专利名称：谷氨酰胺转运蛋白1融合蛋白表达载体及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域，为融合蛋白载体构建和表达检测技术，公开了ー种谷氨酰胺转运蛋白I (SNATl)、HA标签蛋白和加强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合蛋白表达载体及其构建方法和应用。
背景技术：
融合蛋白载体构建技术是常用的重要的分子生物学方法之一。主要是通过基因エ 程的方法使两种或两种以上不同蛋白基因融合构建于同一表达载体上，在特定活细胞内进行表达，获得新的融合蛋白的过程。HA标签蛋白只有9个氨基酸，一般不会对目的蛋白的结构和功能造成影响，而且HA抗体的特异性強，灵敏度高，是ー种常用标签。加强型绿色荧光蛋白(EGFP)常做为ー种自发荧光的融合蛋白标签与目的蛋白融合表达，用于目的蛋白在活细胞内的定位，运动等研究。在人类基因组中，SLC(The solute carrier)是继G-蛋白偶联受体之后的第二大膜蛋白群体。SLC包含46个家族，共384个成员，他们可以转运无机离子，氨基酸，神经递质，糖类，嘌呤，脂肪酸和其他底物(Bryan Mackenzie, 2004)。现已确定有10个转运氨基酸的SLC家族，共包括85种蛋白质。从系统发生角度分类，将这10个家族分为a，0，Y，§四类。其中SLC32，SLC36和SLC38都属于P类。SLC38家族共有6个成员SNAT1_6.SNATl主要在大脑，视网膜，胎盘和心脏中表达，在肺，骨骼肌，脾和肠中也有微量表达。研究发现大鼠的脑和脊髓中SNATl的浓度比较高，SNATl在不同程度上转运所有的两性的脂肪族氨基酸，尤其喜爱谷氨酰胺Gln，丙氨酸Ala，天冬酰胺Asn，半胱氨酸Cys，组氨酸 His 和丝氨酸 Ser (Varoqui H，2000 ；Gu S，2001 ;Chaudhry FA, 2002) 在结构方面，分析推测SNATl含有11个疏水的跨膜结构域。N端位于细胞膜内表面，C端位于细胞膜外表面。并且这一模型还假设跨膜区域(TMD) V和TMDVI之间的糖基化位点也位于细胞膜外表面(Bryan Mackenzie，2004)。以SNAT2为研究对象时的得到了类似的结论，并且还推断TMDVI和VII之间的LOOP环，TMDX和XI之间的LOOP环存在于细胞膜内表面。但是还不清楚哪些氨基酸对SNATl的结构影响比较大，底物与SNATl的哪些区域
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彡ロロ寸。在转运机制方面，SNATl是顺着Na+的浓度梯度每转运一个氨基酸协同转运ー个Na+，SNATl与Na+的结合是电压依赖性的，H+的存在会降低SNATl与Na+的结合能力(当pH由7. 4变为6. 0时，SNATl与Na+的表观亲和常数K111从3. 5mM上升到32mM) (Mackenzie B，2003)。在脑中SNAT的作用尤其重要，主要介导了从星形胶质细胞到神经细胞中Gln-Glu循环。谷氨酸是SLC38家族最重要的底物(可能不包括SNAT4)，毋庸置疑，SLC38在谷氨酸循环中起到关键作用。
病理学与治疗学方面在胎盘中，缺氧会降低SNATl和SNAT2mRNA的表达，也会降低系统A的活性。系统A活性的降低会导致胎儿生长受限(Mahendran D，1993)。系统A被认为是癌基因作用的靶点，因为瘤形成时氨基酸会异常积累。SNATl对肝脏来说并不是内生的，但却在人肝癌H印G2细胞系中被检测到。由于SNATl和SNAT4的表达是部位局限性的，所以可以作为药物治疗靶点。由于SNATl具有重要的生理功能，人们尝试系统地研究起结构与功能。但是由于SNATl有效抗体制备及其困难，阻碍了对SNATl结构与功能的研究进程。SNATl在细胞中表达量很低，这限制 了 SNATl蛋白的研究。为了解决这个问题，在研究中需要向宿主细胞中转入外源的SNATl基因，以增加SNATl蛋白的表达量。要确认SNATl是否在宿主细胞内表达及检验表达量，一般需要用SNATl抗体来测试。目前检测膜蛋白的有效抗体制备比较困难，现在越来越多的科学家将膜蛋白与一些标签蛋白或荧光蛋白如绿色荧光蛋白GFP等构建在一起作为融合蛋白共同表达，取得了很好的效果。2000年，Christine Saunders等在人多巴胺转运蛋白(hDAT)的N末端加上FLAG标签，用以检测多巴胺转运蛋白的表达；2005年，Zhan-Yun Guo等在人胆固醇酰基转移酶I (ACATl)的C末端加上HA标签，通过抗HA抗体来检测HA，间接地定性和定量人胆固醇酰基转移酶I的表达。Madlen Dom等在人质子依赖的氨基酸转运蛋白I(PATl)的N末端加上HA标签,用以检测质子依赖的氣基酸转运蛋白I的表达；2010年,ZhouZhang等将大鼠谷氨酰胺转运蛋白2 (SNAT2)的N-端连接在pAcGFP上，获得了 pAcGFP_SNAT2表达载体，用以检测谷氨酰胺转运蛋白2在细胞膜上的表达及定位。人流行性感冒红细胞凝集素(HA)是感冒病毒侵染细胞时所识别的ー种表面糖蛋白。HA标签取自HA蛋白分子的98-106位氨基酸，作为表达载体中常用的氨基酸标签，它基本不受共表达蛋白生物活性的影响，该标签便于检测和纯化目的蛋白。绿色荧光蛋白(GFP)来源于维多利亚水母，是ー种能够自发荧光大小为27kDa的多肽。它能够吸收紫外光或蓝光发射出绿光。