专利名称：热稳定性提高的脂肪酶突变体及其构建方法
技术领域：
本发明涉及生物技术，具体涉及ー种热稳定性提高的脂肪酶突变体及其构建方、法。
背景技术：
脂肪酶(Lipase)是ー种用途十分广泛的生物催化剂，不仅可催化油脂在水相中的水解，也能在非水相中催化酯合成、转酯等反应，常被用于洗涤剂添加剤、食品、制药エ业、造纸エ业和生物能源等方面。其中，南极假丝酵母脂肪酶B是目前最为有效的生物催化剂之一，广泛用于药物的手性拆分及生物柴油的生产(Kirk 0, Anderson EM,Karin M(1998)One biocatalyst-many applications The use oi Candida antarcticab-lipase in organic synthesis. Biocatal Biotransform 16(3) : 181-204)。但是エ业生产所需的苛刻条件和酶稳定性之间的矛盾，长久以来一直在制约着脂肪酶的发展和应用。如为了保证催化效率，许多反应需要在较高温度下进行，而南极假丝酵母脂肪酶B属于中温脂肪酶，它的热稳定性差不仅限制了其应用范围，而且使酶易于失活，増加了生产成本。因此，获得一株热稳定性提高的脂肪酶具有重要的エ业应用价值。半理性设计是一种结合了理性设计和定向进化两方面优势的方法，其主g在于构建小而有效的突变库。目前，半理性设计已成功用于改变酶的底物特异性、热稳定性、对映体选择性等，并取得了显著的成绩(Reetz MT, Carballeira JD, Peyralans J, HobenreichH,Maichele A,Vogel A (2006a)Expanding the substrate scope of enzymes :Comoiningmutations obtained by casting. Chemistry-a European Journal 12(23) :6031-6038.Reetz MT, D Carballeira J, Vogel A(2006b)Iterative saturation mutagenesis onthe basis of b factors as a strategy for increasing protein thermostability.Angewandte Chemie-International Edition 45(46) :7745-7751.Reetz MT, PrasadS, Carballeira JD, Gumulya Y, Bocola M(2010)Iterative saturation mutagenesisaccelerates laboratory evolution of enzyme stereoselectivity :Rigorouscomparison with traditional methods. J Am Chem Soc 132(26) :9144-9152)。我们首先利用已知的信息进行分析，找出可能的“热点”，再对这些“热点”进行饱和突变，构建突变文库；然后选择合适的载体和宿主进行表达；最后对文库进行筛选得到性质改变的突变体。再以此突变株作为模板，重复上述过程，直至变体达到所预期的要求。大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚，目的基因表达水平高，培养周期短，抗污染能力强等特点，是分子生物学研究和生物技术产业化发展进程中的重要工具。在前期工作中，发明人已成功将南极假丝酵母脂肪酶B在大肠杆菌中进行了高效表达。本发明以大肠杆菌作为宿主细胞，利用半理性设计的方法，获得了热稳定性显著提高的脂肪酶突变体。
发明内容
本发明的目的，在于提供一种热稳定性提高的脂肪酶突变体及其构建方法。本发明的脂肪酶突变体已于2011年11月17日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCCjii :中国北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所。其分类命名为大肠埃希氏菌，拉丁名Escherichia colio其中，突变体Asp223Gly的保藏编号为CGMCC No. 5390，突变体Leu278Met的保藏编号为CGMCC No. 5389，突变体Asp223Gly/Leu278Met的保藏编号为CGMCC No. 5387，野生型WT的保藏编号为CGMCCNo.5388。本发明的技术方案是一种热稳定性提高的脂肪酶突变体，由南极假丝酵母脂肪酶B基因出发，运用多轮定点饱和突变而获得；所述南极假丝酵母脂肪酶B具有SEQ ID No:I所示的氨基酸残基序列；所述脂肪酶突变体具有SEQ ID No :2、SEQ ID No :3或SEQ IDNo 4所示的氨基酸残基序列，SEQ ID No :2、SEQ IDNo :3和SEQ ID No :4均由317个氨基酸组成。