专利名称：一种土壤稀有放线菌发酵液的制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种土壤稀有放线菌发酵液的制备方法，以及该发酵液在制备抗真菌农药过程中的应用。
背景技术：
植物病原真菌是危害农作物的主要病原微生物类群，生产造成了巨大损失，利用化学防治导致的农药残留与污染环境等问题受到人们的广泛重视。农药对农业的发展起着非常重要的作用，但随着社会的发展，伴随化学农药引起的安全及环境问题也日益凸现，近年来，植物内生菌作为一种新的生物资源引起了广泛的关注，从内生菌中寻找和发现了一些新的活性化合物，所以从稀有放线菌的代谢产物中分离抑菌活性物质是一个可行的途径。农用抗生素是由微生物发酵过程中产生的次生代谢产物，是在低浓度时可抑制或杀灭作物的病、虫、草害及调节作物生长发育的一类微生物农药。创制新型微生物源农药防治植物病虫害具有很大的市场前景和应用价值，因而筛选具有高杀菌活性的放线菌资源对开发新型农药具有重大实践意义。迄今为止，世界上已发现的抗生素大约有三分之二是由放线菌产生的，其中以链霉菌产生的抗生素种类最多。然而随着发现抗生素越来越多，从链霉菌中发现新的抗生素的几率越来越小，人们开始从稀有放线菌中寻找新抗生素。稀有放线菌作为新抗生素来源的作用变得越来越重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有潜在生物农药价值的土壤稀有放线菌发酵液，以及其制备方法，并且提供此土壤稀有放线菌发酵液对真菌有较好的防治效果。本发明所用的微生物菌株是广东省土样分离得到土壤微生物，结合形态和生理生化特征，初步鉴定为放线菌科诺卡氏菌属的诺卡氏菌2-200。本发明的目的通过下述技术方案实现:一种土壤稀有放线菌发酵液的制备方法，包括以下步骤:(I) 土壤稀有放线菌的种子培养用无菌接种环将菌株的孢子接种于高氏I号培养基斜面上，“Z”字法，在28°C下培养5 8天；(2) 土壤稀有放线菌的液体发酵培养用无菌接种环挑取3 5环接种于装有IOOmL发酵培养基的250mL三角瓶中，25 300C，250 300r/min条件下振荡培养3 6天，取出将其用滤纸滤出上清液，得到发酵液；(3)发酵液的纯化将发酵液移入50mL体积的离心管中，3000 5000r/min的离心机离心10 15min，保留滤液，即为土壤稀有放线菌发酵液。所述高氏I号培养基为可溶性淀粉 20g，KNO3 lg, K2HPO4 0.5g，MgSO4.7H20 0.5g，NaCl 0.05g FeSO4.7H20 0.0lg,琼脂 20g, pH = 7.4 7.6。所述的液体发酵培养基为葡萄糖5.0 20g，蛋白胨1.5 5.0g，NaCl 0.5
5.0g,小米 5.0 20g, CaCO3 2.0 4.0g,水 IOOOmL0一种土壤稀有放线菌发酵液就是通过上述的制备方法制备而成的。上述土壤稀有放线菌发酵液在制备抗真菌农药过程中的应用。本发明的发酵液能够对小麦赤霉病(Fusarium graminearum)、苹果腐烂病(Valsa mali Miyabe et Yamada)、番爺早疫病(Ahernaria solani)、梨灰霉病(Botrytiscinerea)、棉花枯萎病(Fusarium oxysporum f.sp.Vasinfectum)具有较好的抑制效果。本发明的发酵液可用于制备真菌病的农药。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果:本发明发酵工艺和纯化工艺简单。本发明发酵液对小麦赤霉病、苹果腐烂病、番茄早疫病、梨灰霉病、棉花枯萎病这五种供试病原菌具有较好的抑制作用，可望制成生物农药，具有较高的经济和社会效益。具体实施方法实施例1
本发明发酵液的制备方法:(I) 土壤稀有放线菌的种子培养用无菌接种环将菌株的孢子接种于高氏I号培养基斜面上，“Z”字法，在28°C下培养6天；(2) 土壤稀有放线菌的液体发酵培养用无菌接种环挑取3环接种于装有IOOmL发酵培养基的250mL三角瓶中，25°C，300r/min条件下振荡培养4天，取出将其用滤纸滤出上清液，得到发酵液；(3)发酵液的纯化将发酵液移入50mL体积的离心管中，5000r/min的离心机离心lOmin，保留滤液，即为土壤稀有放线菌发酵液。实施例2本发明发酵液抑制小麦赤霉病、苹果腐烂病、番茄早疫病、梨灰霉病、棉花枯萎病实验将实施例1得到的发酵液作为生测样品，以小麦赤霉病、苹果腐烂病、番茄早疫病、灰霉病、棉花枯萎病为供试菌。将发酵液与PDA培养基以1: 9的比例混合制成平板在中央分别接入供试菌的菌饼直径为5mm，并且以无菌水处理作为对照，培养3d，采用十字交叉法测定抑菌圈直径，每个处理重复3次。PDA培养基成分为马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15-20g，水1000ml。实验结果见表I。表I放线菌对五种真菌的抑制率)平均数表格
权利要求
1.一种土壤稀有放线菌发酵液的制备方法，其特征是包括以下步骤: (1)土壤稀有放线菌的种子培养 用无菌接种环将菌株的孢子接种于高氏I号培养基斜面上，“Z”字法，在28°C下培养5 8天: (2)土壤稀有放线菌的液体发酵培养 用无菌接种环挑取3 5环接种于装有100mL发酵培养基的250mL三角瓶中，25 300C，250 300r/min条件下振荡培养3 6天，取出将其用滤纸滤出上清液，得到发酵液； (3)发酵液的纯化 将发酵液移入50mL体积的离心管中，3000 5000r/min的离心机离心10 15min,保留滤液，即为土壤稀有放线菌发酵液。
2.根据权利要求1所述的一种土壤稀有放线菌发酵液的制备方法，其特征是:所述菌株为土壤稀有放线菌是放线菌科诺卡氏菌属的诺卡氏菌2-200。
3.根据权利要求1所述的一种土壤稀有放线菌发酵液的制备方法，其特征是:所述的发酵培养基为葡萄糖5.0 20.0g,蛋白胨1.5 5.0g,NaCl 0.5 5.0g,小米5.0 20g,CaCO3 2.0 4.0g,水 1000mL。
4.一种土壤稀有放线菌发酵液就是通过权利要求1所述的制备方法制备而成的。
5.权利要求4所述的土壤稀有放线菌发酵液在防治真菌病有较好的效果，能制备抗真菌的农药。
全文摘要
本发明涉及一种土壤稀有放线菌发酵液的制备方法，以及该发酵液在制备抗真菌农药过程中的应用。经土壤稀有放线菌的种子培养，土壤稀有放线菌的液体发酵培养，发酵液的纯化得到土壤稀有放线菌发酵液。本发明发酵工艺和纯化工艺简单。本发明发酵液对小麦赤霉病、苹果腐烂病、番茄早疫病、梨灰霉病、棉花枯萎病这五种供试病原真菌具有较好的抑制作用，可制成生物农药，具有较高的经济和社会效益。
文档编号C12R1/365GK103088068SQ20111034483
公开日2013年5月8日 申请日期2011年11月4日 优先权日2011年11月4日
发明者魏立颖, 李春光, 王素君 申请人:天津绿动植物营养技术开发有限公司