GFP不依赖于外源的基底物质或除了氧气以外的辅助因子(Prasher et al. 1992)。因此，自1992年被克隆以后，GFP在体内常常作为ー种融合分子标签被用作在活细胞内定位蛋白质，追踪它们的运动及这些蛋白质定位于亚细胞器的动力学(Chalfie et al. 1994 ;Prasher. 1995)。因为野生型GFP在不同细胞内表达的效率较低，发色团突变后的加强型绿色荧光蛋白(EGFP)増加了荧光强度，并且优化的密码子适用于在酵母菌，植物，绿色水藻和哺乳动物体内表达(Chiu et al. 1996 ；Haas etal. 1996 ；Yang et al. 1996 ；Cormack et al. 1997 ；Fuhrmann et al. 1999)。EGFP 基因的第65个氨基酸发生了 Ser-Thr的替代突变(S65T)，可以激发出最大值为488nm的激发光并并且发射出最大值为507nm的发射光(Cormack et al. 1996)。另外，EGFP基因中190个沉默碱基的突变有利于哺乳动物系统中人类优化密码子的高表达水平(Yang et al. 1996)由于膜蛋白的有效抗体制备十分困难，目前针对SNATl的抗体十分昂贵，并且效果并不理想。HA单克隆抗体和GFP单克隆抗体已经商业化，价格便宜效果可靠，同时利用EGFP在细胞膜上能够发光的特点，发明ー种同时利用HA和EGFP作为融合分子标签来追踪SNATl在细胞膜上的表达与定位的有效方法是十分重要的
发明内容
本发明的目的在于提供ー种谷氨酰胺转运蛋白I融合蛋白表达载体，具体是谷氨酰胺转运蛋白I-HA标签蛋白-加强型绿色荧光蛋白融合蛋白表达载体(pBK-CMV A -SNATI-HA-EGFP 重组体)。本发明还提供上述载体的制备方法和应用。本发明的目的是这样实现的谷氨酰胺转运蛋白I融合蛋白表达载体，具体说是ー种谷氨酰胺转运蛋白I-HA标签蛋白-加强型绿色荧光蛋白融合蛋白表达载体，将谷氨酰胺转运蛋白I(SNATl)基因片段与HA标签蛋白基因片段和加强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因片段依次连接；连接次序为，谷氨酰胺转运蛋白I的C端与HA标签蛋白N-端直接相连，HA标签蛋白的C-端与加强型绿色荧光蛋白(EGFP)的N-端连接在一起，构建在真核表达载体pBK-CMVA ( A [1098-1300]，简写为pBK-CMV)上，在人胚胎肾细胞(HEK293T/17，ATCC number CRL 11268)中瞬时表达，通 过激光共聚焦显微镜和利用HA抗体或GFP抗体通过蛋白免疫印记技术(Western blot)检测SNATl在细胞膜，尤其是哺乳动物细胞(如HEK293T细胞)上的表达与定位及定量。其中HA标签蛋白既是连接SNATl与EGFP的短肽，又可作为检测的ー个方法。构建方法包括如下步骤(I)PCR扩增并纯化回收含有加强型绿色荧光蛋白融合蛋白(EGFP)的基因片段，并将该基因片段用NotI酶酶切；用NotI酶酶切含有谷氨酰胺转运蛋白I (SNATl)和HA标签蛋白的基因片段的真核表达载体质粒pBK-CMV A-SNATl-HA ;并回收载体大片段；(2)用T4DNA连接酶将酶切纯化的EGFP基因片段和pBK_CMV A -SNATl-HA载体大片段在15 18°C下恒温保持4 8小时进行连接；(3)用连接产物转化感受态细胞，卡那霉素筛选，挑取重组体单菌落培养并鉴定所得到的重组质粒；(4)将鉴定正确的重组质粒定点突变，把HA基因和EGFP基因之间的终止密码子突变成GGA (所编码的氨基酸为Gly)。步骤⑴中，以含有19T启动子和EGFP基因的原始真核表达pMD_19T_EGFP为模板扩增获得EGFP基因；PCR条件为94°C，预变性2min ;94°C变性30s，66. 1°C退火30s，72°C延伸60s, 33个循环；72°C延伸20min ；引物为EGFP-P1 :5，-RaatctattaGCGGCCGC atggtgagcaagggcgag-3>,EGFP-P2 :5，-ctatatagatGCGGCCGCtcacttgtacagctcgtccatg-3>,下划线部分表不NotI酶切位点序列，方框中的I个碱基与其前面的酶切位点构成3个氨基酸铰链，避免了移码突变；步骤⑷中，以鉴定正确的含有SNATl基因片段、HA标签蛋白和EGFP基因片段的真核表达载体质粒pBK-CMV ( A [1098-1300] )-SNATl-HA-EGFP为模板进行定点突变；PCR条件为95°C，Imin 预变性；95°C,50s ；60°C,50s ；68°C,7min ; 18 个循环；68°C，IOmin 延伸；引物为正向引物5，-gatgttccagattacgctGga|gcggccgcal atggtg-3，，反向引物5’-caccattgcggccgc tcCagcgtaatctggaacatc-3>,下划线部分(正向引物第19位G和反向引物第18位C)表示定点突变发生的位置,方框中(gcggccgca和tgcggccgc)为由酶切位点外加一个碱基构成的HA序列与EGFP序列之间的3个氨基酸铰链。上述方法所制备得到的融合蛋白真核表达载体，是pBK-CMVA-SNATl-HA-EGFP重组质粒，含有CMV启动子，谷氨酰胺转运蛋白I (SNATl)、HA标签蛋白和加强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合表达，谷氨酰胺转运蛋白I的序列与HA标签蛋白的序列直接相连；谷氨酰胺转运蛋白I的C端与HA标签蛋白N-端直接相连，HA标签蛋白的C-端与加强型绿色灭光蛋白(EGFP)的N-端连接在一起，HA标签蛋白与加强型绿色荧光蛋白的第一个氨基酸M之间有4个氨基酸形成的铰链,序列为GAAA,碱基序列为ggagcggccgca。上述融合蛋白真核表达载体，可转入宿主细胞，所携帯的两种蛋白标签便于检测SNATl的表达和定位。
