诱导性多能干细胞的制备方法

专利名称：诱导性多能干细胞的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种诱导性多能干细胞的制备方法，其主要使用核酸，特别是微RNA。
背景技术：
再生医疗作为一种就连部分身体因事故或疾病造成无法自然治愈程度的损伤也能够期待从这种状况恢复过来的医疗手段，是发展被大为期盼的领域。特别是可以期待若能从源自患者本人的细胞进行组织等的再生，并将其移植，则不存在免疫排斥反应的问题，可以大大降低患者及医疗机构双方的负担。迄今为止，在皮肤或角膜等部分组织中，正在对基于再生医疗的治疗方法进行开发。但是，现状是再生医疗并不能适用于所有组织。再生医疗发展的障碍之一是难以得到具有能分化为任何细胞、组织或脏器的分化多能性及自我复制能力的细胞。胎儿期以后的人身上虽然存在可分化为有限细胞或组织并能自我复制的干细胞，但是不存在具有可向任意细胞分化的分化多能性及自我复制能力的多能干细胞。在作为模型生物系统的小鼠方面，已确立从初期胚胎建立作为多能干细胞的胚胎干细胞(ES细胞)株的方法。但是，在人类方面，制备ES细胞需要破坏发育中的初期胚胎，摘出细胞，因此在伦理方面的障碍极大，事实上不可能制备每名患者的ES细胞。这种情况下，近年来所报告的通过初始化体细胞而制备的诱导性多能干细胞(iPS细胞)作为可以从容易得到的体细胞制备多能干细胞的方法而备受瞩目。该技术的特征在于，向体细胞中导入作为核重编程因子(Nuclear reprogramming factor)的0ct3/4、Sox2、c-Myc及Klf4基因(专利文献I)。若活用制备iPS细胞的技术，则可以期待任何患者都能够得到多能干细胞，使得在现有技术中为不可能再生的脏器或神经等的再生成为可能。但是，通过该技术制备的诱导性多能干细胞中，作为面向临床应用的重要问题，指出了移植后细胞的肿瘤化及诱导性多能干细胞的制备效率低等。指出肿瘤化的原因是导入了作为原癌基因的c-Myc基因，或通过将导入基因插入基因组中而诱发了成为新的癌原因的变异。诱导性多能干细胞的制备效率低，是因为需要以基因组插入为基础的方法以外的方法中的基于诱导的反复实验(trial and error)。为了解决这样的问题，已研究了以下方法(I)尝试将癌基因的导入从导入基因中除去，并进行诱导的方法；(2)使用蛋白质的方法或导入质粒的方法；(3)使用各种病毒载体的方法。但是，现状是任何方法都由于导入效率低等理由，而无法确立可以满足医疗产业的技术。以这样的现有技术为背景，期望开发出满足医疗产业的制备诱导性多能干细胞的技术。专利文献专利文献I :国际公开第2007/069666号非专利文献非专利文献1 :科学(Science)，2008，322 ;949_953·非专利文献2 :核酸研究(Nucleic Acid Research), 2008, 36 ;D154_D158.
非专利文献3 :细胞(Cell)，2006，126 ;663_676.非专利文献4 :美国国家科学院院刊(Proceedings ofthe NationalAcademy ofSciences of the United States of America), 2010,107 :40-45.

发明内容
发明所要解决的技术问题本发明的主要目的在于，提供一种肿瘤形成可能性低并确保高诱导效率的诱导性多能干细胞的制备方法。本发明的目的还在于，提供用于实施所述诱导性多能干细胞的制备方法的诱导性多能干细胞的诱导剂及诱导性多能干细胞制备试剂盒；以及能够制备诱导性多能干细胞的诱导因子的筛选方法。解决技术问题所需的方法本发明人为解决上述技术问题进行了深入研究，令人惊讶地发现了通过向细胞中导入作为核重编程因子的微RNA，能够不通过基因插入而制备诱导性多能干细胞，所述微RNA促进从NANOG基因、S0X2基因、0CT3/4基因、KLF4基因、LIN28基因及c_MYC基因组成的组中选择的至少一种基因的表达。更令人惊讶的是，该制备方法不仅不用插入基因，还可知能够以高诱导效率制备肿瘤形成可能性低的诱导性多能干细胞。本发明是在这样的认知基础之上进一步进行研究而完成的。S卩，本发明包括以下方面的发明。项I. 一种诱导性多能干细胞的制备方法，其包含向体细胞中导入核重编程因子的步骤，所述核重编程因子为促进从NANOG基因、S0X2基因、0CT3/4基因、KLF4基因、LIN28基因及c-MYC基因组成的组中选择的至少一种基因的表达的核酸。项2.根据项I所述的制备方法，所述核酸为微RNA。项3.根据项2所述的制备方法，所述微RNA是从抑制分化的微RNA、促进未分化诱导的微RNA、控制细胞间粘附的微RNA及抑制细胞凋亡的微RNA组成的组中选择的至少一种。项4.根据项2或3所述的制备方法，所述微RNA为miR-200、miR_302及miR-369。项5. —种诱导性多能干细胞，其是根据项Γ4中任意一项所述的方法制备的。项6. —种诱导性多能干细胞的诱导剂，其含有促进从NANOG基因、S0X2基因、0CT3/4基因、KLF4基因、LIN28基因及c_MYC基因组成的组中选择的至少一种基因的表达的核酸。项7. —种诱导性多能干细胞制备试剂盒，其含有促进从NANOG基因、S0X2基因、0CT3/4基因、KLF4基因、LIN28基因及c_MYC基因组成的组中选择的至少一种基因的表达的核酸。项8. —种能够制备诱导性多能干细胞的核酸的筛选方法，其包括下述步骤(I)向体细胞中导入待测核酸的步骤；(2)培养步骤(I)中的导入了待测核酸的细胞的步骤 '及(3)在步骤(2)中培养的细胞中，诱导性多能干细胞被诱导的情况下，选择该待测核酸作为能够制备诱导性多能干细胞的核酸的步骤。项9.根据项8所述的筛选方法，通过对从NANOG基因、S0X2基因、0CT3/4基因、KLF4基因、LIN28基因及c_MYC基因组成的组中选择的至少一种基因表达的促进，来对诱导性多能干细胞被诱导进行检测。项10.根据项8或9所述的筛选方法，其中所述核酸为微RNA。发明效果现有为了制备诱导性多能干细胞需要向体细胞中导入含有原癌基因的基因，但根据本发明，通过向细胞中导入促进从NANOG基因、S0X2基因、0CT3/4基因、KLF4基因、LIN28基因及c-MYC基因组成的组中选择的至少一种基因的表达的核酸，不进行基因的导入，可制备肿瘤形成可能性低的诱导性多能干细胞。进而，具有这些优点的同时，能够以高诱导效率制备诱导性多能干细胞。根据本发明制备的诱导性多能干细胞例如可以制成用于人工制 备皮肤、肌肉及神经等组织或器官的材料等，可以用作再生医疗中的有用的工具。


图I是通过本发明方法，使用小鼠脂肪干细胞制备的诱导性多能干细胞(实施例
1)。上图为相位差图像，下图为Nanog-GFP(胚胎干细胞关键蛋白-绿色荧光蛋白)的荧光图像。比例尺表示100 μ m。图2是通过本发明方法，使用小鼠脂肪干细胞制备的诱导性多能干细胞(实施例
