专利名称：改进的大范围核酸酶重组系统的制作方法
改进的大范围核酸酶重组系统本发明涉及一组试剂，其允许将DNA序列引入靶细胞基因组中的特定位点。特别地，该DNA序列编码基因，并通过诱导型同源重组(homologous recombination,HR)事件被引入靶细胞中。本发明还涉及ー组遗传构建体，其包含与大范围核酸酶基因组靶位点侧翼的部分具有同源性的至少两个部分和阳性选择标记及阴性选择标记；以及涉及将DNA序列引入靶细胞基因组的改进方法。自超过25年前酵母中的首个基因祀向实验(Hinnen等，1978 ;Rothstein, 1983)以来，已在多种细胞中采用同源重组(HR)来插入、替换和缺失基因组序列(Thomas和Capecchi, 1987 ；Capecchi, 2001 ；Smithies, 2001) 哺乳动物细胞中革巴向事件的发生频率非常低，使得对天然HR的利用变得不切实际。可以通过基因座处的特定DNA双链断裂(DNAdouble-strand break, DSB)来显著提高同源重组的频率(Rouet 等，1994 ;Choulika 等，1995) ο该DSB可以由大范围核酸酶(meganuclease)诱导,所述大范围核酸酶是识别大DNA识别靶位点(12至30bp)的序列特异性内切核酸酶。
大范围核酸酶对其DNA靶标表现出高特异性，这些蛋白质可切割独特的染色体序列，因此不影响全基因组完整性。天然大范围核酸酶主要以归巢内切核酸酶(homingendonuclease)为代表,所述归巢内切核酸酶是见于真核细胞、细菌和古细菌(archae)中的一类广泛分布的蛋白质(Chevalier和Stoddard, 2001)。对Ι-Scel和HO归巢内切核酸酶的早期研究已阐明了可如何将这些蛋白质的切割活性用于启动活细胞中的HR事件，并且已证明了 染色体 DSB 致重组特性(recombinogenic property) (Dujon 等，1986 ；Haber,1995)。从那时起，大范围核酸酶诱导的同源重组已成功地在细菌(Posfai等，1999)、哺乳动物细胞(Sargent 等，1997 ；Donoho 等，1998 ；Cohen-Tannoudji 等，1998)、小鼠(Gouble等，2006)和植物(Puchta等，1996 ;Siebert和Puchta，2002)中用于基因组工程目的。最近，已改造TAL效应子内切核酸酶(TAL effector endonuclease, TALEN)以高特异性地识别和切割DNA靶标。这些TALEN包含与核酸酶结构域(例如，FokI)融合的TAL (转录激活因子样)效应子DNA结构域(Christian等,2010)。另ー类核酸酶也可用于切割基因组靶并因此诱导DSB，该另ー类核酸酶被称为锌指核酸酶(Zinc-finger nuclease, ZFN),并且是通过将锌指DNA结合结构域与DNA切割结构域融合产生的人造限制酶。可以以与TAL类似的方式改造锌指结构域以靶向任意DNA序列(Kim 等，1996)。虽然可获得可在靶细胞基因组中特定位点处诱导DSB的材料在増加，但是还未开发出常规可重复地转化靶细胞群的方法和材料。所存在的多种原因包括原核生物基因组或更特别是真核生物基因组固有的复杂性。工作人员越来越多地发现基因组具有卓越的抗损伤能力，这恰是DSB的本质所在。此外，在产生转化方法中，对所有转化方法而言都存在的技术限制(即从背景未转化细胞群中常规地鉴别出稀少转化体的能力)继续表现出问题。提供了利用HR在将目的序列引入靶细胞或生物体的基因组中任意位点的潜能的方法，从而允许可能比以往任何时候更细致地进行基因组操作。本发明的发明人现在已开发出一组新的遗传构建体，其包含
