专利名称：用于诊断与缺氧有关的病状的方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于检测与缺氧相关的病状，具体地是脑血管意外、胎儿窘迫和心血管疾病的方法。
背景技术：
组织缺氧是一种组织细胞缺乏足够的氧供应的病理状态。当这种情况发生时，细胞中的正常生物过程受损从而代谢地适应于氧缺乏。氧剥夺导致与诸如血管形成和糖酵解的许多过程相关的基因的上调，包括促红细胞生成素和血管内皮生长因子。局部缺血被定义为由于至局部区域的血管堵塞而造成的向该区域的血液供应 (循环)不足。这继而导致组织缺氧或缺氧症(缺乏氧)。局部缺血总是导致缺氧；然而，缺氧可在不存在局部缺血的情况下发生，例如动脉血的氧含量随着贫血的发生而下降的情况。缺血性心脏病(IHD)或心肌缺血是一种以通常由冠状动脉疾病(冠状动脉的动脉粥样硬化)所导致的心肌缺血为特征的疾病。据估计在美国1400万人患有缺血性心脏病。在这些当中，多达400万有很少或没有症状并且未意识到他们有绞痛(心绞痛)或心脏病发作(心肌梗塞)的风险。p53(也称为蛋白质53或肿瘤蛋白质53)，是一种肿瘤抑制蛋白质，其在人类中由 TP53 基因编码(Matlashewski G 等，Embo J. (1984)，3(13) :3257-62)。p53 在多细胞生物体中是重要的，其在多细胞生物体中调节细胞周期并因此用作参与预防癌症的肿瘤抑制子。P53基因的激活导致包括Apaf-I和p21的很多靶基因的转录升高，这些靶基因中的一些升高 30 至 50 倍(Kannan 等，Oncogene (2001) 20 (26) : 3449-55 ；Kannan 等，Oncogene, 2001;20(18):2225-34)。野生型p53蛋白质被称为具有类似监护人的作用，因为其负责监测细胞状态并通过引起细胞周期停滞或细胞凋亡来对应激进行响应。最近数据显示，虽然缺氧诱导的P53并不反式激活已知祀基因，例如Apaf-I或Perp,但其结合这些基因的启动子(Sumiyoshi Y等，Clin Cancer Res, 2006; 12:5112-7)。其他研究显示p53的细胞水平在缺氧期间是稳定的(Hammond EM 等，Clin Cancer Res(2006)12(17):5007-5009)。此前的工作显示，并发有胎儿生长迟缓的妊娠(例如子痫前期)的胎盘相比于正常妊娠呈现增强的细胞凋亡和P53的上调(Levy等，Am J ObstetGynecol(2002)186(5):1056-61)。Ferguson-Smith已经证明少数有核胎儿细胞例如胎儿滋养细胞以及无细胞胎儿DNA进入母体循环中。在子痫前期有核胎儿细胞和无细胞胎儿DNA的数目增加，后者甚至在临床症状之前即为明显的。胎儿DNA水平在妊娠期间增加并在分娩之后的约数小时内被清除(Ferguson-Smith, Proc Natl Acad Sci USA, 2003; 100 (8) : 4360-2)。类似地,在母体循环中可检测到少量胎儿 DNA (Lo YM, Corbetta N, Chamberlain PF, Rai V, Sargent IL, RedmanCff 等，Lancet, 1997; 350:485-7)。因此，循环核酸可见于血浆和血清中。所述核酸可为RNA、线粒体DNA或基因组DNA。DNA(1.8-35ng mL-1)和RNA(2. 5ng mL-1)存在于健康个体的血浆和血清中并且它们的水平在患有各种癌症、创伤、心肌梗塞和中风的患者中上升。Poon和同事已首次证明，使用两步逆转录酶(RT)-PCR测定，怀有男性胎儿的孕妇的血浆中来源于胎儿的男性特有mRNA的存在提供一种无创性产前诊断的方式(Poon等，Clin Chem, 2000;46(II):1832-4)。循环核酸也已显示可用作患有实体瘤形成的患者的预后或预测标记物(GoebelG，Dis Markers, 2005; 21 (3) :105-20)。Cheng T 等报道循环型 c-met 是非小细胞肺癌的一个独立阴性预后指标(Chest, 2005; 128:1453-60)。已报道测量血浆循环mRNA使得能够早期检测肝损伤(Kudo Y等，J Vet MedSci, 2008;70:993-5)。关于血浆和血清中循环核酸的存在的早期研究主要涉及胎儿医学和肿瘤学领域。