上述热稳定性提高的脂肪酶突变体的构建方法，包括以下步骤A、南极假丝酵母脂肪酶B基因的克隆 对南极假丝酵母脂肪酶B基因通过上游引物和下游引物扩增目的基因；上游引物5’ -AATACCATGGCTCTACCTTCCGGTTCG-3’,带下划线碱基为限制性内切酶NcoI识别位点；下游引物5’ -TAACTCGAGGGGGGTGACGATGCCGGA-3’,带下划线碱基为限制性内切酶XhoI识别位点；以Takara的PrimeSTAR为聚合酶，在上游引物和下游引物的參与下进行PCR反应，得到PCR扩增产物；DpnI消化模板，回收，纯化该目的片段，将其用限制性内切酶NcoI和XhoI进行双酶切后与经同样酶双酶切的质粒pET22b (Novagen)进行连接，将连接产物转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中，将转化细胞涂布于含有100ug/ml氨苄的LB平板上筛选阳性克隆，得到重组质粒，将该重组质粒命名为pET22b-CALB ；B、南极假丝酵母脂肪酶B的结构分析及热点确定对南极假丝酵母脂肪酶B的晶体结构进行分析(ID :1TCA)，脂肪酶的催化三联体为自N端起第104位的丝氨酸、第187位的天冬氨酸和第224位的组氨酸，选取催化丝氨酸周围的氨基酸残基进行B因子的分析，确定下列B因子较高的残基作为饱和突变的热点自N端起第278位亮氨酸，285位缬氨酸，277位亮氨酸，281位甘氨酸，223位天冬氨酸；C、南极假丝酵母脂肪酶B突变体库的建立及突变体的筛选Cl、根据热点构建饱和突变体库并导入宿主细胞以重组质粒pET22b-CALB作为模板，针对步骤B中确定的热点，分别在与第278位亮氨酸、第285位缬氨酸、第277位亮氨酸、第281位甘氨酸和第223位天冬氨酸相对应的核苷酸处利用NNK代替原有密码子，设计简并引物，并进行全质粒PCR反应，构建5个定点饱和突变PCR扩增产物，反应结束后，DpnI消化模板，回收，纯化后的PCR产物直接电击导入大肠杆菌Rosetta(DE3)中，将转化后的大肠杆菌直接涂布于含有100ug/ml氨苄和含有2% (v/v)乳化好的三丁酸甘油脂的LB抗性平板上，在37°C下培养16-24小时，得到针对5个热点的饱和突变体库；C2、从饱和突变体库中筛选热稳定性提高的突变体将步骤Cl中37°C培养后的LB抗性平板在4°C下放置I天，进行初步筛选，将产生透明圈的菌落，接种于含有100ug/ml氨苄LB培养基的96孔板中，于37°C过夜培养，得到分属5个突变体库的母板；从培养好的母板中吸取20ul液体至新的含有100ug/ml氨苄LB培养基的96孔板中，37°C培养3h，4°C放置30min，再加入终浓度为ImM的IPTG，15°C培养24h ；利用冻融破碎的方法裂解菌体，得到粗酶液；将所得到的粗酶液在49°C下孵育15min,再于冰上放置IOmin,室温放置15min,测定姆孔的残余活力；将从5个突变体库中筛选到的阳性突变体接入5ml小试管中，至0D600为0. 6-0. 8时，加入IPTG至终浓度ImM，15°C诱导表达，超声破碎后测定粗酶液的T5tl15,确定热稳定性最高的突变体，进行测序，至此，完成了第一轮筛选，得到两个热点的优秀突变体，分别是D223G 和 L278M ；以L278M的基因作为模板，进行迭代饱和突变针对285位缬氨酸、277位亮氨酸、281位甘氨酸和223位天冬氨酸位点设计饱和突变库，并參考上述步骤进行新ー轮的筛选； 经过多轮的迭代饱和突变，获得了三株热稳定性明显提高的菌株，測定脂肪酶核苷酸序列得出三株突变体分别为Asp223Gly、Leu278Met和Asp223Gly/Leu278Met。步骤A中所述的PCR反应的反应条件为98°C 2min ;然后98°C 10sec，55°C 15sec，72°C lmin，共 25 个循环；最后 72°C IOmin0步骤C I中所述的该PCR反应使用TaKaRa公司的PrimeSTAR DNA聚合酶，PCR反应条件为98°C 2min ;然后 98°C 10sec，55°C 15sec，72°C 7min，共 25 个循环；最后 72°C IOmin0上述热稳定性提高的脂肪酶突变体的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No 5,SEQ IDNo 6 或 SEQ ID No 7 所示。上述热稳定性提高的脂肪酶突变体应用于洗涤剂、添加剤、食品、制药、造纸、或生物能源エ业生产中。与野生型南极假丝酵母脂肪酶B相比，本发明的脂肪酶突变体的热稳定性获得了提高，以各自的T5tl15及48°C的半衰期t1/2来表示热稳定性的提高，本发明的脂肪酶突变体的提闻幅度如表I所不表I
15t1/2(48°C)提
脂肪酶突变体氨基酸取代位置 T5015 (0C) t1/2(48°C)(min)
ft倍数
_野生型___46.12__3.81__I _
_ 突变体 I__Asp223Gly__48.60 __13.323.5
—突变体 2__Leu278Met__49.23 __24.15__6.3 _
__ 突变体 3 _[ Asp223Gly/Leu278Met I _ 62.50 J_49.1612.9 _本发明运用半理性设计的方法，对南极假丝酵母脂肪酶B基因进行多轮定点饱和突变，获取脂肪酶突变体，这些突变体包含氨基酸突变D223G、L278M及它们的组合。以各自的T5tl15及48°C的半衰期t1/2来表示，脂肪酶突变体的热稳定性得到了提高。具有较高的实际应用价值和广阔的市场前景。
图I为脂肪酶突变体Asp223Gly的反向测序峰图；图2为脂肪酶突变体Leu278Met的反向测序峰图；图3、图4为脂肪酶突变体Asp223Gly/Leu278Met的反向测序峰图。