a)由核酸分子编码的构建体(i)，其至少包含以下组分(N) n-H0M01-P-M-H0M02- (N)m(i)其中，η和m是整数并且代表O或I,前提是η = I时，m = 0而当η = 0时，m =I ;因此组分N可设置在H0M01之前或N0M02之后，并且，组分P和M在H0M01与H0M02之间的顺序可设置为P-M或M-P ；其中N 包含组分(PROMl)-(NEG)-(TERMl) ;P 包含组分(PR0M2) - (POS) - (TERM2)并且 M 包含组分(PR0M3)-(MCS)-(TERM3);以及其中PROMl是第一转录启动序列；NEG是阴性选择标记；TERM1是第一转录终止序列；H0M01是与核酸酶DNA靶序列之前的基因组部分具有同源性的一部分；PR0M2是第二转录启动序列；P0S是阳性选择标记；TERM2是第二转录终止序列；PR0M3是第三转录启动序列；MCS是多克隆位点，其中可以插入目的基因(gene of interest, GOI) ;TERM3是第三转 录终止序列；H0M02是与大范围核酸酶、TALEN或ZFN的所述DNA靶序列之后的基因组部分具有同源性的部分；b)至少ー种选自包括构建体(ii)或(iii)组成的组的构建体,所述构建体(ii)或(iii)由至少包含ー种以下组分的核酸分子编码PR0M4-NUCl(ii)；NUC2(iii);或该组还包含序列(iv)，其为至少包含以下组分的分离或重组蛋白质NUC3 (iv)；其中PR0M4是第四转录启动序列；NUC1是大范围核酸酶、TALEN或ZFN的开放读码框(ORF) ；NUC2是所述大范围核酸酶、TALEN或ZFN的信使RNA(mRNA)形式；NUC3是所述大范围核酸酶、TALEN或ZFN的分离或重组蛋白质；其中来自构建体(ii)或(iii)或者序列(iv)的所述大范围核酸酶、所述TALEN或所述ZFN识别并切割所述DNA靶序列；并且其中构建体(ii)或(iii)或者序列(iv)设置成与构建体(i)共转染到至少ー种靶细胞中。更一般地，任何能够特异性地切割基因组靶并因此诱导DSB并且具有12至45bp双链DNA靶序列的核酸酶均可用于本发明中。本发明所包含的核酸酶的非限制性实例有大范围核酸酶、TALEN、ZFN，但本发明也可以与定义为任意融合蛋白的嵌合内切核酸酶并用，所述融合蛋白至少包含一种能够切割基因组靶并因此诱导DSB并且具有12至45bp双链DNA靶序列的内切核酸酶。除了可在特定基因组靶标处诱导DSB的核酸酶以外，本发明还包括可在12至45bp的特定基因组祀序列处诱导单链断裂(single strand break, SSB)之核酸酶的用途。SSB还称为缺ロ(nick)并且这种缺ロ核酸酶明确地包括在本发明中。在图I中以非限制性方式示出本发明的构建体，整合基质[构建体(i)]和核酸酶表达质粒[构建体(ii)]被共转染到细胞中。基于共转染，经改造的核酸酶被表达，识别其内源识别位点，与其结合并在该特定位点诱导DNA双链断裂。细胞感知DNA损伤并触发同源重组以对其进行修复，采用经共转染的整合基质作为DNA修复基质，因它包含与周围断裂DNA同源的区域。在该重组事件期间，克隆到整合基质的同源区之间的阳性选择标记(POS)和GOI在大范围核酸酶识别位点被整合。于是，可以选择稳定的靶细胞克隆用于药物抗性和目的重组蛋白的表达。
下文中提供了可用于本发明构建体之遗传元件类型的实例。这些实例仅为示例性的并且不应被以任何方式理解为限制本发明的范围。如下表I中提供了阳性和阴性选择标记基因的列表。表I
权利要求