2)。上图为相位差图像,下图为Nanog-GFP的突光图像。比例尺表示100μ m。图3是通过免疫染色法检测出的，通过本发明方法使用小鼠脂肪干细胞制备的诱导性多能干细胞中SSEAl抗原的表达(实施例4)。上图为相位差图像，下图为荧光图像。比例尺表示100 μ m。图4是通过免疫染色法检测出的，通过本发明方法使用小鼠脂肪干细胞制备的诱导性多能干细胞中小鼠0ct3/4蛋白质的表达(实施例4)。上图为相位差图像，下图为荧光图像。比例尺表示100 μ m。图5是将通过本发明方法使用小鼠脂肪干细胞(ADSC)制备的诱导性多能干细胞中小鼠Nanog基因及小鼠0ct3/4基因的表达量与未导入微RNA的对照小鼠脂肪干细胞相比较(实施例5)。将用小鼠Gadph基因的表达量使小鼠Nanog基因及小鼠0ct3/4基因的表达量标准化后的，相对于小鼠ES细胞中的小鼠Nanog基因及小鼠0ct3/4基因的相对比显示于图表中(n=3)。图6是表示未处理的人皮肤成纤维细胞细胞的相位差图像(上图)及通过本发明方法使用人皮肤成纤维细胞细胞制备的诱导性多能干细胞的相位差图像(下图)(实施例7)。比例尺表示100 μ m。
具体实施例方式本发明主要目的是提供一种诱导性多能干细胞的制备方法、诱导性多能干细胞的诱导剂、制备诱导性多能干细胞制备试剂盒及能够制备诱导性多能干细胞的筛选方法。下面依次对制备方法、诱导剂、试剂盒、筛选方法进行说明。而且，本发明中所述的诱导性多能干细胞是指源自体细胞的细胞，其通过导入重编程体细胞的多能性诱导因子(核重编程因子)，而达到具备分化多能性及自我增殖能力。I.诱导性多能干细胞的制备方法
技术领域：
本发明的诱导性多能干细胞的制备方法，其包含在体细胞中导入核重编程因子的步骤，其特征在于，所述核重编程因子是促进从NANOG基因、S0X2基因、0CT3/4基因、KLF4基因、LIN28基因及c-MYC基因组成的组中选择的至少一种基因的表达的核酸。下面对本发明的制备方法进行详细描述。本发明中，由体细胞制备诱导性多能干细胞。关于体细胞，在正常细胞和肿瘤(癌)细胞中优选为正常细胞。对于细胞的种类并无特别的限制，可以使用任何体细胞。作为本发明中所使用的体细胞，例举如成纤维细胞、上皮细胞、肌细胞(例如骨骼肌细胞或内脏肌细胞)、肝细胞、骨细胞、血管内皮细胞、脑神经细胞、神经胶质(少突胶质细胞、星形胶质细胞)、包括脑神经或神经胶质或癌细胞的各种源自细胞的初级球体、二级球体、三级球体、以下多级球体、源自外周血或骨髓的单核细胞、颗粒细胞、淋巴细胞、成骨细胞、破骨细胞、胃上皮细胞、肝脏上皮细胞、大小肠道上皮细胞、胰脏细胞(α细胞及β细胞等的内分泌细胞及外分泌细胞)、脂肪干细胞(ADSC)等。从通过导入核酸来有效地促进NANOG基因、S0X2基 因、0CT3/4基因、KLF4基因、LIN28基因及c_MYC基因组成的组中选择的至少一种基因的表达的观点来看，在这些体细胞中可例举优选为成纤维细胞、脂肪干细胞，更优选为脂肪干细胞。此外，从得到体细胞的容易度的观点来看，例举优选为成纤维细胞、脂肪干细胞。上述体细胞可以根据诱导干细胞的使用目的等，从源自人、小鼠、大鼠、仓鼠、兔、猫、狗、绵羊、猪、牛、山羊、猴等哺乳动物的细胞中进行适当地选择，但是在将制成的诱导性多能干细胞用作人体再生医疗中的工具或诊断用药的开发工具的情况下，适宜为源自人体的细胞。此外，使用源自人体的体细胞的情况下，可以使用源自胎儿、幼儿、小儿及成人的任意来源的细胞。关于上述体细胞，即可使用从来源动物中提取的细胞，此外也可以使用市售的产品。此外，使用从来源动物中提取的细胞及市售品的体细胞的任意一种的情况下，也可以使用通过公知方法使得到的体细胞增殖了的细胞。在制备以向人类患者移植为目的的诱导性多能干细胞的情况下，也可以使用源自患者本人或源自他人的任意体细胞。使用源自患者本人的体细胞制备诱导性多能干细胞，适合用于制备对患者不产生免疫排斥反应的诱导性多能干细胞。使用源自他人的体细胞制备诱导性多能干细胞，适合用于制备不具备患者所拥有的遗传性疾病的诱导性多能干细胞。本发明中的核重编程因子的核酸只要是所述体细胞内存在的、促进从NANOG基因、S0X2基因、0CT3/4基因、KLF4基因、LIN28基因及c_MYC基因组成的组中选择的至少一种基因的表达的核酸，可包括DNA及RNA等，并无特别的限定。作为上述核酸的具体实例，例举有低分子量RNA或可以表达该低分子量RNA的DNA，该低分子量RNA具有约18 120个碱基，优选为约18 80个碱基左右，更优选为约18 26个碱基左右。上述核酸特别优选为所述的低分子量RNA。作为上述低分子量RNA的具体实例，可例举微RNA (miRNA)及siRNA等非编码RNA，但并不限于此。优选低分子量RNA为微RNA。此外，能够表达上述低分子量RNA的DNA优选为插入了与上述低分子量RNA相当的序列的公知的表达载体DNA。而且，微RNA主要为动物细胞所具有的单链RNA，可认为具有抑制特定靶基因或靶基因组表达的功能。可认为，微RNA是经过作为直接转录产物的Pri-miRNA (初始miRNA, Primary miRNA)及处理 Pri-miRNA 后产生的 PreiiRNA (前体 miRNA),进一步处理Pre-miRNA而产生的成熟(mature)的微RNA。PreniRNA具有约60 80个碱基左右的碱基长度，成熟的微RNA具有约18 26个碱基左右的碱基长度。本发明的核酸为微RNA的情况下，微RNA可以使用作为前体的Pri-miRNA或Pre_miRNA或成熟的微RNA中的任意一种。微RNA优选为Pre-miRNA或成熟的微RNA，进一步优选为成熟的微RNA。另一方面，siRNA (小干扰RNA)为由约2广23个碱基对构成的双链RNA。可认为siRNA会引起所谓的RNA干扰(RNAinterference),即通过破坏祀mRNA,抑制该mRNA编码的基因表达的现象。本发明中，通过向体细胞中导入促进从NANOG基因、S0X2基因、0CT3/4基因、KLF4基因、LIN28基因及c-MYC基因组成的组中选择的至少一种基因的表达的核酸，可以制备诱导性多能干细胞。本发明的核酸只要促进从NANOG基因、S0X2基因、0CT3/4基因、KLF4基因、LIN28基因及c-MYC基因组成的组中选择的至少一种基因的表达，则无特别的限定。上述核酸优选促进NANOG基因和/或0CT3/4基因表达的核酸，更优选促进NANOG基因表达的
核酸。此外，希望上述基因存在于体细胞内。关于上述基因，已知有下述情况。NANOG基因编码具有同源域的转录因子，在哺乳类生长时通过生殖系细胞进行特异性表达，被认为在生殖系细胞自我复制能力及维持多能性上起到了重要的作用。S0X2 (SRY (Y性别决定区，sex determining region Y)_box2)基因编码具有HMG盒的转录因子。0CT3/4(别名P0U5F1)基因编码具有POU型的同源域的转录因子，已知在哺乳类生长时，在生殖系细胞中进行特异性表达。S0X2转录因子和0CT3/4转录因子能够形成二聚体，可认为协调并对抑制生殖类细胞的分化诱导做出了贡献。KLF4(转录因子4 (Kruppel-Like Factor 4))基因编码与果蚬的Kruppel基因所编码的转录因子具有同源性的转录因子，已知KLF4转录因子通过控制细胞周期相关因子而具有控制细胞分化的功能。LIN28基因为与秀丽线虫(线虫C. elegans)的lin_28基因同源的基因，被认为其编码用于维持干细胞多能性而发挥重要作用的RNA结合蛋白质。C-MYC基因编码具有bHLH结构(bHLH motif )及亮氨酸拉链结构的转录因子，c-MYC转录因子被认为与广泛的基因表达有关。此外，已知c-MYC基因为通过变异成为癌基因的原癌基因。