具体实施例方式下述实施例中所用的方法，如无特殊说明均为常规方法，具体步骤可以參见((Molecular Cloning A Laboratory Manual))(Sambrook, J. ,Russell,Dsvid ff. ,Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3rd edition, 2001, NY, Cold Spring Harbor) 所用引物均由上海生工合成。实施例I野生型南极假丝酵母脂肪酶B基因的克隆野生型南极假丝酵母脂肪酶B基因由南京金斯瑞公司合成，通过上游引物5’_AATACCATGGCTCTACCTTCCGGTTCG-3’ (带下划线碱基为限制性内切酶NcoI识别位点)和下游引物5’-TAACTCGAGGGGGGTGACGATGCCGGA-3’ (带下划线碱基为限制性内切酶XhoI识别位点)扩增目的基因，该PCR反应使用Takara的PrimeSTAR聚合酶，PCR反应条件为98°C 2min,然后 98°C 10sec，55°C 15sec，72°C lmin，共 25 个循环；最后 72°C IOmin0 反应结束后，对 PCR扩增产物进行I %琼脂糖凝胶电泳检测，得到Ikb大小的条带，与预期结果相符。DpnI消化模板，回收，纯化该目的片段，将其用限制性内切酶NcoI和XhoI进行双酶切后与经同样酶双酶切的质粒pET22b (Novagen)进行连接,将连接产物转化大肠杆菌Rosetta (DE3)感受态细胞中，将转化细胞涂布于含有100ug/ml氨苄的LB平板上筛选阳性克隆，提取质粒，对其进行测序，测序结果表明克隆的南极假丝酵母脂肪酶B基因序列正确，且正确连入pET22b中，将该重组质粒命名为pET22b-CALB。实施例2南极假丝酵母脂肪酶B的结构分析及热点确定对南极假丝酵母脂肪酶B的晶体结构进行分析(ID :1TCA)，脂肪酶的催化三联体为自N端起第104位的丝氨酸，第187位的天冬氨酸，第224位的组氨酸。选取催化丝氨酸周围的氨基酸残基进行B因子的分析，确定一系列的B因子较高的残基(自N端起，第278位亮氨酸，285位缬氨酸，277位亮氨酸，281位甘氨酸，223位天冬氨酸)作为饱和突变的热点。实施例3饱和突变体库的建立及突变体的筛选用下述方法筛选具有较好热稳定性的南极假丝酵母脂肪酶B的变体，具体过程包括以下步骤I、根据热点构建饱和突变体库并导入宿主细胞以实施例I中克隆的重组质粒pET22b_CALB作为模板，针对实施例2中确定的热点，分别在第278位亮氨酸，285位缬氨酸，277位亮氨酸，281位甘氨酸，223位天冬氨酸相对应的核苷酸处利用NNK代替原有密码子，设计简并引物，并进行全质粒PCR构建5个定点饱和突变PCR扩增产物，该PCR反应使用TaKaRa公司的PrimeSTAR DNA聚合酶，PCR反应条件是98°C 2min ;然后 98°C IOsec, 55°C 15sec, 72°C 7min,共 25 个循环；最后 72°C IOmin0反应结束后，对于5个定点饱和突变的PCR扩增产物分别进行I %琼脂糖凝胶电泳检测，DpnI消化模板，回收，纯化后的PCR产物直接电击导入大肠杆菌Rosetta(DE3)中。将转化后的大肠杆菌直接涂布于含有100ug/ml氨苄和含有2% (v/v)乳化好的三丁酸甘油脂的LB抗性平板上，在37°C下培养16-24小时，得到针对5个热点的饱和突变体库。2、在饱和突变体库中筛选热稳定性提高的突变体将步骤I中37°C培养后的平板在4°C下放置I天，进行初歩筛选。将产生透明圈的菌落，接种于含有100ug/ml氨苄LB培养基的96孔板中，于37°C过夜培养，得到分属5个突变库的母板。从培养好的母板中吸取20ul液体至新的含有100ug/ml氨苄LB培养基的96孔板中，37°C培养3h，4°C放置30min，再加入终浓度为ImM的IPTG，15°C培养24h。
利用冻融破碎的方法裂解菌体，得到粗酶液。将所得到的粗酶液在49°C下孵育15min,再于冰上放置IOmin,室温放置15min,测定姆孔的残余活力。将5个突变库中筛选到的阳性突变体接入5ml小试管中，至0D600为0. 6-0. 8时，加入IPTG至终浓度ImM，15°C诱导表达，超声破碎后测定粗酶液的T5tl15,确定热稳定性最高的突变体，进行测序，至此，完成了第一轮筛选。第一轮筛选得到了两个热点的优秀突变体，分别是D223G和L278M，而277、281、285三个热点的突变体库并没有筛选到优秀突变体。以突变体L278M的基因作为模板，进行迭代饱和突变针对285位缬氨酸，277位亮氨酸，281位甘氨酸，223位天冬氨酸位点设计饱和突变库，并參考上述步骤进行新ー轮的筛选。3、经过多轮的迭代饱和突变，获得了三株热稳定性明显提高的菌株，測定脂肪酶核苷酸序列得出三株突变体分别为Asp223Gly、Leu278Met和双点突变Asp223Gly/Leu278Met0图I为脂肪酶突变体Asp223Gly的反向测序峰图。图2为脂肪酶突变体Leu278Met的反向测序峰图。图3、图4为脂肪酶突变体Asp223Gly/Leu278Met的反向测序峰图。实施例3南极假丝酵母脂肪酶B变体的热稳定性測定与活力測定为了測定脂肪酶变体的T5tl15活力及半衰期，需要对酶进行分离提纯。将超声破碎得到的粗酶液通过Ni2+离子亲和柱进行纯化，透析过夜即可得到纯的脂肪酶变体组分。脂肪酶活力，半衰期及T5tl15的測定方法脂肪酶活力测定的方法为pNPC 法(p-nitrophenyl caprylate) (Cai JG, XieYA, Song B, Wang YP, Zhang ZM, Feng Y(2011)Fervidobacterium changbaicum Iipl Identiiication， cloning， and characterization oi the thermophilic lipase asa new member of bacterial lipase family v.Appl Microbiol Biotechnol 89(5)1463-1473.)。酶活的定义为pH7. 5、37°C下反应每分钟产生Iumol对硝基苯酚的酶量为一个活力単位。脂肪酶在48°C下半衰期的測定方法为在48°C下孵育酶液，在不同处理时间取样，PNPC法測定脂肪酶残余活力百分比。