1.一组遗传构建体，其包含 a)构建体(i)，其由至少包含以下组分的核酸分子所编码(N) n-H0M01-P-M-H0M02-(N)m(i) 其中,η和m为整数并且代表O或I,前提是当η = I时m = 0而当η = 0时m = I;因此组分N可被设置在HOMOl之前或H0M02之后，并且组分P和M可按顺序P-M或M-P设置； 其中 N 包含组分(PROMl)-(NEG)-(TERMl) ;P 包含组分(PR0M2) - (POS) - (TERM2);并且M 包含组分(PR0M3) - (MCS) - (TERM3);以及 其中PROMl为第一转录启动序列；NEG为阴性选择标记；TERM1为第一转录终止序列；H0M01为与核酸酶DNA靶序列之前的基因组部分同源的部分；PR0M2为第二转录启动序列；POS为阳性选择标记；TERM2为第二转录终止序列；PR0M3为第三转录启动序列；MCS为多克隆位点；TERM3为第三转录终止序列；H0M02为与所述核酸酶DNA靶序列之后的基因组部分同源的部分； b)至少一种选自包括构建体(ii)或(iii)在内的组的构建体，所述构建体(ii)或(iii)由至少包含以下组分的核酸分子所编码PR0M4-NUCl(ii)； NUC2(iii);或 所述组还包含序列(iv)，其为至少包含以下组分的分离或重组蛋白质NUC3 (iv)； 其中PR0M4为第四转录启动序列；NUC1为大范围核酸酶、TALEN或ZFN的开放读码框(ORF) ；MEGA2为所述大范围核酸酶、所述TALEN或所述ZFN的信使RNA(mRNA)形式；MEGA3为所述大范围核酸酶、所述TALEN或所述ZFN的分离或重组蛋白质；其中来自构建体(ii)或(iii)或者序列(iv)的所述大范围核酸酶、所述TALEN或所述ZFN识别并切割所述核酸酶DNA靶序列；并且其中构建体(ii)或(iii)或者序列(iv)被设置成与构建体⑴共转染到至少一种靶细胞中。
2.权利要求I的构建体组，其中来自构建体(i)的所述组分H0M01和H0M02包含与所述核酸酶DNA靶序列侧翼的靶细胞基因组部分具有同源性的至少200bp并且不多于6000bp的序列。
3.权利要求I或2的构建体组，其中来自构建体(i)的所述组分H0M01和H0M02包含与所述核酸酶DNA靶序列侧翼的靶细胞基因组部分具有同源性的至少IOOObp并且不多于2000bp的序列ο
4.权利要求1、2或3的构建体组，其中所述组分(POS)选自新霉素磷酸转移酶抗性基因nptl(SEQ ID NO 3)、潮霉素磷酸转移酶抗性基因hph (SEQ ID NO 4)、嘌呤霉素N-乙酰转移酶基因pac(SEQ ID N05)、杀稻瘟素S脱氨酶抗性基因bsr (SEQ ID NO 6)、博来霉素抗性基因 sh ble(SEQ ID NO 7)。
5.权利要求I至4中任一项的构建体组，其中所述组分(NEG)选自缺失CpG岛的单纯疱疹病毒的胸苷激酶基因HSV TK DelCpG(SEQID NO 8)、与缺失CpG岛的尿嘧啶磷酸核糖基转移酶基因偶联的胞嘧啶脱氨酶CD :UPRT DelCpG (SEQ ID NO 9)。
6.权利要求I至5中任一项的构建体组，其中所述元件PROMl、PR0M2、PR0M3和PR0M4选自巨细胞病毒的立即早期启动子PCMV(SEQ ID NO 10);猿病毒40启动子pSV40 (SEQID NO 11);人延伸因子la启动子phEFla (SEQ ID NO 12);人磷酸甘油酸激酶启动子phPGK (SEQ ID NO 13);小鼠磷酸甘油酸激酶启动子pmPGK (SEQ ID NO 14);人多聚泛素启动子phUbc (SEQ ID NO 15);来自人单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子pHSV_TK (SEQ ID NO16);人生长抑制特异性5启动子phGAS5(SEQ ID NO 17);四环素响应元件pTRE(SEQ IDN018);来自脑心肌炎病毒的内部核糖体进入位点(IRES)序列IRES EMCV(SEQ ID NO 19)；来自口蹄疫病毒的 IRES 序列 IRES FMDV(SEQ IDNO 20)，SV40。