迄今为止，循环核酸相关的研究涉及其他病理状态，包括创伤、败血症、心肌梗塞、中风、移植、糖尿病和血液系统病症(Butt和Swaminathan, Ann N YAcadSci. 2008; 1137:236-42)。通过引入高灵敏度的一步实时定量逆转录(RT)-聚合酶链反应(PCR)，可以容易地检测和定量通常仅以低浓度存在于血浆和血清中的循环游离RNA(NancyB. Y 等,Methods In Molecular Biology, 2006 年第 336 卷；第 123-134 页)。Corrias MV等对患有成神经细胞瘤(NB)的儿童的无细胞RNA的检测和将其与全血细胞RNA的检测的比较进行了报道，并提出对于监测疾病状态而言，检测患有NB的患者的肿瘤特异性无细胞RNA并非全细胞RNA的可靠替代选择。(Pediatr BloodCancer, 2010;54:897-903)。附图
简述本文仅以举例的方式并参照附图描述本发明。现在详细地具体参照附图，必须强调的是所示细节仅以举例的方式并旨在示例性讨论本发明的优选实施方案，并为了提供据信是本发明的原理和概念方面的最有用和最易于理解的说明而示出图I是示出正常妊娠对比缺氧妊娠中p21基因水平的图。对于每个样品示出的结果重复三次并归一化成β_肌动蛋白水平。图2是示出正常妊娠(N)对比缺氧妊娠⑶中p21水平的图。在每个样品中示出的结果重复三次并归一化成β_肌动蛋白水平。发明概述 在本发明的一个方面，本发明提供一种用于检测受试者的与缺氧相关的病状的方法，所述方法包括确定得自受试者的生物样品中至少一种Ρ53诱导型基因的无细胞核糖核酸(RNA)的水平，其中高于或低于与所述至少一种ρ53诱导型基因相关的预定范围的所述无细胞RNA的水平指示受试者患有与缺氧相关的病状。在本发明的另一个方面，本发明提供一种用于确定受试者的与缺氧相关的病状的严重程度的方法，包括确定得自受试者的生物样品中至少一种Ρ53诱导型基因的无细胞RNA的水平和将所述ρ53诱导型基因的无细胞RNA的水平与预定范围进行比较，所述预定范围使所述至少一种Ρ53诱导型基因的水平与所述与缺氧相关的病状的严重程度相关联，所述比较允许确定受试者的与缺氧相关的病状的严重程度。在本发明的又一个方面，本发明提供一种用于确定对受试者的与缺氧相关的病状的治疗性治疗的效果的方法，包括确定两个或更多个生物样品中至少一种Ρ53诱导型基因的无细胞RNA的水平，所述生物样品在两个或更多个时间点从所述受试者获得，所述时间点中的至少一个在所述治疗期间或之后，其中(i)对于在与缺氧相关的病状中过表达的p53诱导型基因而言，在所述两个或更多个样品之间所述P53诱导型基因的所述无细胞RNA的所述水平降低指示所述治疗性治疗的效果；(ii)对于在与缺氧相关的病状中受抑制的p53诱导型基因而言，在所述两个或更多个样品之间所述P53诱导型基因的所述无细胞RNA的所述水平提高指示所述治疗性治疗的效果。还在本发明的又一个方面，本发明提供一种用于选择患有与缺氧相关的病状的受试者以接受治疗性治疗以便治疗所述病状的方法，所述方法包括确定得自受试者的生物样品中至少一种P53诱导型基因的无细胞RNA的水平和在至少一种p53诱导型基因的无细胞RNA的所述水平高于或低于与所述至少一种p53诱导型基因相关的预定范围的情况下选择受试者以接受所述治疗性治疗。 实施方案列表以下所公开的是本发明的一些非限制性实施方案，其以编号段落的形式提供。一种用于检测受试者的与缺氧相关的病状的方法，所述方法包括确定得自所述受试者的生物样品中至少一种P53诱导型基因的无细胞核糖核酸(RNA)的水平，其中高于或低于与所述至少一种p53诱导型基因相关的预定范围的所述无细胞RNA的水平指示所述受试者患有与缺氧相关的病状。I. 一种用于检测受试者的与缺氧相关的病状的方法，所述方法包括确定得自所述受试者的生物样品中至少一种P53诱导型基因的无细胞核糖核酸(RNA)的水平，其中高于或低于与所述至少一种P53诱导型基因相关的预定范围的所述无细胞RNA的水平指示所述受试者患有与缺氧相关的病状。2. 一种用于确定受试者的与缺氧相关的病状的严重程度的方法，包括确定得自所述受试者的生物样品中至少一种P53诱导型基因的无细胞RNA的水平和将所述p53诱导型基因的所述无细胞RNA的所述水平与预定范围进行比较，所述预定范围使所述至少一种P53诱导型基因的所述水平与所述与缺氧相关的病状的所述严重程度相关联，所述比较允许确定所述受试者的与缺氧相关的所述病状的所述严重程度。