作为制备诱导性多能干细胞的技术，已公开了在小鼠中向体细胞导入0CT3/4基因、Sox2基因、c-Myc基因及Klf4基因，以及在人类中向体细胞导入NANOG基因、0CT3/4基因、S0X2基因及LIN28基因的方法(专利文献I、非专利文献I)。即，上述基因被认为是为了使细胞具备自我复制能力和/或多能性而发挥了重要作用的基因。特别是，由生殖系细胞特异性表达的NANOG基因及0CT3/4基因，被认为在细胞获得自我复制能力及多能性中起到了极为重要的作用。本发明的核酸只要满足上述条件，则即可单独使用一种核酸，此外也可以将两种以上组合使用。此外，本发明的核酸也可以为例如RNA和DNA之类的不同种类核酸的组合，或微RNA及siRNA的组合之类的不同种类的RNA的组合等。从能有效地促进从NANOG基因、S0X2基因、0CT3/4基因、KLF4基因、LIN28基因及c_MYC基因组成的组中选择的至少一种基因的表达，优选促进NANOG基因和/或0CT3/4基因的表达，更优选促进NANOG基因的表达的观点来看，优选将两种以上的核酸组合使用。此外，又如从达到高多能性诱导效率的观点来看，为了不降低组合中所包含的各核酸的效果，优选将10种以下的核酸组合使用，更优选将7种以下的核酸组合使用。此外，本发明的核酸为微RNA或能够表达微RNA的DNA的情况下，虽无特别的限定，但是，实质上可以将为了制备诱导性多能干细胞而被导入细胞中的核重编程因子仅作为该微RNA，或仅作为表达该微RNA的DNA。即，本发明的制备方法可以作为以下的制备方法，即包括向体细胞中导入上述微RNA或能够表达该微RNA的DNA的步骤，并且，实质上不向体细胞中导入除了该微RNA或能够表达微RNA的DNA以外的重编程因子(例如，能够通过单独或组合使用除了微RNA或能够表达微RNA的DNA以外的核酸、蛋白质等来制备诱导性多能干细胞的化合物)。在此，“实质上不向体细胞中导入”是指不向体细胞中导入可实现体细胞重编程效果程度的量。本发明的核酸为微RNA的情况下，本领域技术人员可以通过公知方法等，适当地选择促进从NANOG基因、S0X2基因、0CT3/4基因、KLF4基因、LIN28基因及c_MYC基因组成的组中选择的至少一种基因的表达，优选促 进NANOG基因和/或0CT3/4基因的表达，更优选促进NANOG基因的表达的微RNA。本发明的核酸为能够表达微RNA的DNA的情况时也与
上述一样。作为上述微RNA,优选使用在从ES细胞等未分化细胞及通常已知获得分化多能性及自我复制能力的癌细胞中选择的至少一种细胞中表达的微RNA，更优选使用在该细胞中与通常分化完成的细胞相比表达量变动(促进或减少，尤其优选促进)的微RNA。虽然未特别限定未分化细胞的种类，但是优选人类或小鼠的ES细胞。虽然未特别限定癌细胞的种类，但是可例举如结肠直肠癌细胞、大肠癌细胞、食道癌细胞、胃癌细胞、胰脏癌细胞、肝癌细胞、胆管癌细胞等。从上述观点来看，作为促进NANOG基因、S0X2基因、0CT3/4基因、KLF4基因、LIN28基因及c-MYC基因组成的组中选择的至少一种基因的表达，优选促进NANOG基因和/或0CT3/4基因的表达，更优选促进NANOG基因的表达的微RNA，可例举如miR-17、miR-21、miR-154、miR-200、miR-294、miR-302、miR-367、miR-369、miR-370、miR-371、miR-372、miR-373、miR-374、miR-376 (别名miR_368)及 miR-424 中选择的至少一种，优选miR-17、miR-154、miR-200、miR-294、miR-302、miR-367、miR-369 及 miR-370 中选择的至少一种。此外，从多能性干细胞具有分化多能性及自我增殖能力的观点来看，促进从NANOG基因、S0X2基因、0CT3/4基因、KLF4基因、LIN28基因及c_MYC基因组成的组中选择的至少一种基因的表达，优选促进NANOG基因和/或0CT3/4基因的表达，更优选促进NANOG基因的表达的微RNA为，选自A组抑制分化的微RNA ；B组促进未分化诱导的微RNA ；C组控制细胞间粘附的微RNA ;及D组抑制细胞凋亡的微RNA中的至少一种，优选为从上述A组、B组及C组，或A组、B组及D组中选择的至少一种，尤其优选为上述A组、B组及C组，或A组、B组及D组的组合构成的微RNA，但并不限于这些。可认为将上述A组的微RNA导入体细胞，通过抑制促进分化等，可更加活化导入了该微RNA的体细胞的分化多能性。可认为将上述B组的微RNA导入体细胞，通过促进未分化状态，导入了该微RNA的体细胞可更加活化体细胞的分化多能性。可认为将上述C组的微RNA导入体细胞,通过解除接触抑制(contact inhibition)等，可更加活化导入了该微RNA的体细胞的自我增值能力。可认为将上述D组的微RNA导入体细胞，导入了该微RNA的体细胞通过细胞凋亡抑制细胞死亡，相对提高了细胞的存活性，更加活化体细胞的自我增殖能力。即，可认为通过更加活化上述A组、B组、C组及D组的微RNA所具有的体细胞的分化多能性和/或自我增值能力的功能，可实现对从NANOG基因、S0X2基因、0CT3/4基因、KLF4基因、LIN28基因及c_MYC基因组成的组中选择的至少一种基因，优选NANOG基因和/或0CT3/4基因，更优选NANOG基因表达的促进。本领域技术人员可以适当地选择上述A组、B组、C组及D组的具体的微RNA。下面列举了各组的具体实例，但是均不限于所列举的特定微RNA A 组miR-294、miR-302、miR-367、miR-369、miR-370、miR-371、miR-372、miR-373、miR-374、miR-376 (别名miR_368)、miR-424 等；B 组miR_17、miR-369 等；C 组miR_200 等；及D 组miR_17、miR-21 等。 作为具体的微RNA的组合作为含有A 组、B 组及 D 组的微 RNA，可例举 miR-302、miR-367、miR-369、miR-370、miR-17、miR-21 及 miR-154 的组合；及作为由A组、B组及C组的组合构成的微RNA，可例举miR-302、miR_369及miR-200的组合或miR-294、miR-302、miR-369及miR-200的组合等，但是并不限于这些。上述微RNA在包括人类的哺乳动物中共通存在，可以使用源自任意哺乳动物的微RNA，但是希望根据导入体细胞的来源进行适当地选择。例如，作为体细胞若使用源自人的体细胞的情况下，希望导入体细胞的微RNA源自人。在英国曼彻斯特大学生命科学学院(Faculty of Life Sciences attheUniversity of Manchester)维护及运营的miRBase数据库中公开了上述微RNA的Pre-miRNA及成熟的微RNA的碱基序列,其为公知的碱基序列(URL http://www. mirbase.org/)。而且,关于miRBase,记载在非专利文献2等中。下面,举例说明上述微RNA的登录号。