7.权利要求I至6中任一项的构建体组，其中所述元件TERM1、TERM2、TERM3和TERM4选自聚腺苷化信号SV40pA(SEQ ID N021)、牛生长激素聚腺苷化信号BGH pA(SEQ ID NO22)。
8.权利要求I至7中任一项的构建体组，其中所述元件MCS在其5’端或3’端包含框内肽标签,其中所述肽标签选自FLAG (SEQ ID NO 23)、FLASH/REASH(SEQ ID NO 24), IQ (SEQID NO 25)、组氨酸(SEQID NO 26) ,STREP (SEQ ID NO 27)、链霉亲和素 结合蛋白 SBP (SEQIDNO 28)、钙调素结合蛋白 CBP (SEQ ID NO 29)、血凝素 HA (SEQ IDNO 30)、c-myc (SEQ ID NO31)、V5标签序列(SEQ ID NO 32)、来自核质蛋白的核定位信号(NLS) (SEQ ID NO 33)、来自 SV40 的 NLS (SEQID NO 34)、NLS 共有序列(SEQ ID NO 35)、凝血酶切割位点(SEQ ID NO36)、P2A 切割位点(SEQ ID NO 37)、T2A 切割位点(SEQ ID NO 38)、E2A 切割位点(SEQ IDNO 39)。
9.权利要求I至8中任一项的构建体组，其中所述元件MCS包含报告基因，所述报告基因选自萤火虫萤光素酶基因(SEQ ID NO 40)、海肾萤光素酶基因(SEQ ID NO 41)、β-半乳糖苷酶酶基因LacZ (SEQ IDNO 42)、人分泌型碱性磷酸酶基因hSEAP (SEQ ID NO 43)、鼠分泌型碱性磷酸酶基因mSEAP(SEQ ID NO 44)。
10.权利要求I至9中任一项的遗传构建体组，其中构建体⑴包含SEQID NO 45或SEQ ID NO 46o
11.一种将编码GOI的序列引入至少一种细胞中的试剂盒，其包含根据权利要求I至10中任一项的遗传构建体组；以及使用所述遗传构建体组产生转化细胞的说明。
12.权利要求11的试剂盒，其还至少包含一种靶细胞，所述靶细胞选自=CHO-Kl细胞、ΗΕΚ293 细胞、Caco2 细胞、U2-0S 细胞、NIH 3T3 细胞、NSO 细胞、SP2 细胞、CH0-S 细胞、DG44细胞。
13.一种通过同源重组转化至少一种细胞的方法，其包括以下步骤 a)将编码目的基因的序列克隆到权利要求I至9中任一项的构建体(i)的位置MCS中； b)用步骤b)中的所述构建体(i)与权利要求I至9中任一项的构建体(ii)、(iii)或序列(iv)中至少一种共转染靶细胞； c)基于以下条件从所述靶细胞中选择至少一种细胞存在组分(POS)以及不存在组分(NEG)。
14.权利要求13的方法，其中根据(POS)和(NEG)编码的基因产物的活性依次进行步骤c)中的选择。
15.权利要求13的方法，其中根据(POS)和(NEG)编码的基因产物的活性同时进行步骤c)中的选择。
全文摘要
本发明涉及一组遗传构建体，其至少包含第一致重组构建体(i)和第二构建体(ii、iii或iv)，所述第一致重组构建体(i)具有至少两个与位点特异性内切核酸酶的DNA靶标位点之前和之后的基因组区域同源的部分，并且还包含插入所述同源部分的阴性选择标记和阳性选择标记以及其中可将目的序列克隆到邻近阳性选择标记的区域；所述第二构建体(ii、iii或iv)包含大范围核酸酶。本发明还涉及包含这些构建体的试剂盒以及使用该组构建体将目的序列引入到靶细胞、组织或生物体之基因组中的方法。
文档编号C12N9/22GK102858966SQ201180014623
公开日2013年1月2日 申请日期2011年2月18日 优先权日2010年2月18日
发明者克里斯托夫·德朗达, 让-皮埃尔·卡巴尼奥尔斯 申请人:赛莱克蒂斯公司