以残余活力百分比的In值对时间t(min)作图，直线的斜率为失活常数kinac;t，由t1/2 = ln2/kinact得到脂肪酶在该温度下的半衰期。脂肪酶的T5tl15測定方法为将一定浓度的酶液分装到PCR管中，利用PCR仪在不同温度下保温15min，再于冰上放置lOmin，室温15min，测定每管中的残余活力。以残余活力百分比的In值对保温温度T(°C)作图，得到斜率k，由T5tl15= ln2/k得到脂肪酶的し15。以下列出本发明中的热稳定性提高的三种脂肪酶突变体的氨基酸残基序列和相应的三种脂肪酶突变体基因的核苷酸序列。<210>SEQ ID NO 1<211>317<212>PRT〈213〉南极假丝酵母脂肪酶B氨基酸序列〈400〉ILeu Rro Ser Gly Ser Asp Rro Ala Phe SerGln Rro Lys Ser ValLeu Asp Ala Gly Leu5101520Thr Cys Gln Gly Ala Ser Rro Ser Ser ValSer Lys Rro lie LeuLeu Val Rro Gly Thr25303540Gly Thr Thr Gly Rro Gln Ser Phe Asp SerAsn Trp lie Rro LeuSer Thr Gln Leu Gly45505560Tyr Thr Rro Cys Trp lie Ser Rro Rro RroPhe Met Leu Asn AspThr Gln Val Asn Thr65707580Glu Tyr Met Val Asn Ala lie Thr Ala LeuTyr Ala Gly Ser GlyAsn Asn Lys Leu Rro859095100Val Leu Thr Trp Ser Gln Gly Gly Leu ValAla Gln Trp Gly LeuThr Phe Phe Rro Ser105110115120lie Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu Met AlaPhe Ala Rro Asp TyrLys Gly Thr Val Leu125130135140Ala Gly Rro Leu Asp Ala Leu Ala Val SerAla Rro Ser Val TrpGln Gln Thr Thr Gly145150155160Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg Asn AlaGly Gly Leu Thr Glnlie Val Rro Thr Thr165170175180Asn Leu Tyr Ser Ala Thr Asp Glu lie ValGln Rro Gln Val SerAsn Ser Rro Leu Asp185190195200Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys Asn ValGln Ala Gln Ala ValCys Gly Rro Leu Phe205210215220Val lie Asp His Ala Gly Ser Leu Thr SerGln Phe Ser Tyr ValVal Gly Arg Ser Ala225230235240Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Arg SerAla Asp Tyr Gly lieThr Asp Cys Asn Rro245250255260
Leu Rro Ala Asn Asp Leu Thr Rro Glu GlnLys Val Ala Ala AlaAla Leu Leu Ala Rro265270275280
Ala Ala Ala Ala lieVal Ala Gly Rro LysGln Asn Cys Glu RroAsp Leu Met Rro Tyr285290295300Ala Arg Rro Phe AlaVal Gly Lys Arg ThrCys Ser Gly lie ValThr Rro305310315317<210>SEQ ID NO 2<211>317<212>PRT〈213〉南极假丝酵母脂肪酶B变体Asp223Gly的氨基酸殘基序列 <400>2Leu Rro Ser Gly SerAsp Rro Ala Phe SerGln Rro Lys Ser ValLeu Asp Ala Gly Leu5101520Thr Cys Gln Gly AlaSer Rro Ser Ser ValSer Lys Rro lie LeuLeu Val Rro Gly Thr25303540Gly Thr Thr Gly RroGln Ser Phe Asp SerAsn Trp lie Rro LeuSer Thr Gln Leu Gly45505560Tyr Thr Rro Cys Trplie Ser Rro Rro RroPhe Met Leu Asn AspThr Gln Val Asn Thr65707580Glu Tyr Met Val AsnAla lie Thr Ala LeuTyr Ala Gly Ser GlyAsn Asn Lys Leu Rro859095100Val Leu Thr Trp SerGln Gly Gly Leu ValAla Gln Trp Gly LeuThr Phe Phe Rro Ser105110115120lie Arg Ser Lys ValAsp Arg Leu Met Ala Phe Ala Rro Asp TyrLys Gly Thr Val Leu125130135140Ala Gly Rro