Pre-miRNAmiR-17 :has_miR-17(人，miRBase 登录号MI0000071)、mmu_miR-17(小鼠，miRBase登录号MI0000687)；miR-21 :has_miR-21(人，miRBase 登录号MI0000077)、mmu_miR-21(小鼠，miRBase登录号MI0000569)；miR-154 :has_miR-154 (人，miRBase 登录号MI0000480)、mmu-miR-154 (小鼠，miRBase 登录号MI0000176)；miR-200 :has_miR-200a (人，miRBase 登录号MI0000737)、mmu-miR-200a (小鼠，miRBase 登录号:MI0000554)、has_miR-200b (人，miRBase 登录号MI0000342)、_-miR-200b (小鼠，miRBase 登录号MI0000243)、has_miR-200c (人，miRBase 登录号MI0000650)、_-miR-200c (小鼠，miRBase 登录号MI0000694) ；miR-294 mmu-miR-294(小鼠，miRBase 登录号MI0000392) ；miR-302 has-miR-302a (人，miRBase 登录号MI0000738)、mmu-miR-302a(小鼠，miRBase 登录号MI0000402)、has-miR-302b(人，miRBase登录号MI0000772)、_-miR-302b (小鼠，miRBase 登录号MI0003716)、has_miR-302c(人，miRBase 登录号MI0000773)、_-miR-302c (小鼠，miRBase 登录号MI0003717)、has-miR-302d (人，miRBase 登录号:MI0000774)、_-miR-302d (小鼠，miRBase 登录号MI0003718)、has-miR-302e (人，miRBase 登录号MI0006417)、has-miR-302f (人，miRBase 登录号MI0006418)；miR-367 :has_miR-367 (人，miRBase 登录号:MI0000775)、mmu-miR-367 (小鼠， miRBase 登录号MI0003531)；miR-369 :has_miR-369 (人，miRBase 登录号:MI0000777)、mmu-miR-369 (小鼠， miRBase 登录号MI0003535)；miR-370 :has_miR-370 (人，miRBase 登录号MI0000778)、mmu-miR-370 (小鼠， miRBase 登录号MI0001165)；miR-371 :has_miR-371 (人，miRBase 登录号MI0000779)；miR-372 :has_miR-372 (人，miRBase 登录号MI0000780)；miR-373 :has-miR-373 (人类，miRBase 登录号MI0000781) ;miR_374 : has-miR-374a (人，miRBase 登录号:MI0000782)、mmu_374b (人，miRBase 登录号 MI0005566)、mmu-miR-374(小鼠，miRBase 登录号MI0004125)；miR-376 (别名miR_368) :has_miR-376c (人，miRBase 登录号MI0000776)、 mmu-miR-376c (小鼠，miRBase 登录号MI0003533)；miR-424 :has_miR-424 (人，miRBase 登录号MI0001446)。成熟的 miRNAmiR-17 :has_miR-17 (人，miRBase 登录号MIMAT0000070)、mmu-miR-17 (小鼠， miRBase 登录号 MIMAT0000649)；miR-21 :has_miR-21 (人，miRBase 登录号MIMAT0000076)、mmu-miR-21 (小鼠， miRBase 登录号MIMAT0000530)；miR-154 :has_miR-154 (人，miRBase 登录号MIMAT0000452)、mmu-miR-154 (小鼠， miRBase 登录号MIMAT0000164)；miR-200 :has_miR-200a (人，miRBase 登录号MIMAT0000682)、mmu-miR-200a (小 鼠，miRBase 登录号MIMAT0000519)、has-miR-200b (人，miRBase 登录号MIMAT0000318)、 mmu-miR-200b (小鼠，miRBase 登录号MIMAT0000233)、has-miR-200c (人，miRBase 登录 号MIMAT0000617)、mmu-miR-200c (小鼠，miRBase 登录号MIMAT0000657)；miR-294 mmu-miR-294 (小鼠，miRBase 登录号MIMAT0000372) ；miR-302 has-miR-302a (人，miRBase 登录号MIMAT0000684)、mmu-miR-302a (小鼠，miRBase 登录 号MIMAT0000380)、has-miR-302b (人，miRBase 登录号MIMAT0000715)、mmu-miR-302b (小 鼠，miRBase 登录号MIMAT0003374)、has-miR-302c (人，miRBase 登录号MIMAT0000717)、 mmu-miR-302c (小鼠，miRBase 登录号MIMAT0003376)、has_miR-302d (人，miRBase 登录 号MIMAT0000718)、mmu-miR-302d (小鼠，miRBase 登录号MIMAT0003377)、has_miR-302e (人，miRBase 登录号MIMAT0005931 )、has_miR-302f (人，miRBase 登录号MIMAT0005932)；miR-367 :has_miR-367 (人，miRBase 登录号MIMAT0000719),mmu-miR-367 (小鼠， miRBase 登录号MIMAT0003181)；miR-369 :has-miR-369_3p (人，miRBase 登录号MIMAT0000721 )、has-miR-369_5p (人，miRBase 登录号MIMAT0001621)、mmu-miR-369-3p (小鼠，miRBase 登录号 MIMAT0003186)、mmu-miR-369-5p (小鼠，miRBase 登录号MIMAT0003185)；
miR-370 :has_miR-370 (人，miRBase 登录号MIMAT0000722)、mmu-miR-370 (小鼠，miRBase 登录号MIMAT0001095)；miR-371 :has-miR-371_3p (人，miRBase 登录号MIMAT0000723)、has-miR-371-5p(人，miRBase 登录号MIMAT0004687)；miR-372 :has_miR-372 (人，miRBase 登录号MIMAT0000724)；miR-373 :has_miR-373 (人，miRBase 登录号MIMAT0000726)；miR-374 :has_miR-374a (人，miRBase 登录号MIMAT0000727)、mmu_374b (人，miRBase 登录号MIMAT0004955)、mmu-miR-374,(小鼠，miRBase 登录号MIMAT0003727)；
