的启动子的用途。所述启动子与与之进行可操作的有效基因连接，而后插入载体中构成表达载体。所述有效基因如免疫相关基因LGBP、hsp70、lectin、toll等，生长相关基因如myostatin、actin、tubulin、EGF等，其它重要生理基因如vasa、SOX、BMP、NOTCH等；载体为表达载体如pCMVp-NEO-BAN、pEGFP、pEGFT-Actin、pSV2、CMV4 等。。而后以可表达的方式将有效基因与所述的启动子连接，得重组片段；将上述重组片段插入载体中；用该载体转化宿主细胞，培养该细胞表达有效基因。本发明具有如下优点
I.本发明获得栉孔扇贝热休克蛋白基因启动子，其采用BAC克隆全测序及启动子预测方法，比传统的染色体步移方法更简单快捷。2.本发明将栉孔扇贝热休克蛋白基因启动子用于转基因载体构建的优势在于(I)热休克蛋白hsp70是一种诱导表达的基因，其基因启动子在热刺激后表现出高表达现象。相比于一些持续性表达的载体，其在表达某些对扇贝有害的基因时就体现出较强的优势，如caspase基因，可以诱导其在特殊时期表达，避免持续表达导致机体伤亡。另外，热休克蛋白参与了扇贝体内多种生理过程，必定为一个高效表达的调控元件；用热休克蛋白基因启动子构建转基因载体，所携带的外源基因表达效率很可能会大大提闻。(2)在扇贝转基因实验中使用扇贝自身启动子，不会带入病毒等其他生物的核酸序列，具有更高的生物安全性，有利于将来转基因扇贝进入市场。3.本发明使用EGFP基因为报告基因构建转基因载体的优点在于EGFP是加强型绿色荧光蛋白，容易观察和检测，能极大地提高转基因动物的筛选效率，有利于扇贝转基因技
术的建立。
图I为栉孔扇贝转基因表达载体pCfHs pPI-EGFP构建示意图。图2为栉孔扇贝热休克蛋白基因启动子表达载体PCfHs pPl-EGFP转染昆虫细胞sf9的荧光观察结果图(其中，栉孔扇贝热休克蛋白基因启动子载体转染昆虫细胞sf9的荧光观察。a为未热激组荧光表达情况；b为热激后6h突光表达情况；c为热激后48h突光表达情况)。
具体实施例方式本发明利用BAC克隆筛选技术、启动子预测技术、DNA扩增及测序技术克隆了栉孔扇贝热休克蛋白基因启动子；在此基础上利用载体构建技术将所克隆的启动子与携带加强型绿色突光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein, EGFP)的质粒结合，构建了携带栉孔扇贝自源启动子和EGFP报告基因的表达载体。实施例I含栉孔扇贝热休克蛋白基因hs p70的BAC克隆的筛选根据柿孔扇贝hsp70基因序列(GenBank No. AY206871)设计Overgo 探针(正向引物 5' - TAGGAGATGCCGCCAAGAACCAA-3 '，反向弓丨物5' -GGGATTCATTGCCACTTGGTTCT-3')，对 BAC 文库高密度 DNA 薄膜进行 Overgo 探针杂交，筛选以确定含有hsp70基因的阳性克隆在文库中的位置，并进行PCR验证。步骤如下I.预杂交将高密度DNA薄膜正面向上放入杂交盒，杂交盒内倒入预热至50°C的杂交液，将杂交盒放到杂交炉中，50°C缓慢转动，预杂交至少2h。2.探针制备将Overgo的两条单链等摩尔数混合，95°C lOmin，然后室温放置IOmin0
稀释Overgo探针至25ng/li I,按照以下体系进行探针标记，37°C延伸Ih :LS012u I ；0. 5U/ul Klenow 2u I ； [32P]-dCTP 2u I ；Overgo probe DNA 6 u I ；ddH20 3u I ;总体积25 u Io3.标记反应体系中加入等体积(25 U I) 0. 4M NaOH,室温放置IOmin ；4.将放射性同位素探针小心加入杂交液，50°C杂交炉内缓慢转动杂交48h。5.洗脱将含有放射性[32P]探针的杂交液小心倒入放射性废液存储罐中，加入预热到50°C的杂交洗脱液，放回杂交炉缓慢洗脱30min ；6.将高密度DNA薄膜正面向上放到吸水纸上，待上表面多余洗脱液被吸水纸吸收后用塑料保鲜薄膜将高密度DNA薄膜密封包裹起来，在暗室中用X光底片曝光。7.对照X底片上的阳性信号位置，找到相应的阳性克隆编号。8.挑取阳性克隆进行活化、PCR验证并保种。根据公布的hsp70基因序列(GenBank No. DQ466080)设计正向引物5 ' - TCTCGACACTAGGCACTTC-3 ';反向引物:5' -AGCACTCAGGTAGGCGTTT-3'。以阳性克隆菌液为模板，进行PCR扩增。将PCR产物测序，证实确为扇贝热休克蛋白基因hsp70序列。对确定含有柿孔扇贝热休克蛋白基因序列的BAC克隆进行全测序。