这种谷氨酰胺转运蛋白I-HA标签蛋白-加强型绿色荧光蛋白融合蛋白表达载体，能用于将SNATl基因转入真核细胞，使其在真核细胞中大量表达，同时也是检测大鼠谷氨酰胺转运蛋白I(SNATl)在真核细胞膜上的表达、定位和定量的有效方法，使之能应用于SNATl的结构与功能的研究中。本发明首次在真核细胞表达载体pBK-CMV A-SNATl的C端同时加入了 HA标签蛋白和加强型绿色荧光蛋白(EGFP)构成融合蛋白共同表达，通过激光共聚焦电子显微镜(LSM)和利用HA抗体或GFP抗体通过蛋白免疫印记(Western blot)技术可以检测SNATI-HA-EGFP在哺乳动物细胞膜上的表达与定位，并且能够根据Western blot条带的深浅对SNATl的表达进行定量分析。本发明方法解决了检测大鼠SNATl在细胞膜上表达、定位和定量的难题，为进ー步研究SNATl中二硫键的数量和位置及系统地研究SNATl的结构与功能提供了有效手段和工具。这项技术主要是利用加强型绿色荧光蛋白(EGFP)与目的蛋白谷氨酰胺转运蛋白I (SNATI) -HA融合构建的理想模式载体pBK-CMV A -SNATI-HA的多克隆位点含有SNATI-HA的整个开放阅读框序列，载体PMD-19T-EGFP的多克隆位点含有EGFP的整个开放阅读框序列，使用聚合酶链式反应(PCR)的方法获取EGFP基因片段，并通过设计引物的方法在PCR获取EGFP基因时，在EGFP基因起始密码子前和终止密码子后分别加入Not I酶切位点的序列，并在EGFP基因起始密码子前多加了ー个碱基，使其与Not I酶切位点构成9个碱基，即3个氨基酸，避免了移码突变。此基因片段再与pBK-CMV A-SNATl-HANot I酶切所得的载体大片段连接，最终获得重组载体pBK-CMV ( A [1098-1300] )-SNATl-HA-EGFP,并在人胚胎肾细胞(HEK293T/17)中表达用以检测SNATl在哺乳动物细胞膜上的表达和定位。本发明的要点是在真核细胞表达载体pBK-CMVA中，以HA标签蛋白作为连接SNATl和EGFP之间的短肽，将SNATlC端与加强型绿色荧光蛋白(EGFP)构成融合蛋白共同表达，并通过激光共聚焦电子显微镜(LSM)和蛋白免疫印记(Western blot)技术检测SNATI-HA-EGFP的表达与定位的实施方法。本发明证明了在真核细胞表达载体pBK-CMVA-SNATl的C端加入HA标签和加强型绿色荧光蛋白(EGFP)后，可以通过激光共聚焦电子显微镜(LSM)清楚的观察到SNAT1-HA-EGFP在细胞膜的表达和定位；利用HA抗体或GFP抗体通过蛋白免疫印记(Western blot)技术可以检测到SNAT1_HA_EGFP在细胞膜上的表达并根据条带的深浅对SNATl定量。这种结果在研究SNATl的结构与功能研究中单纯用SNATl的抗体检测是很难以做到的。本发明提供了一个在真核细胞表达载体pBK-CMV A-SNATl的C端加入HA标签蛋白和加强型绿色荧光蛋白(EGFP)的重组真核表达载体pBK-CMV A-SNATI-HA-EGFP。在本发明中，真核表达载体质粒pBK-CMVA、SNATl和EGFP，它们的核苷酸序列和蛋白序列均是已知的，其基因库(NCBI GenBank)序列号分别是U37573. I、NM_138832. I和CAP60684. I。HA的核苷酸序列为TACCCATACGATGTTCCAGATTACGCT。原始载体质粒pBK-CMV ( A [1098-1300])-SNATl-HA，pMD-19 T-EGFP质粒为本实验室所有，它们的核苷酸序列也已知。本领域的技术人员可以通过该基因序列中的数据信息进行检索得到pBK-CMV A，SNATl，HA, EGFP的信息。在本发明的具体实例中，获取EGFP基因的PCR引物和定点突变的引物均合成于生物公司，本发明的具体实例中是合成于上海生エ公司。可选择地、利用已有的含有EGFP基因的质粒中提取该目的基因，并对特定的碱基进行突变，以获取目的突变类型。在本发明中，表达载体除了上面特别提到SNATl基因、HA标签蛋白基因和EGFP基因外，还包括原核细胞复制子ColEl/复制子fl(_)/复制子SV40，多克隆位点MCS，用于蓝白斑筛选的表达启动子Lac启动子和LacZ基因，用于抗生素筛选的新霉素或卡那霉素抗性基因；真核细胞表达启动子CMV启动子/17启动子、终止子SV40poly(A)，多克隆位点MCS，抗性筛选基因G418等。这些都是在原核细胞大肠杆菌DH5 a和真核细胞HEK293T细胞中常用的基因表达原件。在本发明的具体实例中，用于把含有SNAT1、HA和EGFP融合基因筛选出来和大量复制的载体原件包括用于大量复制融合基因的ColEl复制子，用于筛选的卡那霉素抗性基因；用于SNATl、HA和EGFP融合基因表达的载体原件包括CMV启动子，SV40poly(A)终止子。本发明提供的真核表达细胞，启动子，終止子和用于筛选目的融合基因的抗性基因种类不受限制，只要能够使SNATUHA和EGFP融合基因在真核细胞内表达就可以。