Leu AspAla Leu Ala Val SerAla Rro Ser Val TrpGln Gln Thr Thr Gly145150155160Ser Ala Leu Thr ThrAla Leu Arg Asn Ala Gly Gly Leu Thr Glnlie Val Rro The Thr165170175180Asn Leu Tyr Ser AlaThr Asp Glu lie ValGln Rro Gln Val SerAsn Ser Rro Leu Asp185190195200Ser Ser Tyr Leu PheAsn Gly Lys Ash ValGln Ala Gln Ala ValCys Gly Rro Leu Phe205210215220Val lie Gly His AlaGly Ser Leu Thr SerGln Phe Ser Tyr ValVal Gly Arg Ser Ala225230235240Leu Arg Ser Thr ThrGly Gln Ala Arg SerAla Asp Tyr Gly lieThr Asp Cys Asn Rro245250255260Leu Rro Ala Asn AspLeu Thr Rro Glu GlnLys Val Ala Ala AlaAla Leu Leu Ala Rro265270275280Ala Ala Ala Ala lieVal Ala Gly Rro LysGln Asn Cys Glu RroAsp Leu Met Rro Tyr285290295300L0137JAla Arg Rro Phe AlaVal Gly Lys Arg ihrCys Ser Gly lie Valihr Rro305310315317<210>SEQ ID NO 3<211>317<212>PRT〈213〉南极假丝酵母脂肪酶B变体Leu278Met的氨基酸蘇序列<400>3Leu Pro Ser Gly SerAsp Rro Ala Phe SerGin Rro Lys Ser ValLeu Asp Ala Gly Leu5101520Thr Cys Gin Gly AlaSer Rro Ser Ser ValSer Lys Rro lie LeuLeu Val Rro Gly Thr25303540Gly Thr Thr Gly RroGin Ser Phe Asp SerAsn Trp lie Rro LeuSer Thr Gin Leu Gly45505560Tyr Thr Rro Cys Trplie Ser Rro Rro RroPhe Met Leu Asn AspThr Gin Val Asn Thr65707580Glu Tyr Met Val AsnAla lie Thr Ala LeuTyr Ala Gly Ser GlyAsn Asn Lys Leu Rro859095100Val Leu Thr Trp SerGin Gly Gly Leu ValAla Gin Trp Gly LeuThr Phe Phe Rro Ser105110115120lie Arg Ser Lys ValAsp Arg Leu Met AlaPhe Ala Rro Asp TyrLys Gly Thr Val Leu125130135140Ala Gly Rro Leu AspAla Leu Ala Val SerAla Rro Ser Val TrpGin Gin Thr Thr Gly145150155160Ser Ala Leu Thr ThrAla Leu Arg Asn AlaGly Gly Leu Thr Ginlie Val Rro Thr Thr165170175180Asn Leu Tyr Ser AlaThr Asp Glu lie ValGin Rro Gin Val SerAsn Ser Rro Leu Asp185190195200Ser Ser Tyr Leu PheAsn Gly Lys Asn ValGin Ala Gin Ala ValCys Gly Rro Leu Phe205210215220Val lie Asp His AlaGly Ser Leu Thr SerGin Phe Ser Tyr ValVal Gly Arg Ser Ala225230235240Leu Arg Ser Thr ThrGly Gin Ala Arg SerAla Asp Tyr Gly lieThr Asp Cys Asn Rro245250255260Leu Rro Ala Asn AspLeu Thr Rro Glu GinLys Val Ala Ala AlaAla Leu Met Ala Rro265270275280Ala Ala Ala Ala lieVal Ala Gly Rro LysGin Asn Cys Glu RroAsp Leu Met Rro Tyr285290295300Ala Arg Rro Phe AlaVal Gly Lys Arg ThrCys Ser Gly lie ValThr Rro305310315317