栉孔扇贝热休克蛋白基因启动子，如SEQ ID NO I.所示序列I GCTCACTCTACAGTTGGTOGCCCCGATGTCCACACCMATACTOGTGGAOGGGCTGGTTT 6061 CAGTTTAGGAGCTATGTTGTTCATTCTCGTTATCTGTATTGATTACAAATCGCTGCAACA 12012 AACAGTTTTTTTTTGTTGACAAAAAGTGTCGATTTGAOGAAAGTGGGGAAAAAAGATGGG 180181 AAATTGTTTGGTGGACACAAGAAAACACTCTCAACAACTTTGAAAATGATTAATATACTT 240241 GGATTCAAAACTTTAGCATT0GCATTCACAAGTAGTC0GAATAAA0GTTATTCGA0GACA 300301 GGCCGATATTAAAAACAGTCGATATAACGTCAGAATAATTCGGACTAACTTACGTTGTAC 360361 ATGTGTTGTACAAATOGAAACACTGGACTGTGATATCTOGACACATATCCATAGTACTTC 420421 ATCCAOGAACTATTCTAGATTAGTACTCTATGTCAAATAAACGTTTTATTTAACTATTTT 480481 CAAGTCACAGACATACACAAGAATCAACCCAACCGCCAAATTTGTATCTAACCTGAAAGG 540541 TGTACAAAAAATGCTOGTCTAAATGGAAGTATAAOGCATGGTAAGAOGTTTTGAAATTTA 600601 ATTCTAATTCATCTTAAGGTAAATTCTTTTTACCTCAGGTTAAGTTTTTTTTTAAATTAA 660661 AAAATAGTTTTTACTTAAGTGAAACAAAAAAAATTATAATTTTACTCTGATACATTAGTT 720721 TAAATGGTCGAAAGTAAAACACACATGGACCCOGGTTTCATCAAOGTTCCTTAACTTAAA 780781 ATTTTCCATATGAAAGCATTACAGAATTTTAAGAAAAAGCCTTAGTTGAGGAACCTTCCT 840841 TAAATTATTTAATTATTTTTCTCTTAAATTTTAAGTTAAGGAGTTTCCTTAAGTTAATGA 900901 AOGTTGATGAAACOGGCTGATGATCAGTTAATAACTGGACTAGACCATTTTGTCTTATAA 960961 GAAAGAACAAAGATATTATTTGCATATTCACTTAAGOGAAAAAGAATTCCTAATAAGGTT 10201021 ATAAAACATATTTAACTTAAATGAAATTCATTTGACTTAAGCAGAATTTAACATAATGCA 10801081 AATTATAATGATTATTTACATTCGTTTAAAATGGAAAAAAAATATGOGAATAATTTAACC 11401141 TAATGGTGAAAACGGTTTGCCATAATTACGCAACATTAAAAGAAAAGAATACAACACATC 12001201 AGCACAAGCTATTACAATGTAGATATCTTAGGTGGATTCCCTGAAAACCAACTTACATCT 1260、
1261 TACAAOGATGTGTTTTGATAATGTAGTTAGTCAGTGCAACCTGCCAAGTCTAAACTTTTG 13201321 GTTATCTATAAATGTAAAAGTGGAGAGTATAAAGTCATCTTACTAGCTCAGTCTAGOGGG 1380
1381 AATTTCCCTTTAGCCTAGTTTGTCATTAGTGAGATGTCGTAGTAGTTTGAACCAOGGCAC14401441 GAACAGGCCGGGTTTTTTCATTACTCCTTTAATTACTAATCCTATTACATAAGAAATACA15001501 TTTGTACACTGTGCTAGTCAACCTCOGATTOGAAAATTAAATTCCTTATTGCCAAAACAC15601561 CATTCAAGTAGCTATAGGTTACATCCACACACACACATCCACACATTTACACACATATCA16201621 CATACACAGGTATGAGCTTTATTGCATACATGTAGATCTATGTGTGTTCATTTCAAATAC16801681 ATACTAGGCCTAATACACTTTGGACTGTCACAAAATGACAAACAGAAAOGTACATATATA17401741 TACTAACATGTCATCTTGTTAGTCTOGTCTTATATTATGACTTTCCGCGTCCTAATCTTG1800