miR-376 (别名miR_368) :hsa_miR-376c (人，miRBase 登录号MIMAT0000720)、mmu-miR-376c (小鼠，miRBase 登录号MIMAT0003183)；miR-424 :has_miR-424 (人，miRBase 登录号MIMAT0001341 )。关于上述微RNA，关于已知多个Pre-miRNA或成熟的微RNA序列的微RNA (例如，miR-200、miR-302、miR-369、miR-371、miR-374 等)，只要满足对从 NANOG 基因、S0X2 基因、0CT3/4基因、KLF4基因、LIN28基因及c_MYC基因组成的组中选择的至少一种基因，优选NANOG基因和/或0CT3/4基因，更优选NANOG基因的表达的促进功能，则可以使用从该多个序列组成的组中选择的一种或一种以上序列的微RNA。例如，关于miR-200优选使用 miR-200c，但是并不限于此。关于 miR-302，优选使用 miR_302a、miR_302b、miR-302c及miR-302d的组合，但并不限于此。关于miR-369，优选单独使用miR-369_5p，或者miR-369-3p与miR-369_5p的组合，但不限于此。此外，除了野生型微RNA以外，上述微RNA在具有与野生型微RNA同等或同等以上的抑制革G基因或基因组表达的功能的范围内，也可以为其喊基序列中的一个或多个喊基(例如f 10个，优选f 6个，进一步优选f 4个，更优选f 3个，特别优选I或2个)被取代、缺失和/或插入的变异型微RNA。本发明的核酸可以通过普通方法制备。例如，基于公知的序列信息，能够通过化学合成或酶反应合成上述核酸。核酸为DNA的情况下，可以使用公知的重组DNA方法。或者，特别是核酸为微RNA的情况下，可以通过从任意哺乳动物细胞中提取上述核酸来制备。核酸为低分子量RNA的情况下，从容易控制制备的观点来看，优选通过化学合成来制备。可以通过公知方法向体细胞导入上述核酸。具体地，作为将上述核酸导入体细胞的方法，可以例举脂质转染法、微注射法、基因枪等。其中，从导入效率的观点及导入处理后的细胞恢复效率的观点来看，优选脂质转染法。在实施脂质转染法时使用的转染试剂只要在可以实施脂质转染法的范围内则无特别限定。作为转染试剂的具体实例，适宜为阳离子性转染试剂的脂质体转染试剂(Lipofectamine Reagent)(英杰生命技术公司，Invitrogen公司)及脂质体20000转染试剂(Lipofectamine2000Reagent)(英杰生命技术公司)等,但并不限于此。本领域技术人员能够适当地设定向体细胞中投入的上述核酸的投入量。例如通过脂质转染法将上述低分子量RNA导入体细胞的情况下，可以将上述低分子量RNA(将多种低分子量RNA导入体细胞的情况下为各低分子量RNA)在含有上述转染试剂的溶液中稀释到约1(Γ50ρΜ左右，优选为约2(Γ40ρΜ左右，更优选为约25 35ρΜ左右，特别优选为约30ρΜ左右，进行脂质转染。
将以这种方式被导入上述核酸的体细胞继续培养7 35天左右，优选14 35天左右，将体细胞重编程，制备诱导性多能干细胞。关于具体的培养期间、气氛及培养基等各种培养条件，只要该体细胞为可繁殖并且可制备诱导性多能干细胞，本领域技术人员可以在无特别限制的范围内适当地选择。例如，导入核酸后O. 5 2天左右，甚至根据需要为疒5天左右，可以用含有FBS (Fetal Bovine Serum,胎牛血清)的D-MEM培养基(Dulbecco’ sModified Eagle Medium，达尔伯克氏改良伊格尔培养基)培养。之后，可在公知的ES细胞培养环境下进行培养。作为公知的ES细胞培养环境，可例举向含有FBS的D-MEM中加入添加物的培养基，当并不限于此。作为上述添加物，可以根据需要，从NEAA (Non-EssentialAmino Acids，非必需氨基酸)、L-谷氨酰胺、2-巯基乙醇、LIF (白血病抑制因子)等中选择一种或一种以上，但不限于此。此外，根据需要，ES细胞培养环境可提供饲养细胞。作为可使用的饲养细胞，可例举如小鼠的胚胎成纤维细胞(MEF)等，但不限于此。根据需要，可以从导入上述核酸的体细胞中选择被诱导为诱导性多能干细胞的细胞。这样的诱导性多能干细胞的选择，例如，可以以特定的标记基因有无表达或表达量的增减作为指标，或细胞的形态变化作为指标进行。以特定的标记基因有无表达或表达量的增减作为指标的情况下，作为标记基因，可以使用如NANOG基因、S0X2基因、0CT3/4基因、KLF4基因、LIN28基因或c_MYC基因等已知在未分化细胞中表达的基因，优选NANOG基因或0CT3/4基因，更优选NANOG基因。将上述基因用作标记基因的情况下，例如可以以基因表达或促进表达量作为选择诱导性多能干细胞的指标。作为检测标记基因有无表达或表达量增减的方法，可以使用公知的方法。可例举如，通过定量实时RT-PCR或RNA印迹法(Northernblot)分析检测标记基因mRNA的表达、通过在标记基因的启动子上结合了报告基因(例如，绿色荧光蛋白质(GFP)及其变体等荧光蛋白质)的构造(例如，插入细胞基因组中的构造，或细胞用质粒保持的构造等)检测标记基因的启动子活性，及通过免疫细胞化学检测标记基因的基因产物的表达，但不限于此。从操作简易度的观点来看，适宜使用在标记基因的启动子上结合荧光蛋白质的构造。例如，使用非专利文献3中公开的Nanog启动子-GFP基因的报告构造使用了插入到基因组中的Nanog-GFP，从小鼠提取到的体细胞的情况下，可以以促进GFP表达作为选择诱导性多能干细胞的指标。或者，标记基因的基因产物为细胞膜表面分子的情况下，通过使用公知的细胞 分选仪方法，以该细胞膜表面分子有无表达或表达量的增减作为指标，可以通过分选选择诱导性多能干细胞。以细胞的形态变化作为选择诱导性多能干细胞的指标时，成为指标的形态变化只要可选择则无特别的限制。例如，可以以在培养具有多能性的ES细胞等时形成球状细胞块的拟胚体(embryoid body)作为指标。拟胚体等细胞形态变化的指标可以通过例如公知方法，用显微镜观察在视觉上识别。此外，根据需要，可以评价上述选择好的细胞具备作为多能干细胞的特质。评价方法可以使用在公知的ES细胞建立方法中所适用的确认方法。具体可例举检测干细胞标记、评价分化能力、评价自我复制能力，但不限于此。该评价方法也可以作为上述的，选择被诱导为诱导性多能干细胞的方法。检测的干细胞标记可例举碱性磷酸酶活性、SSEAl (阶段特异性胚胎抗原1，Stage-Specific Embryonic Antigen-1)抗原，以及 NANOG, S0X2、0CT3/4、KLF4、LIN28 及c-MYC等基因或该基因编码的蛋白质的表达等，但不限于此。具体的检测方法是公知的，但是，优选例如通过免疫细胞化学的检测。作为评价分化能力的方法，可例举如，在培养上述细胞时向培养基中添加分化诱导因子，检测实现向目标细胞种类分化的细胞，或将上述细胞移植到来源动物体内(例如皮下)，观察畸形瘤(畸胎瘤)的形成，但不限于此。或者，将上述细胞移植到来源动物的胚泡，验证具有源自上述细胞的细胞的嵌合体后代的诞生，进而优选能够验证通过与该嵌合体生物交配诞生具有源自上述细胞的细胞 的后代。