本发明指的转化是将外源DNA分子导入到受体细胞，使之获得新的遗传特性的一种方法。转化所用的受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶(R-，M-)。将对数期生长的细菌(受体细胞)经理化方法处理后，细胞膜的通透性发生暂时性改变，成为允许外源DNA分子进入的感受态细胞。将经过转化的细胞在筛选培养基上培养，即可筛选出转化子(带有异源DNA分子的细胞)。在本发明的具体实例中，导入的外源DNA分子是连接后的含有SNATUHA和EGFP融合基因的载体质粒。使用的受体细胞是大肠杆菌DH5 a，购买于TIANGEN公司。本发明通过抗生素的选择性筛选出含有SNATI、HA和EGFP融合基因载体质粒的大肠杆菌DH5a单克隆。本发明转染理解为将带有外援基因的重组载体转入到哺乳动物细胞中进行表达的过程。这意味着包括引入所有对熟练工作人员所公知信息的方法，例如物理转染法(显微注射，电穿孔和基因枪法)和化学转染法(DEAE-葡聚糖法，磷酸钙法和人工脂质体法)。本发明的具体实例中采用的是脂质体瞬时转染法人工合成的阳离子脂质体和带负电荷的核酸结合后形成复合物，当复合物接近细胞膜时被内吞成为内体进入细胞质，随后DNA复合物被释放进入细胞核内。采用脂质体瞬时转染的方法即外源DNA不整合到宿主染色体中但存在多个拷贝数，产生高水平的表达，持续几天时间。我们在超螺旋质粒DNA转染HEK293T细胞后24-72小时内进行检测融合蛋白SNAT1-HA-EGFP的表达。在本发明的具体实施例中，脂质体试剂lipofectamine2000购买于Invitrogen公司。本发明表达理解为将起始DNA或RNA的遗传信息转移至基因产物多肽或蛋白质中，即本发明中SNAT1-HA-EGFP融合蛋白。本发明通过在真核细胞表达载体pBK-CMV A -SNATl-HA的C端加入加强型绿色荧光蛋白(EGFP)使SNATl、HA和EGFP融合表达以达到检测标签蛋白HA或EGFP均可检测到SNATl的目的。本发明所述的在人胚胎肾细胞(HEK293T细胞)中表达的重组载体质粒为pBK-CMVA -SNATI-HA-EGFP。 本发明所述的重组载体质粒pBK-CMV A-SNATI-HA-EGFP瞬时转染的HEK293T细胞，在转染24小时时于荧光显微镜下观察，内质网及细胞膜上清晰可见绿色荧光的表达。本发明所述的重组载体质粒pBK-CMV A-SNATI-HA-EGFP与原始质粒pBK-CMV A -SNATl-HA相比，可以通过荧光显微镜肉眼可见EGFP发出的绿色荧光，可见荧光定位于内质网和细胞膜上，由此直接接地显示出SNATl的表达和定位；运用蛋白免疫印记(Western blot)检测HA或EGFP均可间接地检测出SNATl。本发明所述的方法也适用于包括谷氨酰胺转运蛋白I(SNATl)在内的其他膜蛋白的EGFP融合蛋白构建与表达检測。本发明的创造性在于首次通过融合蛋白载体构建技术使HA标签蛋白和加强型绿色荧光蛋白(EGFP)同时加在了谷氨酰胺转运蛋白I(SNATl)的C端，并构建在真核表达载体 pBK-CMV( A [1098-1300])上。本发明目的生物体是SNAT1-HA-EGFP融合表达的HEK293T细胞。本发明目的基因是具有更多医药、生物能源、环境保护等特殊用途的外源基因。本发明首次在真核表达载体pBK-CMV( A [1098-1300])-SNATl的C端同时加入了HA标签蛋白和加强型绿色荧光蛋白(EGFP)，使得通过荧光显微镜肉眼可见EGFP发出的绿色荧光定位于内质网和细胞膜上，由此直接地显示出SNATl的表达和定位；运用蛋白免疫印记(Western blot)检测HA或EGFP的表达间接地检测出SNATl的表达。本发明方法是检测细胞膜蛋白表达与定位的成功范例；是研究膜蛋白结构与功能的基础；本发明对未来的神经退行性疾病，如老年痴呆症、帕金森综合症等疾病研究，以及生物技术、医药技术的发展都具有重要意义。本发明具有如下优点I.以HA标签蛋白作为连接谷氨酰胺转运蛋白I(SNATl)和加强型绿色荧光蛋白EGFP的短肽，増加了一种检测手段。2.提供了检测谷氨酰胺转运蛋白I(SNATl)表达与定位的有效工具。3.本发明方法适用于多种膜蛋白表达与定位的研究。
图IA为pBK-CMV A-SNATl-HA的质粒图，CMV启动子启动转录，质粒带有卡那霉素抗性基因，谷氨酰胺转运蛋白I(SNATl)与HA标签蛋白融合表达，HA之后为终止密码子TGA, TGA之后为Not I酶切位点。B 为 pBK-CMV A -SNATI-HA-EGFP 重组质粒图，在质粒 pBK-CMV A -SNATl-HA 的基础上，于Not I酶切位点内加入加强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因。从而使谷氨酰胺转运蛋白I (SNATl)、HA标签蛋白和加强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合表达，在HA序列和EGFP序列之间有ー个Not I酶切位点。由于Not I酶切位点为8个碱基，所以在设计引物的时候于NotI位点之后加了一个碱基A，以防止出现移码突变。