1801 CCTTTTTTTAACATAGTACCTGTACGTTTCTTATTTACCTGTATOGGTCCTTGTTTGTTG18601861 ACATGTTGCCAAGTCACATAATTCTGTTAGAGTTGTTTCCCTTCAAATOGTTATTTGGGG19201921 TGCACGGGTTCATGCATCATCGAACAAATTAAGAAAACCATACTGATAACTGAGTTTGAG19801981 TAAOGGCTTTATTTTGTTATTTTACTTTCATAAAAAACACGATTAATCTACTACAGAAAA20402041 AATGATGCATGGATACTATGTTTTCTTATATTAAATCATTGATTTGCTOGGTGACAATTT21002101 TTTTATTGATCTAAGCCTAOGTTATTACCTGTTAAATTTATCCAATTTGGATACTAATCC21602161 AATTTGATTACTGCTTCCTTGTTAAGTTGTACAATGOGATATTATGAAAGAAATTTTATT22202221 ATGATGATAGGGAATCAAGTATTTTTCTTCTAATAGGCTTAGTTATGGTCACGAATATTC22802281 GCCAAGTTTCAOGAAGTAGGCOGATTATTTAACATAATTGAGCAOGTGACTTACTTCTCT23402341 TCTCTGATTGGTACATTGATTGTGTTCTGGAATCTTCCAGAAGTGATGTCATATCCTCOG24002401 GTGOiCATAAAAAOGAGTCGCATAAOGCCGGGAACCAAGAACAGACOGGAGCGAGGGGTT24602461 TAAGCTGTGATAAGAACATATAATATTTGGCTCTACTATTCAAGTAAACTCATCAAAACA25202521 CAGGTAAGATAOGTAAATCATCCCAAGGAACATTTGATTATATTTGAAGAATOGGGAATA25802581 ATATTGAGAAATCAAATTAAAATTGAATTATTTTCTGGGGAGTAGTGCTCTCATGCATTG26402641 ATGGGGTGTTACCACAATGGCOGCACCAACGCGAAACCGTGTAATTATTAGAAGAAAGTT27002701 CAATGAAAGGCAAACTAATTCA 2722(a)序列特征*长度2722碱基对*类型核苷酸*链型单链*拓扑结构线性(b)分子类型DNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源柿孔扇贝(Chlamys farreri)(f)特异性名称Promoter实施例2栉孔扇贝热休克蛋白基因启动子片段的克隆分析测得的BAC克隆全长，将编码热休克蛋白基因hsp70的第一个碱基记为+1。取-4000至0位置的碱基序列进行启动子预测。在-1700和-2400碱基处分别预测到两个分值很高(分别是I. 008和I. 116)的启动子区域。因该基因在-1400碱基处还有转录，故将-3900至-1200间的碱基序列定为热休克蛋白基因的启动子区。在该启动子区两侧设计引物，并加上不同的酶切位点(Xho I和BamH I)，用聚合酶链式反应(PCR)扩增启动子区。设计正向引物Fl 5/ -CTCGAGGCTCACTCTACAGTTGGTCGCC-3';及反向引物Rl:5' -GGATCCTGAATTAGTTTGCCTTTCATTGAAC-3'，并在以下的反应体系中进行聚合酶链式反应(PCR)扩增SEQ ID NO I.所示序列表中启动子区，PCR产物电泳并进行胶回收。反应体系模板(BAC质粒)IiU ;正向引物(IOpmo I/Ul) 0. 5 ;反向引物(10pmol/u 1)0. 5u I ； IOxTaq DNA 聚合酶缓冲液 2. 5 y I ；MgCl 2 (2. 5 u mol /L) I. 5 u I ;脱氧核苷酸混合物dNTP (IOmmoI/L) 0. 5 u I ；Taq DNA聚合酶0. 25 U I ;灭菌水18. 25 U I ;总体积 25 u I0将胶回收纯化所得PCR产物连接pMD19-T simple载体过夜；将连接产物转化DH5ci大肠杆菌菌株，涂布含氨苄青霉素的平板，37°C培养过夜；挑选含重组子的阳性克隆，利用载体引物M13 (正向引物5 ' -GTTTTCCCAGTCACGAC-3 ,;反向引物5' -CAGGAAACAGCTATGAC-3')及启动子序列特异引物PCR扩增并测序验证，具体为步骤如下挑取10个单克隆，并以挑取的单克隆细菌为模板，分别用上述两组引物对其进行PCR扩增。