关于自我复制能力的评价，例如可以以继代培养上述细胞后，细胞增殖及增殖后的细胞所具有的特质不因继代培养而产生变化作为指标，但不限于此。此外，可以评价上述细胞的肿瘤形成率。评价肿瘤形成率的方法可以使用公知方法，但是，例如，可以将动物体内上述细胞移植到来源动物的体内(例如皮下)，评估有无肿瘤形成。2.诱导性多能干细胞的诱导剂及诱导性多能干细胞制备试剂盒如上所述，在含有导入核重编程因子步骤的诱导性多能干细胞的制备方法中，通过将核酸作为核重编程因子导入体细胞，可以制备诱导性多能干细胞，所述核酸促进从NANOG基因、S0X2基因、0CT3/4基因、KLF4基因、LIN28基因及c_MYC基因组成的组中选择的至少一种基因，优选NANOG基因和/或0CT3/4基因，更优选NANOG基因的表达。因此，本发明也提供含有上述核酸的诱导性多能干细胞的诱导剂及用于制备该诱导剂的上述核酸的使用。本发明的诱导剂包括上述“I.诱导性多能干细胞的制备方法”栏的核酸。其详细内容如上述“I.诱导性多能干细胞的制备方法”栏所记载。上述诱导剂被导入体细胞。上述诱导剂向体细胞的导入可以通过公知方法进行。具体地，作为将上述诱导剂导入体细胞的方法，可例举脂质转染法、微注射法、基因枪等。其中，从导入效率的观点及导入处理后细胞的恢复效率的观点来看，优选脂质转染法。在实施脂质转染法时所使用的转染试剂只要在可实施脂质转染法的范围内则无特别的限制。作为转染试剂的具体实例，适宜为阳离子性转染试剂的脂质体转染试剂(LipofectamineReagent)(英杰生命技术公司)及脂质体2000转染试剂(Lipofectamine2000Reagent)(英杰生命技术公司)等，但是不限于此。作为上述诱导剂的具体的提供形态，可例举上述核酸的干燥粉末状或丸状的固体，或该核酸的溶液，但不限于此。诱导剂在不损害促进NANOG基因、S0X2基因、0CT3/4基因、KLF4基因、LIN28基因及c_MYC基因组成的组中选择的至少一种基因的表达，优选促进NANOG基因和/或0CT3/4基因的表达，更优选促进NANOG基因的表达的功能限度内，可以含有其他成分。此外，诱导剂为上述核酸的溶液的情况下，溶剂在不损害诱导剂功能的限度内无特别的限制，但是可例举如水、缓冲液(例如含有tris/EDTA的缓冲液)、生理盐水等。进而，本发明还提供含有下述核酸的诱导性多能干细胞制备试剂盒，所述核酸可促进从NANOG基因、S0X2基因、0CT3/4基因、KLF4基因、LIN28基因及c_MYC基因组成的组中选择的至少一种基因的表达，优选促进NANOG基因和/或0CT3/4基因的表达，更优选促进NANOG基因的表达。本发明的试剂盒含有上述诱导剂。此外，本发明的试剂盒中，除上述诱导剂以外，根据需要也可以包含其他成分。其他成分也可以是在制备诱导性多能干细胞中所必需的试剂或器具。具体可例举用于将核酸导入细胞的试剂或器具(例如转染试剂)、用于选择诱导性多能干细胞的试剂(例如抗体)或器具(例如载玻片、盖玻片)、用于细胞培养的试剂(例如液体培养基)或器具(例如培养皿)，或阳性对照试样及阴性对照试样等，但不限于此。进而，也可以包含记载了用于进行本发明的诱导性多能干细胞的制备方法的操作顺序的说明书。本发明的试剂盒，可根据常规方法，能够通过具有上述成分而制成。3.筛诜方法而且，本发明还提供包括下述步骤的、可制备诱导性多能干细胞的低分子量RNA的筛选方法(I)向体细胞中导入待测核酸的步骤；
·
(2)培养步骤(I)的导入了待测核酸的细胞的步骤 '及(3)在步骤(2)培养的细胞中，诱导性多能干细胞被诱导的情况下，选择该待测低分子量RNA作为可制备诱导性多能干细胞的核酸的步骤。下面对各步骤进行详细说明。首先，步骤(I)为将待测核酸导入体细胞中，得到导入了待测核酸的体细胞的步骤。上述体细胞只要能实现筛选方法则无特别的限定，但是可以使用上述“I.诱导性多能干细胞的制备方法”栏中例举的体细胞。成为筛选对象的上述待测核酸只要能实现筛选方法则可包含DNA及RNA等，并无特别的限定。上述待测核酸优选调整所述体细胞内存在的基因表达的核酸。更优选的是，上述待测核酸为约18 120个碱基、优选约18 80个碱基左右，进一步优选约18 26个碱基左右的低分子量RNA，或能够表达该低分子量RNA的DNA。特别优选上述待测核酸为所述低分子量RNA。作为上述低分子量RNA的具体实例，可例举微RNA (miRNA)及siRNA等非编码RNA,但不限于此。优选低分子量RNA为微RNA。此外，能够表达上述低分子量RNA的DNA优选为插入与上述低分子量RNA相当的序列的公知的表达载体DNA。待测核酸为微RNA的情况下，可使用源自任意哺乳动物的RNA，但是，希望根据导入的体细胞的来源进行适当的选择。例如使用源自人的细胞作为体细胞的情况下，希望待测微RNA源自人。上述待测微RNA为，例如从ES细胞等未分化细胞及通常已知获得分化多能性及自我复制能力的癌细胞中选择的至少一种细胞中表达的微RNA。这种微RNA的具体实例例举在上述“I.诱导性多能干细胞的制备方法”栏中，但不限定于此。此外，上述待测微RNA除了野生型微RNA以外，也可为，与野生型微RNA的碱基序列中的一个或多个(例如广10个，优选Γ6个，进一步优选Γ4个，更优选Γ3个，特别优选I个或2个)碱基被取代、缺失和/或插入的变异型微RNA。上述待测核酸可以通过上述“I.诱导性多能干细胞的制备方法”栏中例举的方法得到，但不限于此。上述待测核酸可以单独一种或两种以上组合导入体细胞中。从使用多个筛选对象的待测核酸，有效地进行筛选的观点来看，优选使用两种以上的核酸组合，进一步优选为4种以上，更优选为6种以上。从不降低组合中所包含的各个核酸的效果的观点来看，优选向体细胞中导入10种以下的核酸的组合，更优选7种以下核酸的组合。将待测核酸导入上述体细胞的步骤中的、将待测核酸导入体细胞的具体方法，只要能实现筛选方法则并无特别的限定，但是可以使用上述“I.诱导性多能干细胞的制备方法”栏中例举的方法。然后，步骤(2)为培养步骤(I)的导入了待测核酸的细胞的步骤。培养上述细胞的方法在实现筛选方法的范围内无特别的限制，但是可以使用例如上述“I.诱导性多能干细胞的制备方法”栏内例举的方法。然后，步骤(3)为，在步骤(2)培养的细胞中，诱导性多能干细胞被诱导的情况下，选择待测核酸作为可制备诱导性多能干细胞的核酸的步骤。上述步骤(2)培养的细胞中诱导性多能干细胞被诱导，可以使用公知的方法进行 评价。作为该方法，例如可以使用上述“I.诱导性多能干细胞的制备方法”栏中例举的、选择被诱导为诱导性多能干细胞的细胞方法，或评价细胞具备作为多能性干细胞的特质的方法等，但不限于此。该方法例如检测对NANOG基因、S0X2基因、0CT3/4基因、KLF4基因、LIN28基因及c-MYC基因组成的组中选择的至少一种基因，优选NANOG基因和/或0CT3/4基因，更优选NANOG基因表达的促进。上述步骤(2)培养的细胞中诱导性多能干细胞被诱导，优选步骤(I)中导入有待测核酸的细胞，在导入的I X IO7个细胞中为I例以上，更优选在I X IO6个细胞中为I例以上，特别优选在IX IO5个细胞中为I例以上的细胞中，诱导性多能干细胞被诱导。选择的核酸为两种以上核酸组合的情况下，根据需要，可以从组合中去除一种或两种以上核酸和/或追加一种或两种以上组合中不包含的微RNA，反复进行本筛选方法。