图2为由PCR获得的加强型绿色荧光蛋白(EGFP)片段与质粒pBK-CMV A-SNATl-HA单酶切的结果图。其中的DNA分子Marker为DL10000。①是PCR获得的加强型绿色荧光蛋白(EGFP)片段，约750bp。②是质粒pBK-CMV A-SNATl-HA单酶切的结果图，约6000bp，可显示质粒的实际长度。③是未进行酶切的pBK-CMV A-SNATl-HA质粒，由于质粒呈超螺旋状，所以图示质粒长度小于其实际长度图3为定点突变之后质粒的测序结果图。与pBK-CMV A -SNAT1-HA-TGA-EGFP相比较，将HA序列之后的TGA突变成为GGA。图4为用激光共聚焦显微镜(LSM)观察转染pBK-CMV A -SNATI-HA-EGFP的HEK293T细胞。A为未进行任何质粒转染的HEK293T细胞，无荧光显示；B为转染pBK-CMV A -SNATI-HA-EGFP的HEK293T细胞，可见有绿色荧光显示。放大倍数均为40倍。图5A为用HA抗体对SNAT1-HA-EGFP融合蛋白做的免疫印记杂交(Western Blot)结果图。I 为 pBK-CMV A -SNATI-HA-EGFP 重组体膜蛋白；2 为 pBK-CMV A -SNATI-HA-EGFP 重组体总蛋白；3为对照(未进行质粒转染的HEK293T)膜蛋白；4为对照(未进行任何质粒转染的HEK293T)总蛋白；图5B为用GFP抗体对SNAT1_HA_EGFP融合蛋白做的免疫印记杂交(WesternBlot)结果图。点样顺序与上样量与A完全相同。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进ー步详细、完整地说明实施例I含有SNATl-HA基因原始真核表达载体质粒和含有EGFP基因载体质粒的大量获取含有大鼠谷氨酰胺转运蛋白I和HA标签蛋白融合基因(SNATl-HA)原始真核表达载体质粒为pBK-CMV( A [1098-1300])-SNAT1-HA，含有加强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因载体质粒为 PMD-19T-EGFP。分另Ij向100 ill DH5 a感受态细胞(TIANGEN公司)中カロ入IngpBK-CMV( A [1098-1300])-SNATl-HA或pMD_19T_EGFP质粒，轻轻旋转离心管以混匀内容物，在冰浴中静置30min。将离心管至于42度冰浴中放置60_90s，然后快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却2-3分钟。向每个离心管中加入900 ill无菌的LB培养基(不含抗生素)，混匀后至于37度摇床振荡培养45min (150转/分钟)，混匀内容物，轻轻涂板含有卡那霉素(30mg/ml)的固体LB琼脂平板，倒置平板，37度恒温培养箱培养12-16小吋。挑取单克隆菌落，在含有卡那霉素的LB液体培养基中37°C摇菌12-16小时至浑浊。送于上海杰李测序公司测序。
测序鉴定正确后，參照分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克D. W拉塞尔著)SDS碱裂解法大量制备质粒DNA的方法制备pBK-CMV A -SNATI-HA, pMD_19T_EGFP，用于下ー步SNATl-HA基因和EGFP基因的扩增和载体大片段的获取。将3ml ロ81 1^ム-5嫩1'1-通或ロ]\ -191'46 菌液以1 : 50体积的比例接种到含卡那霉素的150ml液体培养基中，37度振荡培养过夜至对数生长晚期。将菌液倒入合适的离心管中，4000rpm离心5分钟，弃上清，并在吸水纸上倒置离心管使上清全部流尽。将细菌沉淀重悬于IOml溶液I(50mM葡萄糖，25mM Tris-Cl，PH8. 0，IOmM EDTA,PH8. 0)中，涡旋；加2mL新配置的溶菌酶(10mg/ml)，使终浓度为2mg/ml ;加15ml的溶液11(0. 2MNaOH, I % SDS)，颠倒几下；加12ml用冰遇冷的溶液III (3Mこ酸钾，5M冰こ酸)，轻微振荡混勻，4度12000g离心15min ;弃沉淀,转移上清,加入0. 6倍体积的异丙醇,颠倒混匀，室温静置5min，25度12000g离心15min，弃上清，沉淀溶解于5mlTE中，加入50ul的RNnase,颠倒混匀，37度静置IOmin ;加入1/2体积的Tris饱和酚，1/2体积的氯仿-异戊
醇(24 I)混合液，Vortex剧烈震荡混匀，4度离心，12000g离心30秒，将上层转移到另ー离心管中，加入等体积的氯仿，再12000g离心5min，小心吸取上层液体；加入等体积的13%PEG8000-1. 6mol/lNacl混合液，颠倒混匀，冰上静置0. 5-2小时；4度12000g离心15min,弃上清，DNA沉淀用70%こ醇洗涤，4度离心10分钟，空气中晾10-15min，将沉淀或液体溶解于适量无菌去离子水中，用于含SNATl-HA基因的载体大片段获取和EGFP基因的扩增。实施例2EGFP基因的扩增以实施例I获取的质粒pMD-19T-EGFP为模板，进行聚合酶链式反应，扩增EGFP基因；反应条件94°C，2min，一个循环；94°C，变性30s，66. 1°C退火30s，72 °C延伸60s，共33个循环；72°C延伸20min。反应产物纯化回收，用于测序鉴定和下ー步融合蛋白SNATI-HA-EGFP载体的构建；用于PCR扩增EGFP基因的特异性引物为EGFP-Pl :5，-gaatctattaGCGGCCGCaatggtgagcaagggcgag-3 ,EGFP-P2 :5，-ctatatagatGCGGCCGCtcacttgtacagctcgtccatg-3 下划线部分表示NotI酶切位点序列；实施例3pBK_CMV A -SNATI-HA-EGFP 重组体的构建(I)取实施例I中获取的5. O ii g pBK-CMV A -SNATl-HA载体质粒，进行Not I单酶切反应，37°C温育3小吋，回收载体大片段；取实施例2中获取的4. O ii g PCR扩增产物进行Not I单酶切反应，37°C温育10小时，回收EGFP基因片段；(2)用T4DNA连接酶连接载体大片段和EGFP小片段将酶切纯化好的pBK-CMV A -SNATl-HA载体大片段和EGFP小片段与按照摩尔比为