<210>SEQ ID NO 4<211>317<212>PRT〈213〉南极假丝酵母脂肪酶B变体Asp223Gly/Leu278Met的氨基酸殘基序列<400>4Leu Pro Ser Gly SerAsp Pro Ala Phe SerGin Pro Lys Ser ValLeu Asp Ala Gly Leu5101520Thr Cys Gin Gly AlaSer Pro Ser Ser ValSer Lys Pro lie LeuLeu Val Pro Gly Thr25303540Gly Thr Thr Gly ProGin Ser Phe Asp SerAsn Trp lie Pro LeuSer Thr Gin Leu Gly45505560Tyr Thr Pro Cys Trplie Ser Pro Pro ProPhe Met Leu Asn AspThr Gin Val Asn Thr65707580Glu Tyr Met Val AsnAla lie Thr Ala LeuTyr Ala Gly Ser GlyAsn Asn Lys Leu Pro859095100Val Leu Thr Trp SerGin Gly Gly Leu ValAla Gin Trp Gly LeuThr Phe Phe Pro Ser105110115120lie Arg Ser Lys ValAsp Arg Leu Met AlaPhe Ala Pro Asp TyrLys Gly Thr Val Leu125130135140Ala Gly Pro Leu AspAla Leu Ala Val SerAla Pro Ser Val TrpGin Gin Thr Thr Gly145150155160Ser Ala Leu Thr ThrAla Leu Arg Asn AlaGly Gly Leu Thr Ginlie Val Pro Thr Thr165170175180Asn Leu Tyr Ser AlaThr Asp Glu lie ValGin Pro Gin Val SerAsn Ser Pro Leu Asp185190195200Ser Ser Tyr Leu PheAsn Gly Lys Asn ValGin Ala Gin Ala ValCys Gly Pro Leu Phe205210215220Val lie Gly His AlaGly Ser Leu Thr SerGin Phe Ser Tyr ValVal Gly Arg Ser Ala225230235240Leu Arg Ser Thr ThrGly Gin Ala Arg SerAla Asp Tyr Gly lieThr Asp Cys Asn Pro245250255260Leu Pro Ala Asn AspLeu Thr Pro Glu GinLys Val Ala Ala AlaAla Leu Met Ala Pro265270275280Ala Ala Ala Ala lieVal Ala Gly Pro LysGin Asn Cys Glu ProAsp Leu Met Pro Tyr285290295300Ala Arg Pro Phe AlaVal Gly Lys Arg ThrCys Ser Gly lie ValThr Pro305310315317<210>SEQ ID NO 5<211>954<212>DNA
〈213〉南极假丝酵母脂肪酶B变体Asp223Gly基因的核苷酸序列 〈400>5CTACCTTCCG GTTCGGACCC TGCCTTTTCGCAGCCCAAGT CGGTGCTCGA TGCGGGTCTG60ACCTGCCAGG GTGCTTCGCC ATCCTCGGTCTCCAAACCCA TCCTTCTCGT CCCCGGAACC120GGCACCACAG GTCCACAGTC GTTCGACTCGAACTGGATTC CCCTCTCAAC GCAGTTGGGT180TACACACCCT GCTGGATCTC ACCCCCGCCGTTCATGCTCA ACGACACCCA GGTCAACACG240GAGTACATGG TCAACGCCAT CACCGCGCTCTACGCTGGTT CGGGCAACAA CAAACTTCCC、300GTGCTTACCT GGTCCCAGGG TGGTCTGGTTGCACAGTGGG GTCTGACCTT CTTCCCCAGT360ATCAGGTCCA AGGTCGATCG ACTTATGGCCTTTGCGCCCG ACTACAAGGG CACCGTCCTC420GCCGGCCCTC TCGATGCACT CGCGGTTAGTGCACCCTCCG TATGGCAGCA AACCACCGGT480TCGGCACTCA CCACCGCACT CCGAAACGCAGGTGGTCTGA CCCAGATCGT GCCCACCACC540AACCTCTACT CGGCGACCGA CGAGATCGTTCAGCCTCAGG TGTCCAACTC GCCACTCGAC600TCATCCTACC TCTTCAACGG AAAGAACGTCCAGGCACAGG CCGTGTGTGG GCCGCTGTTC660GTCATCGGTC ATGCAGGCTC GCTCACCTCGCAGTTCTCCT ACGTCGTCGG TCGATCCGCC720CTGCGCTCCA CCACGGGCCA GGCTCGTAGTGCAGACTATG GCATTACGGA CTGCAACCCT780CTTCCCGCCA ATGATCTGAC TCCCGAGCAAAAGGTCGCCG CGGCTGCGCT CCTGGCGCCG840GCAGCTGCAG CCATCGTGGC GGGTCCAAAGCAGAACTGCG AGCCCGACCT CATGCCCTAC900GCCCGCCCCT TTGCAGTAGG CAAAAGGACCTGCTCCGGCA TCGTCACCCC CTGA954<210>SEQ IDNO 6<211>954<212>DNA〈213〉南极假丝酵母脂肪酶B变体Leu278Met基因的核苷酸序列<400>6CTACCTTCCG GTTCGGACCC