通过该反复操作，可以选择制备诱导性多能干细胞中所必需的核酸，和/或选择可高效率地制备诱导性多能干细胞的核酸。以这种方式，对可制备诱导性多能干细胞的核酸进行筛选。实施例下面根据实施例等对本发明进行详细说明，但是本发明并不限于此。实施例f 3将小鼠脂肪干细胞(ABSC)重编程，进行制备诱导性多能干细胞的实验。(实验方法)按照非专利文献4中记载的方法由Nanog-GFP小鼠建立小鼠脂肪干细胞(ABSC)株，并对其进行培养。将5 μ Ι/ml脂质体2000 (Lipofectamine2000)与下述组合的化学合成的微RNA用无血清培养基稀释，向稀释后的溶液中混合所述ABSC，使所述ABSC为2 X IO5细胞/ml，进行微RNA的转染。实施例I mmu-miR-17 (SEQ ID NO :I)、mmu_miR-21 (SEQ IDNO 2),mmu-miR-154(SEQ ID NO :3)、mmu-miR-302a (SEQ IDNO :5)、mmu-miR-302b (SEQ ID N0:6)、mmu-miR-302c (SEQ IDNO :7)、mmu-miR-302d (SEQ ID NO :8)、mmu-miR-367 (SEQ IDNO 10)、mmu-miR-369-5p (SEQ ID NO : 12)及 mmu-miR-370 (SEQID NO :13);实施例2 :mmu-miR-200c (SEQ ID NO :4)、mmu-miR-294 (SEQID NO :5)、mmu-miR-302a (SEQ ID NO :5)、mmu-miR-302b (SEQID NO :6)、mmu-miR-302c (SEQ ID NO:7)、mmu-miR-302d (SEQID NO :8)、mmu-miR-369_3p (SEQ ID NO :11)及 mmu-miR-369_5p(SEQ ID NO 12)；实施例3 :mmu-miR-200c (SEQ ID NO :4)、mmu-miR-302a (SEQID NO :6)、mmu-miR-302b (SEQ ID NO :7)、mmu-miR-302c (SEQID NO :8)、mmu-miR-302d (SEQ ID NO:9)、mmu-miR-369-3p (SEQID NO :11)及 mmu-miR-369_5p (SEQ ID NO 12)0在转染时，对微RNA进行稀释，使各微RNA的终浓度为30pM。在各实施例中，将转染后的各体细胞在含有10%FBS的D-MEM培养基中培养七天，同时每隔一天更换一次培养基，开始转染的第七天后，将小鼠胚胎成纤维细胞(用10μ g/ml丝裂霉素处理2小时30分钟)作为饲养细胞接种在O. 1%明胶涂层板上，作为ES细胞培养环境，使用向D-MEM中加入了 15%FBS (胎牛血清)、IOOuM NEAA (非必需氨基酸)、2mML_谷氨酸(L-glutamine)、100 μ M 2_ 疏基乙醇(2-mercaptoethanol)、1000U/ml LIF (白血病抑制 因子)的培养基，每天更换培养基进行培养。为了确认以这种方式培养的体细胞诱导为诱导性多能干细胞，使用基恩士(Keyence)公司的一体式(All-in onetype)突光显微镜系统在导入微RNA后第10天和/或第16天的细胞中观察作为多能干细胞指标的Nanog-GFP的表达。实验结果在实施例I及2中，导入微RNA后第10天，观察到可检测出Nanog-GFP表达的细胞。此外，检测出Nanog-GFP表达的细胞为多能干细胞特有的形态，可观察到形成球状细胞块(胚样体)的细胞(图I及2)。实施例3中，观察到诱导为检测出Nanog-GFP表达的独立的诱导性多能干细胞，在导入微RNA后第10天时，在4X IO5细胞中观察到Γ4例，在第16天时，在4X IO5细胞中观察到例(10次独立试行)。其结果与使用病毒载体将编码0ct3/4、Klf4、c-myc及Sox2的各个基因导入小鼠体细胞中的诱导性多能干细胞的制备方法的情况(第10天4X IO5细胞中2 4例、第16天4X IO5细胞中I例，参照非专利文献I及3)相比毫不逊色。因此，可知根据本发明方法，可实现能够满足医疗产业的高效率地向诱导性多能干细胞的诱导。实施例4通过标记蛋白的免疫染色实验验证出实施例3的诱导性多能干细胞具有与ES细胞同样的性质。作为检测对象的标记蛋白，使用已知ES细胞等具有多能型的细胞特异性表达的SSEAl抗原及0ct3/4蛋白质。实验方法通过免疫染色法固定实施例3的细胞。接着，在将抗SSEAl抗体(MAB4301，Millpore公司)稀释到10 μ g/ml或抗小鼠0ct3/4抗体(MAB4305, Millpore公司)稀释到20 μ g/ml的磷酸缓冲液中，将固定试样在4°C下孵育24小时，进一步洗涤后，再在将作为二抗的Alexa546标记山羊抗小鼠IgG抗体(英杰生命技术公司)用磷酸缓冲液稀释至500ng/ml的磷酸缓冲液中，在37°C下孵育30分钟，制备抗体染色试样。用基恩士公司制一体式荧光显微镜系统观察抗体染色试样。实验结果如图3所示，在图3下图中央部位的集落中可以确认小鼠SSEAl抗原的表达。此夕卜，如图4所示，图4下图中央部位的集落中可以确认小鼠Oct3/4蛋白的表达。因此，可知通过本发明的方法，能够制备与ES细胞表现为同样性质的细胞。实施例5通过测量标记基因表达量来验证实施例3的诱导性多能干细胞具有与ES细胞同样的性质。作为测定目标的标记基因，已知ES 细胞等具有多能性的细胞特异性表达的Nanog基因及0ct3/4基因。实验方法关于实施例3的细胞、未导入在添加了 10%FBS的D-MEM培养基中培养的微RNA的对照小鼠脂肪干细胞及在与实施例3的细胞同样的ES细胞培养环境下培养出的小鼠ES细胞(R-CMTI-1A，Millpore公司)，将导入微RNA后第25天的实施例3的体细胞或在与其相当的期间内进行培养的对照小鼠脂肪干细胞及小鼠ES细胞回收。使用mirVana miRNA分离试剂盒(AM1560, Ambion公司)按照同一试剂盒中附带的操作手册从各细胞提取总RNA(total RNA)，从各细胞中提取了约2μ g的总RNA。关于提纯的各RNA,以IOOOng作为模板，使用LightCyclerTaqMan (注册商标)master kit (4535286,Roche Diagnostics 公司)试剂盒,对小鼠 Nanog 基因及小鼠 0ct3/4基因进行定量实时RT-PCR，测量表达量。具体操作按照所述试剂盒中附带的操作手册进行。作为用于确认提纯的RNA的品质及使测量目标基因的表达量标准化的阳性对照，对小鼠甘油醒-3-憐酸脱氧酶基因(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase (Gadph))也进行PCR扩增。PCR扩增的条件如下所述在95°C下进行10秒钟的热变性并在60°C下进行30秒钟的退火及延伸反应，以此为一个循环，进行35个循环。对各试样各自独立实施3次PCR，将3次的平均值作为表达量。所使用的PCR引物如下所述(I)小鼠 Nanog 基因Nanog-S (SEQ ID NO :21) :5’ -TTCTTGCTTACAAGGGTCTGC-3’Nanog-AS (SEQ ID NO :22) :5，-CAGGGCTGCCTTGAAGAG-3’(2)小鼠 0ct3/4 基因0ct3/4-S (SEQ ID NO :23) :5’ -CACGAGTGGAAAGCAACTCA-3’0ct3/4-AS (SEQ ID NO :24) :5，-GCTTTCATGTCCTGGGACTC-3，(3)小鼠 GADPH 基因Gapdh-S (SEQ ID NO :25) :5’ -TGTCCGTCGTGGATCTGAC-3’Gapdh-AS (SEQ ID NO :26) :5’ -CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3’实验结果如图5所示，可确认实施例3的诱导性多能干细胞与ES细胞同样表达小鼠Nanog基因及小鼠0ct3/4基因。因此，可知根据本发明的方法，能够制备与ES细胞表现为同样性质的细胞。实施例6对实施例3的诱导性多能干细胞的肿瘤形成率进行评价。实验方法