3. 一种用于确定对受试者的与缺氧相关的病状的治疗性治疗的效果的方法，包括确定来自两个或更多个生物样品的至少一种P53诱导型基因的无细胞RNA的水平，所述生物样品在两个或更多个时间点从所述受试者获得，所述时间点中的至少一个在所述治疗期间或之后，其中(i)对于在与缺氧相关的病状中过表达的p53诱导型基因而言，在所述两个或更多个样品之间所述P53诱导型基因的所述无细胞RNA的所述水平降低指示所述治疗性治疗的效果；(ii)对于在与缺氧相关的病状中受抑制的p53诱导型基因而言，在所述两个或更多个样品之间所述P53诱导型基因的所述无细胞RNA的所述水平提高指示所述治疗性治疗的效果。4.根据实施方案3所述的方法，其中在开始所述治疗之前的时间点取得一个或多个第一样品而在所述治疗期间或之后的时间点取得一个或多个第二样品。5.根据实施方案3所述的方法，其中在所述治疗期间的时间点取得一个或多个第一样品并且在所述治疗期间继所述一个或多个第一样品的所述时间点之后的时间点取得一个或多个第二样品。6.根据实施方案3所述的方法，其中在所述治疗期间的时间点取得一个或多个第一样品而在已中止所述治疗之后的时间点取得一个或多个第二样品。7. 一种用于选择患有与缺氧相关的病状的受试者以接受治疗性治疗以便治疗所述病状的方法，所述方法包括确定得自所述受试者的生物样品中至少一种P53诱导型基因的无细胞RNA的水平和在至少一种p53诱导型基因的无细胞RNA的所述水平高于或低于与所述至少一种P53诱导型基因相关的预定范围的情况下选择所述受试者以接受所述治疗性治疗。8. 一种用于执行根据实施方案I至7中任一项所述的方法的试剂盒，包含至少一种用于扩增来自生物样品的至少一种P53诱导型基因的无细胞RNA的试剂和用于执行根据权利要求I至7中任一项所述的方法的说明书。9.根据实施方案8所述的试剂盒，其中所述至少一种试剂包括用于与所述至少一种p53诱导型基因特异性杂交的引物或探针。·
10.根据实施方案8或9所述的试剂盒，所述试剂盒还包含至少一种用于从生物样品中提取无细胞RNA的试剂。11.根据实施方案I至7中任一项所述的方法或根据实施方案8至10中任一项所述的试剂盒，其中所述样品为体液样品。12.根据实施方案11所述的方法或试剂盒，其中所述体液样品为血液样品。13.根据实施方案11所述的方法或试剂盒，其中所述样品为血清样品。14.根据实施方案11所述的方法或试剂盒，其中所述样品为血浆样品。15.根据实施方案I至7中任一项所述的方法或根据实施方案8至10中任一项所述的试剂盒，其中至少一种P53诱导型基因的无细胞RNA的水平通过RT-PCR确定。16.根据实施方案15所述的方法或试剂盒，其中所述RT-PCR为实时定量RT-PCR。17.根据实施方案I至7中任一项所述的方法或根据实施方案8至10中任一项所述的试剂盒，其中所述与缺氧相关的病状选自心血管疾病、癌症、脑血管意外(CVA)和胎儿窘迫。18.根据实施方案17所述的方法或试剂盒，其中所述与缺氧相关的病状是胎儿窘迫。19.根据实施方案17所述的方法或试剂盒，其中所述心血管疾病是心肌梗塞。20.根据实施方案18或19所述的方法或试剂盒，其中所述至少一种p53诱导型基因选自 TP53 (GeneBank 登录号 Nm_000546)、p21 (GeneBank 登录号 Nm_000389)、ERCC5 (GeneBank 登录号 Nm_000123)、MDM2 (GeneBank 登录号 Nm_0006878)、TP53I3 (GeneBank 登录号 Nm_004881)、NOTCHl (GeneBank 登录号 Nm_017617)、PIGF (GeneBank 登录号 Nm_002643)、BTG2 (GeneBank 登录号 Nm_006763)、ZMAT3 (GeneBank登录号 Nm_0022470)、APAFl (GeneBank 登录号 Nm_013229)、FAS (GeneBank 登录号 Nm_l52873)、ANGPTL2 (GeneBank 登录号 Nm_012098)、PUMA (GeneBank 登录号Nm_014417)、IGFBP6 (GeneBank 登录号 Nm_002178)、⑶F15 (GeneBank 登录号 Nm_004864)、BNIP3L (GeneBank 登录号 Nm_004331. 