TGCCTTTTCGCAGCCCAAGT CGGTGCTCGA TGCGGGTCTG60ACCTGCCAGG GTGCTTCGCC ATCCTCGGTCTCCAAACCCA TCCTTCTCGT CCCCGGAACC120GGCACCACAG GTCCACAGTC GTTCGACTCGAACTGGATTC CCCTCTCAAC GCAGTTGGGT180TACACACCCT GCTGGATCTC ACCCCCGCCGTTCATGCTCA ACGACACCCA GGTCAACACG240GAGTACATGG TCAACGCCAT CACCGCGCTCTACGCTGGTT CGGGCAACAA CAAACTTCCC300GTGCTTACCT GGTCCCAGGG TGGTCTGGTTGCACAGTGGG GTCTGACCTT CTTCCCCAGT360ATCAGGTCCA AGGTCGATCG ACTTATGGCCTTTGCGCCCG ACTACAAGGG CACCGTCCTC420GCCGGCCCTC TCGATGCACT CGCGGTTAGTGCACCCTCCG TATGGCAGCA AACCACCGGT480TCGGCACTCA CCACCGCACT CCGAAACGCAGGTGGTCTGA CCCAGATCGT GCCCACCACC540AACCTCTACT CGGCGACCGA CGAGATCGTTCAGCCTCAGG TGTCCAACTC GCCACTCGAC600TCATCCTACC TCTTCAACGG AAAGAACGTCCAGGCACAGG CCGTGTGTGG GCCGCTGTTC660GTCATCGACC ATGCAGGCTC GCTCACCTCGCAGTTCTCCT ACGTCGTCGG TCGATCCGCC720CTGCGCTCCA CCACGGGCCA GGCTCGTAGTGCAGACTATG GCATTACGGA CTGCAACCCT780CTTCCCGCCA ATGATCTGAC TCCCGAGCAAAAGGTCGCCG CGGCTGCGCT CATGGCGCCG840GCAGCTGCAG CCATCGTGGC GGGTCCAAAGCAGAACTGCG AGCCCGACCT CATGCCCTAC900GCCCGCCCCT TTGCAGTAGG CAAAAGGACCTGCTCCGGCA TCGTCACCCC CTGA954<210>SEQ IDNO 7
<211>954<212>DNA〈213〉南极假丝酵母脂肪酶B变体Asp223Gly/eu278Met基因的核苷酸序列<400>7CTACCTTCCG GTTCGGACCC TGCCTTTTCGCAGCCCAAGT CGGTGCTCGA TGCGGGTCTG60ACCTGCCAGG GTGCTTCGCC ATCCTCGGTCTCCAAACCCA TCCTTCTCGT CCCCGGAACC120GGCACCACAG GTCCACAGTC GTTCGACTCGAACTGGATTC CCCTCTCAAC GCAGTTGGGT180TACACACCCT GCTGGATCTC ACCCCCGCCGTTCATGCTCA ACGACACCCA GGTCAACACG240GAGTACATGG TCAACGCCAT CACCGCGCTCTACGCTGGTT CGGGCAACAA CAAACTTCCC300GTGCTTACCT GGTCCCAGGG TGGTCTGGTTGCACAGTGGG GTCTGACCTT CTTCCCCAGT360ATCAGGTCCA AGGTCGATCG ACTTATGGCCTTTGCGCCCG ACTACAAGGG CACCGTCCTC420GCCGGCCCTC TCGATGCACT CGCGGTTAGTGCACCCTCCG TATGGCAGCA AACCACCGGT480TCGGCACTCA CCACCGCACT CCGAAACGCAGGTGGTCTGA CCCAGATCGT GCCCACCACC540AACCTCTACT CGGCGACCGA CGAGATCGTTCAGCCTCAGG TGTCCAACTC GCCACTCGAC600TCATCCTACC TCTTCAACGG AAAGAACGTCCAGGCACAGG CCGTGTGTGG GCCGCTGTTC660GTCATCGGGC ATGCAGGCTC GCTCACCTCGCAGTTCTCCT ACGTCGTCGG TCGATCCGCC720CTGCGCTCCA CCACGGGCCA GGCTCGTAGTGCAGACTATG GCATTACGGA CTGCAACCCT780CTTCCCGCCA ATGATCTGAC TCCCGAGCAAAAGGTCGCCG CGGCTGCGCT CATGGCGCCG840GCAGCTGCAG CCATCGTGGC GGGTCCAAAGCAGAACTGCG AGCCCGACCT CATGCCCTAC900 GCCCGCCCCT TTGCAGTAGG CAAAAGGACCTGCTCCGGCA TCGTCACCCC CTGA95权利要求
1.一种热稳定性提高的脂肪酶突变体，其特征在干由南极假丝酵母脂肪酶B基因出发，运用多轮定点饱和突变而获得；所述南极假丝酵母脂肪酶B具有SEQ ID No :1所示的氨基酸残基序列；所述脂肪酶突变体具有SEQ ID No :2、SEQ ID No :3或SEQ ID No :4所示的氨基酸残基序列，SEQ ID No :2、SEQ ID No 3和SEQ ID No :4均由317个氨基酸组成。