4 I进行连接，连接条件为16°C 5个小时。pBK-CMV A -SNATl-HA载体大片段和EGFP小片段通过NotI酶切位点相连接。所得到的载体pBK-CMV A -SNATI-HA-EGFP重组质粒如图IB所示，CMV启动子启动转录，谷氨酰胺转运蛋白I (SNATl)、HA标签蛋白和加强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合表达，在HA的最后ー个氨基酸(A)和EGFP的第一个氨基酸(M)之间有由酶切位点NotI和碱基A构成的4个氨基酸铰链。
(3)将连接产物转化入DH5 a感受态细胞将10 ill连接产物转化入100 U I DH5 a感受态细胞，冰浴30min，42°C热激90s，冰浴2-3min，再加入已预热的LB培养基890iU，放入37°C摇床150转，45min。将离心管内已经转化好的感受态液体涂布具有卡那霉素(30mg/ml)抗性的LB平板后置于37°C恒温培养箱中培养12-16小时,长出菌落即可。实施例4pBK_CMV A -SNATI-HA-EGFP 重组体的鉴定挑取转化平板上的大肠杆菌单克隆菌斑，加入卡那霉素(30mg/ml)抗性的LB培养基中37°C摇菌12-16小时。A.菌液PCR进行初步鉴定
10 U I反应体系中重组体菌液I yl，TaqMix 5u I, EGFP-P2和另一与SNATl配对 的上游引物各0. 4 ill，H2O 3. 2 ill扩增一段包含EGFP的基因。扩增产物在I %琼脂糖凝胶(0. 5 u g/ml溴化こ啶)中电泳检测。B. DNA测序鉴定将初步鉴定正确的菌液送至测序公司测序。实施例5pBK_CMV A -SNAT2-EGFP重组体表达的鉴定I、用激光共聚焦显微镜检测pBK-CMV A -SNAT2-EGFP重组体的表达取鉴定为阳性的pBK-CMV A-SNAT2-EGFP质粒以脂质体转染的方法瞬时转染人胚胎肾细胞(HEK293T/17)。转染前12小时常规培养HEK293T细胞(DMEM+10% FBS, 37 °C,5% C02)。转染时细胞密度以80% -90%为宜，质粒DNA与脂质体Lipo2000的比例为lug 3iU，转染24小时后，利用激光共聚焦显微镜(LSM)于400倍油镜下观察荧光并拍照。如图4的A和B，在细胞内质网中和细胞膜上清楚可见绿色荧光，即SNAT2-EGFP的表达；转染pBK-CMV A -SNAT2的HEK293T细胞，无荧光显示。2、用蛋白免疫印记方法(Western blot)检测pBK_CMV A -SNAT2-EGFP重组体的表达參照LubaAleksandrov 等(JBC，2001，276 (16) :12918-12923)的方法提取HEK293T细胞的总蛋白和膜蛋白并进行Western blot检测。(a)细胞总蛋白与膜蛋白的制备收集用pBK-CMV A-SNAT2-EGFP 质粒 DNA 转染 36 小时的 HEK293T 细胞，pBK-CMV A-SNAT2 转染的 HEK293T 细胞作为对照；用 PBS(0. ImM CaCl2, ImM MgCl2)室温润洗2-3次；加入Iml含蛋白质抑制剂(Rocheg公司)的PBS (BestBio公司)，用细胞刮(Corning公司)将细胞刮下移入I. 5ml EP管中；放入-20°C冰箱30min，拿出放入37度水浴至融化，涡旋几下，如此反复冻融3次；再在4°C下IOOOg离心15分钟，取上清，再离心10分钟，取上清，即为总蛋白。总蛋白4度35000rpm离心30min,弃上清,用重悬液(40mM TrisCl,pH7. 6,5mM MgCl2,0. 4mMEGTA)重悬沉淀即为膜蛋白。使用 Pierce BCA ProteinAssay Kit (Thermo,USA)分别测定总蛋白和膜蛋白的浓度，操作步骤按产品说明书。(b) SDS-PAGE 电泳和 Western 印记分别取10 ii g的总蛋白和膜蛋白液加上SDS-PAGE上样缓冲液(北京康为世纪生物科技有限公司)于10 %的分离胶和5 %的浓缩胶进行SDS-PAGE凝胶电泳，转PVDF膜(MiIlipore, USA)，电压IOV转移过夜。将转移好的PVDF膜放入含5%牛奶的TBST溶液(0. OlM Tris *HCl,pH7. 5,0. 15M NaCl,0. 05% Tween20)中封闭 60min，接着用兔源抗 GFP标签多克隆抗体(上海中科蛋白抗体制备公司)以I : 6500的比例与膜孵育60min，用TBST润洗3次；再用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG (H+L)抗体以I : 5500的比例与膜孵育60min，用TBST润洗3次；最后HRP (MiIlipore，USA)作用lmin，曝光显影定影，结果见图5。结果表明，在泳道3和4，分别是pBK-CMV A -SNAT2-EGFP质粒DNA转染的HEK293T细胞所提取的总蛋白和膜蛋白样品，分子量80KD左右处杂交出了一条带，与融合蛋白SNAT2-EGFP的分子量81KD相符。因此，通过Westernblot杂交EGFP，可以间接的对SNAT2进行定量。对于蛋白质的定量和SDS-PAGE凝胶电泳以及western blot实验中的转膜、封闭、杂交、洗膜、显影等操作技术均为本领域熟练技术人员所公知的标准方法(Sambix)Ok等，Molecular Cloning. New York Cola Spring Harbor LaboratoryPress. 1998)或按照I式剂盒制造商说明书(Bio-Rad Bradford kit 和 GE Healthcare)操作。