将导入微RNA后第30天的实施例3的诱导性多能干细胞，以及除了导入微RNA以外进行同样培养的对照细胞，各取I X IO6细胞在含有10%FBS的100 μ I D-MEM中稀释，将其注射到N0D/SCID小鼠侧腹部的皮下，将小鼠饲养4周后，对肿瘤形成能力进行评价。实验结果即使在非专利文献3中已报告有肿瘤形成的皮下注射后4周内，注射了实施例I中制备的诱导性多能干细胞及对照细胞肿瘤的小鼠，并未发现肿瘤的形成(微RNA导入细胞为6例中O例，对照细胞为6例中O例)。因此，可知通过本发明方法制备的诱导性多能干细胞与通过导入基因制备的诱导性多能干细胞相比，肿瘤形成的可能性低。实施例7 将人皮肤成纤维细胞(HDF)重编程，进行制备诱导性多能干细胞的实验。实验方法用D_MEM+10%FBS培养基培养人皮肤成纤维细胞(Humandermal fibroblasts(HDF) (CA106K05a，东洋纺公司))。用与上述实施例广3同样的操作顺序转染化学合成的微 RNA 的 has-miR-200c (SEQ ID NO : 13)、has_miR-302a (SEQ ID NO : 14)、has_miR-302b(SEQ ID NO :15)、has-miR-302c (SEQ ID NO : 16)、has_miR-302d (SEQ ID NO :17)、has-miR-369-3p (SEQ ID NO : 18)、has-miR-369_5p (SEQ ID NO : 19)及 has-miR-369_3p(SEQ ID NO :20)。用与上述实施例广3同样的操作也对转染后的体细胞进行培养。导入微RNA后，用基恩士公司的一体式荧光显微镜系统观察导入微RNA后第20天的细胞。实验结果如图6下图所示，观察到与对照的HDF细胞(图5上图)的形状明显不同的，为多能干细胞特有形态的形成球状细胞块(胚样体)的细胞。因此，可知通过本发明方法，将人成纤维细胞重编程，能够制备诱导性多能干细胞。从上述实施例f 7所示的结果可知，选择特定的微RNA，将其组合导入到细胞中时，能以高诱导效率实现肿瘤形成可能性低的诱导性多能干细胞的制备。进而，从实施例Γ3及实施例7所示的结果也可知，能实现从广泛的哺乳类的体细胞制备诱导性多能干细胞。序列表自由文本SEQ ID NO :1 13 表不 mmu_miR-17、mmu_miR-21、mmu-miR-154、mmu-miR-200c、mmu-miR-294>mmu-miR_302a、mmu-miR_302b、mmu-miR_302c、mmu-miR_302d、mmu-miR-367>mmu-miR-369-3p> mmu-miR-369-5p 及 mmu-miR-370 的成熟的微 RNA 的喊基序列。SEQ ID NO :14 20 表不 hsa_miR-200c、hsa_miR-302a、hsa_miR-302b、hsa-miR-302c、hsa-miR-302d、hsa-miR-369-3p 及 hsa-miR-369_5p 的成熟的微 RNA 的喊基序列。SEQ ID N0:21及SEQ ID NO :22表示用于扩增小鼠Nanog基因的引物的碱基序列。SEQ ID N0:23及SEQ ID NO :24表示用于扩增小鼠0ct3/4基因的引物的碱基序列。SEQ ID N0:25及SEQ ID NO :26表示用于扩增小鼠GADPH基因的引物的碱基序列。
权利要求
1.一种诱导性多能干细胞的制备方法，其包含向体细胞中导入核重编程因子的步骤，其特征在于，所述核重编程因子是促进从NANOG基因、S0X2基因、0CT3/4基因、KLF4基因、LIN28基因及c-MYC基因组成的组中选择的至少一种基因的表达的核酸。
2.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于，所述核酸为微RNA。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述微RNA是从抑制分化的微RNA、促进未分化诱导的微RNA、控制细胞间粘附的微RNA及抑制细胞凋亡的微RNA组成的组中选择的至少一种。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述微RNA为miR-200、miR-302及 miR-369。
5.一种诱导性多能干细胞，其特征在于，其是根据权利要求广4中任意一项所述的方法制备的。
6.一种诱导性多能干细胞的诱导剂，其特征在于，其含有促进从NANOG基因、S0X2基因、0CT3/4基因、KLF4基因、LIN28基因及c_MYC基因组成的组中选择的至少一种基因的表达的核酸。
7.一种诱导性多能干细胞制备试剂盒，其特征在于，其含有促进从NANOG基因、S0X2基因、0CT3/4基因、KLF4基因、LIN28基因及c_MYC基因组成的组中选择的至少一种基因的表达的核酸。
8.一种可以制备诱导性多能干细胞的核酸的筛选方法，其特征在于，其包括下述步骤 (O向体细胞中导入待测核酸； (2)培养步骤(I)中的导入了待测核酸的细胞'及 (3)在步骤(2)培养的细胞中，诱导性多能干细胞被诱导的情况下，选择该待测核酸作为可制备诱导性多能干细胞的核酸。
9.根据权利要求8所述的筛选方法，其特征在于，其可以通过对从NANOG基因、S0X2基因、0CT3/4基因、KLF4基因、LIN28基因及c_MYC基因组成的组中选择的至少一种基因表达的促进，来对诱导性多能干细胞被诱导进行检测。
10.根据权利要求8或9所述的筛选方法，其特征在于，所述核酸为微RNA。
全文摘要
本发明的主要目的是提供一种诱导性多能干细胞的制备方法，该方法形成肿瘤的可能性低，并且可保证诱导效率高。该诱导性多能干细胞的制备方法包括向体细胞中导入促进下述基因表达的核酸的步骤，所述基因是从NANOG基因、SOX2基因、OCT3/4基因、KLF4基因、LIN28基因及c-MYC基因组成的组中选择的至少一种。
文档编号C12Q1/02GK102884188SQ20118001959
公开日2013年1月16日 申请日期2011年2月18日 优先权日2010年2月18日
发明者森正树, 石井秀始, 三吉范克, 土岐祐一郎, 种村匡弘, 永井健一, 星野宏光, 大村仁昭, 原口直绍, 宫崎进 申请人:国立大学法人大阪大学