2.根据权利要求I所述的热稳定性提高的脂肪酶突变体的构建方法，其特征在于包括以下步骤 A、南极假丝酵母脂肪酶B基因的克隆 对南极假丝酵母脂肪酶B基因通过上游引物和下游引物扩增目的基因； 上游引物5 ’ -AATACCATGGCTCTACCTTCCGGTTCG-3 ’，带下划线碱其为限制性内切酶NcoI识别位点； 下游引物5 ’ -TAACTCGAGGGGGGTGACGATGCCGGA-3 ’，带下划线碱基为限制性内切酶XhoI识别位点； 以Takara的PrimeSTAR为聚合酶，在上游引物和下游引物的參与下进行PCR反应，得到PCR扩增产物；DpnI消化模板，回收，纯化该目的片段，将其用限制性内切酶NcoI和XhoI进行双酶切后与经同样酶双酶切的质粒pET22b (Novagen)进行连接，将连接产物转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中，将转化细胞涂布于含有100ug/ml氨苄的LB平板上筛选阳性克隆，得到重组质粒，将该重组质粒命名为pET22b-CALB ； B、南极假丝酵母脂肪酶B的结构分析及热点确定 对南极假丝酵母脂肪酶B的晶体结构进行分析(ID :1TCA)，脂肪酶的催化三联体为自N端起第104位的丝氨酸、第187位的天冬氨酸和第224位的组氨酸，选取催化丝氨酸周围的氨基酸残基进行B因子的分析，确定下列B因子较高的残基作为饱和突变的热点自N端起第278位亮氨酸，285位缬氨酸，277位亮氨酸，281位甘氨酸，223位天冬氨酸； C、南极假丝酵母脂肪酶B突变体库的建立及突变体的筛选 Cl、根据热点构建饱和突变体库并导入宿主细胞 以重组质粒pET22b-CALB作为模板，针对步骤B中确定的热点，分别在与第278位亮氨酸、第285位缬氨酸、第277位亮氨酸、第281位甘氨酸和第223位天冬氨酸相对应的核苷酸处利用NNK代替原有密码子，设计简并引物，并进行全质粒PCR反应，构建5个定点饱和突变PCR扩增产物，反应结束后，DpnI消化模板，回收，纯化后的PCR产物直接电击导入大肠杆菌Rosetta(DE3)中，将转化后的大肠杆菌直接涂布于含有100ug/ml氨苄和含有2% (v/V)乳化好的三丁酸甘油脂的LB抗性平板上，在37°C下培养16-24小时，得到针对5个热点的饱和突变体库； C2、从饱和突变体库中筛选热稳定性提高的突变体 将步骤C I中37°C培养后的LB抗性平板在4°C下放置I天，进行初步筛选，将产生透明圈的菌落，接种于含有100ug/ml氨节LB培养基的96孔板中，于37°C过夜培养,得到分属5个突变体库的母板； 从培养好的母板中吸取20ul液体至新的含有100ug/ml氨苄LB培养基的96孔板中，37°C培养3h，4°C放置30min，再加入终浓度为ImM的IPTG，15°C培养24h ； 利用冻融破碎的方法裂解菌体，得到粗酶液；将所得到的粗酶液在49°C下孵育15min，再于冰上放置lOmin，室温放置15min，測定每孔的残余活力；将从5个突变体库中筛选到的阳性突变体接入5ml小试管中，至0D600为0. 6-0. 8吋，加入IPTG至终浓度ImM，15°C诱导表达，超声破碎后测定粗酶液的T5tl15,确定热稳定性最高的突变体，进行测序，至此，完成了第一轮筛选，得到两个热点的优秀突变体，分别是D223G和 L278M ； 以L278M的基因作为模板，进行迭代饱和突变针对285位缬氨酸、277位亮氨酸、281位甘氨酸和223位天冬氨酸位点设计饱和突变库，并參考上述步骤进行新ー轮的筛选； 经过多轮的迭代饱和突变，获得了三株热稳定性明显提高的菌株，測定脂肪酶核苷酸序列得出三株突变体分别为Asp223Gly、Leu278Met 和 Asp223Gly/Leu278Met。
3.如权利要求2所述的热稳定性提高的脂肪酶突变体的构建方法，其特征在于步骤A中所述的PCR反应的反应条件为98°C 2min ;然后98°C 10sec，55°C 15sec，72°C lmin，共25个循环；最后72°C IOmin0
4.如权利要求I所述的热稳定性提高的脂肪酶突变体，其特征在于步骤Cl中所述的该PCR反应使用TaKaRa公司的PrimeSTAR DNA聚合酶，PCR反应条件为98°C 2min ;然后980C IOsec, 55°C 15sec，72で 7min，共 25 个循环；最后 72で IOmin0
5.根据权利要求I所述的热稳定性提高的脂肪酶突变体的基因，其特征在于所述的热稳定性提高的脂肪酶突变体的基因的核苷酸序列如SEQ ID No 5, SEQ ID No :6或SEQID No 7 所示。
6.根据权利要求I所述的热稳定性提高的脂肪酶突变体的应用，其特征在于所述的热稳定性提高的脂肪酶突变体应用于洗涤剂、添加剤、食品、制药、造纸、或生物能源エ业生产中。
全文摘要
本发明提供了一种热稳定性提高的脂肪酶突变体及其构建方法。热稳定性提高的脂肪酶突变体由南极假丝酵母脂肪酶B基因出发，运用多轮定点饱和突变而获得；所述南极假丝酵母脂肪酶B具有SEQ ID No1所示的氨基酸残基序列；所述脂肪酶突变体具有SEQ ID No2、SEQ ID No3或SEQ ID No4所示的氨基酸残基序列，SEQ ID No2、SEQ ID No3和SEQ ID No4均由317个氨基酸组成。本发明运用半理性设计的方法，对南极假丝酵母脂肪酶B基因进行多轮定点饱和突变，获取脂肪酶突变体，这些突变体包含氨基酸突变D223G、L278M及它们的组合。以各自的T5015及48℃的半衰期t1/2来表示，脂肪酶突变体的热稳定性得到了提高。具有较高的实际应用价值和广阔的市场前景。
文档编号C12N15/63GK102660517SQ20111040692
公开日2012年9月12日 申请日期2011年12月8日 优先权日2011年12月8日
发明者冯雁, 杨广宇, 谢渊 申请人:上海交通大学