上述实施例仅为本发明的优选例，并不用来限制本发明，凡在本发明的原则之内，所做的任何修改和变化，均在本发明的保护范围之内。实施例6定点突变原始质粒pBK-CMV A -SNATl-HA在HA标签蛋白的后面有一个终止密码子TGA，所以新加入的EGFP是不表达的。用点突变的方法将TGA突变成GGA(Gly)。在200 ill 的 EP 管中カ卩入 42 u lddH20, IOXbuffer 5 U I,模板pBK-CMV A -SNATI-HA-TGA-EGFP 150ng, dNTP (400mM) I yl，正反向引物(150ng/u I)各Iu I,Pfu turbo DNA聚合酶(2. 5U/yl) I yl，构成50 体系，于PCR仪中进行如下循环95°C Imin 预变性，95°C变性 50s，60°C退火 50s，68°C延伸 8min，循环 18 次，68°C IOmin 终延伸。定点突变的引物如下正向引物5，-GATGTTCCAGATTACGCT§ GAGCGGCCGCAATGGTG-3 ’反向引物5’ -CACCATTGCGGCCGCTC g AGCGTAATCTGGAACATC-3’;其中方框内碱基为点突变发
生的位置。PCR结束以后向体系中加入Dpn I(10U/yl) I yl，37°C孵育lh，以去除模板保留PCR产物。将经过Dpn I消化后的产物取10 U I按照实施例3中转化的方法转化DH 5 a，获
得阳性克隆，并测序验证。实施例7pBK-CMV A -SNATI-HA-EGFP重组体表达的鉴定I、用激光共聚焦显微镜检测pBK-CMV A -SNATI-HA-EGFP重组体的表达取鉴定为阳性的pBK-CMV A-SNATI-HA-EGFP质粒以脂质体转染的方法瞬时转染人胚胎肾细胞(HEK293T/17)。转染前12小时常规培养HEK293T细胞(DMEM+10% FBS,37°C,5% C02)。转染时细胞密度以80% -90%为宜，质粒DNA与脂质体Lipo2000的比例为lug 3iU，转染24小时后，利用激光共聚焦显微镜(LSM)于400倍油镜下观察荧光并拍照。如图四，在细胞膜上清楚可见绿色荧光，即SNAT1-HA-EGFP的表达，未进行任何质粒转染的HEK293T细胞，无荧光显示。2、用蛋白免疫印记方法(Western blot)检测 pBK_CMV A-SNATI-HA-EGFP 重组体的表达參照Luba Aleksandrov 等(JBC，2001，276 (16) :12918-12923)的方法提取HEK293T细胞的总蛋白和膜蛋白并进行Western blot检测。
(a)细胞总蛋白与膜蛋白的制备收集用pBK-CMV A -SNATI-HA-EGFP质粒DNA转染36小时的HEK293T细胞，未进行任何质粒转染的J1EK293T细胞作为对照；用PBS(0. ImM CaCl2, ImM MgCl2)室温润洗2-3次；加入Iml含蛋白质抑制剂(Roche公司)的PBS(BestBio公司)，用细胞刮(Corning公司)将细胞刮下移入I. 5ml EP管中；放入-20°C冰箱30min，拿出放入37°C水浴至融化，涡旋几下，如此反复冻融3次；再4°C IOOOg离心15min,取上清,再离心IOmin,取上清，即为总蛋白。总蛋白 4°C 70000g 离心 30min，弃上清，用重悬液(40mM Tris *HCl,pH7. 6, 5mM MgCl2,
0.4mMEGTA)重悬沉淀即为膜蛋白。使用 Pierce BCA Protein AssayKit (Thermo, USA)分别测定总蛋白和膜蛋白的浓度，操作步骤按产品说明书。(b) SDS-PAGE 电泳和 Western 印记分别取6 ii g总蛋白和2 u g膜蛋白加上SDS-PAGE上样缓冲液(北京康为世纪生物科技有限公司)于10 %的分离胶和5 %的浓缩胶进行SDS-PAGE凝胶电泳，转PVDF膜(Mi I lipore, USA)，电压7V转移过夜。将转移好的PVDF膜放入含5 %牛奶的TBST溶液(0. OlM Tris HCl, pH7. 5,0. 15M NaCl, 0. 05% Tween20)中封闭 60min，接着用兔源抗 GFP标签多克隆抗体(或鼠源HA单克隆抗体)(上海中科蛋白抗体制备公司)以I : 6500的比例与膜孵育60min，用TBST润洗3次；再用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG (H+L)抗体以I 5500的比例与膜孵育60min,用TBST润洗3次；最后HRP (Mi I lipore，USA)作用lmin,曝光显影定影，结果见图5A。