反应体系为模板(单克隆菌液)lu I ;正向引物(10pmol/u 1)0. 5 u I ;反向引物(lOpmol/u 1)0. 5u I ； IOxTaq DNA 聚合酶缓冲液 2. 5 u I ；MgCl2 (2. 5 u mol/L) I. 5u I ;脱氧核苷酸混合物dNTP (IOmmoI/L) 0. 5 u I ；Taq DNA聚合酶0. 25 U I ;灭菌水18. 25 U I ;总体积 25 u I0两组引物都有扩增、且电泳条带大小与序列长度一致的的单克隆视为阳性克隆。提取阳性克隆的质粒(用TIANGEN普通质粒小提试剂盒，目录号DP103)，对提取的质粒进行测序，证实质粒中所含的序列为目标启动子序列。实施例3启动子表达载体与转基因载体pCfHspPl-EGFP的构建用限制性内切酶Xho I和BamH I对提取的质粒进行双酶切，并回收SEQ ID NO
I.所示序列表中启动子片段；再用限制性内切酶Xho I和BamH I对载体pEGFP_l进行双酶切，并回收被线性化的pEGFP-1载体；用T4连接酶过夜连接回收的启动子片段和PEGFP-I载体。连接体系如下，PEGFP-I与启动子片段的摩尔比控制在I : 2-6之间。将连接产物转化DH5a大肠杆菌菌株，涂布含卡那霉素的平板，37°C培养过夜。挑选含重组子的阳性克隆。利用pEGFP-1载体引物和启动子特异引物同时检测。连接体系T4连接酶 IiU ; IOx Buffer I yl ;pEGFP_ll iU ;启动子片段 7 iU ;总计，10 u I。其中pEGFP-1载体引物如下正向引物FI : 5' -CTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGG-3'反向引物R 1:5' -CCTTGATGCCGTTCTTCTGCTTGTC-3'。实施例4转基因载体pCfHspPl-EGFP的活性验证(I)昆虫细胞sf9的培养及传代，将对数生长期的sf9细胞经计数，以6xl05/ml的细胞密度传代至6孔板中，27°C过夜培养。(2)转染，在细胞密度达到铺板面积80-90%时开始转染。
转染mix的配制用超纯水配制IOOul浓度为20ng/ul转染载体。混合均匀后加Fugene HD转染试剂7ul，混合均匀。室温放置15分钟。加入到6孔板中，培养基液面以下，混合均匀。(3)转染18小时后对一组进行热激42°C 30分钟，另一组不做处理。热激后6小时观察两组荧光表达情况，未热激组没有发现荧光，热激组有荧光表达。热激后48小时观 察荧光表达情况，未热激组还是未发现荧光，热激组有荧光表达(参见图2)。
权利要求
1.一种栉孔扇贝热休克蛋白基因启动子，其特征在于栉孔扇贝热休克蛋白基因启动子为下述任一项 (1)栉孔扇贝热休克蛋白基因启动子为序列表中SEQID NO. I碱基序列； (2)与序列表中SEQID NO. I限定的DNA序列具有80%以上同源性的DNA序列； (3)是序列表中SEQID NO. I的片段、遗传变体或缺失体，且能控制下游基因转录的DNA分子。
2.—种权利要求I所述的栉孔扇贝热休克蛋白基因启动子的应用，其特征在于所述启动子作为启动海洋生物组织特异性地表达目标基因的启动子的用途。
3.按权利要求2所述的栉孔扇贝热休克蛋白基因启动子的应用，其特征在于所述启动子与与之进行可操作的有效基因连接，而后插入载体中构成表达载体。
4.按权利要求3所述的栉孔扇贝热休克蛋白基因启动子的应用，其特征在于以可表达的方式将有效基因与所述的启动子连接，得重组片段；将上述重组片段插入载体中；用该载体转化宿主细胞，培养该细胞表达有效基因。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，具体的说是一种栉孔扇贝热休克蛋白基因启动子。采用BAC克隆筛选及测序分析、启动子预测、DNA扩增及测序、载体构建等技术得到栉孔扇贝热休克蛋白基因启动子，具有序列表中SEQ ID NO.1碱基序列；在此基础上用所克隆的启动子与携带加强型绿色荧光蛋白(EGFP)的质粒结合，构建了栉孔扇贝自源启动子的EGFP基因表达载体。本发明获得栉孔扇贝热休克蛋白基因启动子，其采用含目的基因的BAC克隆全测序及启动子预测方法，比传统的染色体步移方法更简单快捷。
文档编号C12N15/113GK102757963SQ201110334969
公开日2012年10月31日 申请日期2011年10月23日 优先权日2011年10月23日
发明者张晓军, 李富花, 相建海, 赵翠, 郇聘 申请人:中国科学院海洋研究所