结果表明，在泳道I和2，分别是pBK-CMV A-SNATI-HA-EGFP质粒DNA转染的HEK293T细胞所提取的膜蛋白和总蛋白样品，分子量80KD左右处杂交出了一条带，与融合蛋白SNAT1-HA-EGFP的分子量80. 5KD相符。因此，通过Western blot杂交EGFP，可以间接的对SNATl进行定量。同理，用鼠源HA单克隆抗体(中科I : 3500稀释度)和兔抗鼠IgG(H+L)多克隆抗体(sigma，I 60000稀释度)重复图五A的相同实验，得到结果如图五B所示，结果完全一致。结果表明，本发明给目的蛋白SNATl加上了两个标签HA和EGFP，具有双重功能。为western blot方法检测提供了两种选择。对于蛋白质的定量和SDS-PAGE凝胶电泳以及western blot实验中的转膜、封闭、杂交、洗膜、显影等操作技术均为本领域熟练技术人员所公知的标准方法(Sambix)Ok等，Molecii Iar Cloning. New York : Co Id Spring Harbor LaboratoryPress. 1998)
剂盒制造商说明书(Bio-Rad Bradford kit和GE Healthcare)操作。上述实施例仅为本发明的优选例，并不用来限制本发明，凡在本发明的原则之内，所做的任何修改和变化，均在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.谷氨酰胺转运蛋白I融合蛋白表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤 (1)PCR扩增并纯化回收含有加强型绿色荧光蛋白基因的基因片段，并将该基因片段用NotI酶酶切； 用NotI酶酶切含有谷氨酰胺转运蛋白I基因和HA标签蛋白基因的真核表达载体质粒pBK-CMV A -SNATl-HA ;并回收载体大片段； (2)用T4DNA连接酶将酶切纯化的加强型绿色荧光蛋白基因片段和pBK-CMV A -SNATl-HA载体大片段在15 18°C下恒温保持4 8小时进行连接； (3)用连接产物转化感受态细胞，卡那霉素筛选，挑取重组体单菌落培养并鉴定所得到的重组质粒； (4)将鉴定正确的重组质粒定点突变，把HA标签蛋白基因和加强型绿色荧光蛋白基因之间的终止密码子突变成gga。
2.权利要求I所述谷氨酰胺转运蛋白I融合蛋白表达载体的构建方法，其特征在于，步骤(4)中所述定点突变是以经鉴定正确的含有谷氨酰胺转运蛋白I基因片段、HA标签蛋白基因片段和加强型绿色荧光蛋白基因片段的真核表达载体质粒pBK-CMV( A [1098-1300])-SNAT1-HA-EGFP为模板进行定点突变； Ib向引物序列为5’ -gatgttccagattacgctggagcggccgcaatggtg-3’， 汉丨ロJ弓I物序列为57 -caccattgcggccgctccagcgtaatctggaacatc-37, PCR条件为95°C，Imin预变性；95°C变性50s ;60°C退火50s，68°C延伸7min，18个循环；68°C，IOmin 延伸；
3.权利要求I所述谷氨酰胺转运蛋白I融合蛋白表达载体的构建方法，其特征在于，步骤(I)中，以含有19T启动子和加强型绿色荧光蛋白基因的原始真核表达载体PMD-19T-EGFP为模板扩增获得EGFP基因； 引物序列为EGFP-Pl 5 -gaatctattagcggccgcaatggtgagcaagggcgag-3，；EGFP-P2 5 -ctatatagatgcggccgctcacttgtacagctcgtccatg-3> ； PCR条件为94°C，预变性2min，一个循环；94°C变性30s，66. I °C退火30s，72°C延伸60s，共33个循环；72°C延伸20min。
4.谷氨酰胺转运蛋白I融合蛋白表达载体，其特征在于，通过权利要求I 3任ー项所述方法制备，含有CMV启动子，谷氨酰胺转运蛋白I、HA标签蛋白和加强型绿色荧光蛋白融合表达；连接次序为，谷氣酸胺转运蛋白I的C端与HA标签蛋白N-端直接相连，HA标签蛋白的C-端与加强型绿色灭光蛋白的N-端连接在一起；HA标签蛋白最后个氣基fe A与加强型绿色荧光蛋白的第一个氨基酸M之间有4个氨基酸形成的铰链，序列为GAAA，碱基序列为 ggagcggccgca。
5.权利要求4所述谷氨酰胺转运蛋白I融合蛋白表达载体用于检测谷氨酰胺转运蛋白I的表达和定位。
全文摘要
本发明涉及生物工程领域，为融合蛋白载体构建和表达检测技术，公开了一种谷氨酰胺转运蛋白1融合蛋白表达载体，将谷氨酰胺转运蛋白1基因片段与HA标签蛋白基因片段和加强型绿色荧光蛋白基因片段依次连接，构建在真核表达载体pBK-CMVΔ上；谷氨酰胺转运蛋白1的C端与HA标签蛋白N-端直接相连，HA标签蛋白的C-端与加强型绿色荧光蛋白的N-端连接在一起，HA标签蛋白与加强型绿色荧光蛋白的第一个氨基酸M之间有4个氨基酸形成的铰链，序列为GAAA，碱基序列为ggagcggccgca。所得到的载体能用于将SNAT1基因转入真核细胞，使其在真核细胞中大量表达，同时也是检测大鼠谷氨酰胺转运蛋白1(SNAT1)在真核细胞膜上的表达、定位和定量的有效方法，使之能应用于SNAT1的结构与功能的研究中。
文档编号C12N15/66GK102653771SQ20111033595
公开日2012年9月5日 申请日期2011年10月29日 优先权日2011年10月29日
发明者孟雯, 张舟, 李洋, 王函, 董晓云 申请人:上海师范大学