2)、TGF β 3 (GeneBank 登录号 Nm_003239)、VEGF (GeneBank 登录号 Nm_001025366)和 HIF-1 α。21.根据实施方案20所述的方法或试剂盒，其中所述至少一种ρ53诱导型基因选自 p21 (GeneBank 登录号 Nm_000389)、BTG2 (GeneBank 登录号 Nm_006763)、HIF-I a (GeneBank 登录号 Nm_001530)、NOTCHl (GeneBank 登录号 Nm_017617)、TGF β 3 (GeneBank 登录号 Nm_003239)和 ZMAT3 (GeneBank 登录号 Nm_0022470)。22.根据实施方案20所述的方法或试剂盒，其中所述至少一种p53诱导型基因是p21 (GeneBank 登录号 Nm_000389)。23.根据实施方案20所述的方法或试剂盒，其中所述至少一种p53诱导型基因是BTG2 (GeneBank 登录号 Nm_006763)。 一些非限制性实施方案的详述本发明基于以下发现各种p53诱导型基因的无细胞RNA的浓度改变(尤其是血液中)与各种与缺氧相关的病状例如胎儿窘迫(由胎儿中测量的低氧水平反映)、子痫前期、缺血性心脏病、中风(脑血管意外(CVA))和心肌梗塞相关联。因此，不希望受理论的束缚，已知缺氧会影响p53和p53诱导型基因表达水平。基于上述，本发明的发明人已设想到无细胞RNA可用作预测各种与缺氧相关的疾病的有效诊断工具。本发明还包括基于与缺氧相关的病状的治疗前后各种p53诱导型基因的无细胞RNA的水平差异评估对所述与缺氧相关的病状的治疗效果的工具。因此，根据本发明的第一方面，提供一种用于检测受试者的与缺氧相关的病状的方法，所述方法包括检测得自受试者的生物样品中至少一种P53诱导型基因的无细胞核糖核酸(RNA)的水平，其中高于或低于与所述至少一种p53诱导型基因相关的预定范围的所述无细胞RNA的水平指示受试者患有与缺氧相关的病状。如本文所用，术语“检测”是指定量以及定性确定得自受试者的生物样品中无细胞RNA的存在与否。该检测因此允许基于得自受试者的生物样品中无细胞RNA的水平确定受试者的与缺氧相关的病理状态(例如，心肌缺血；心肌梗塞的急性阶段(最初几个小时至7天)、治疗阶段(7至28天)和治愈阶段(29天和往后))的存在(或不存在)。如本文所用，术语“与缺氧相关的病状”是指通常由于至器官的血流减少而使得器官或组织中氧水平降低到预定正常生理水平或范围以下的状态。这种血流减少可由以下非限制性情况引起(i)由栓子(血凝块)引起的脉管堵塞；(ii)由于动脉粥样硬化导致的脉管堵塞；(iii)血管破损(出血性中风)；(iv)由于诸如在血管痉挛期间和可能在短暂性脑缺血发作(TIA)期间和蛛网膜下出血之后发生的血管收缩导致的血管堵塞。根据本发明教导内容的缺氧可为慢性或短暂性的。与缺氧相关的病状可包括但不限于脑血管意外(CVA)、胎儿窘迫(例如，在分娩前期(分娩之前)或分娩期(分娩过程)期间损害胎儿；可与胎儿缺氧(胎儿低氧水平)互换使用)、心血管疾病和病状例如急性冠状动脉综合症、缺血性心脏病、心肌缺血(也称为缺血性心脏病)、心肌梗塞(MI)(包括其所有阶段，如本文所述)心脏外科手术、神经外科、脑缺氧、脑梗塞、外科手术(例如，全外科手术缺氧、手术后缺氧)、创伤、肺部疾病、肺性高血压症、慢性阻塞性肺部疾病(COPD)、冠状动脉疾病、周围性血管疾病[例如，动脉硬化(动脉粥样硬化、移植加速动脉硬化)、深静脉血栓形成]、癌症(例如但不限于子宫颈癌、结肠癌、肾癌、肺癌、子宫癌、乳腺癌或胰细胞癌、淋巴癌、白血病)、血管生成及血管生成相关病症(例如但不限于糖尿病视网膜病变、黄斑变性、牛皮癣和类风湿性关节炎)、肾衰竭、骨骼肌局部缺血、睡眠呼吸暂停、睡眠期间缺氧、病毒感染、细菌感染、吸烟、贫血、血容量不足、出血、高血压、糖尿病、血管病变(vasculopathologies)、雷诺氏疾病(ReynaucT s disease)、内皮功能障碍、局部灌注受损(例如，肢体、肠、肾局部缺血)、血栓形成、冻伤、褥疮性溃疡、窒息、中毒(例如，一氧化碳、重金属)、高空病、婴儿猝死综合症(SIDS)、哮喘、先天性循环系统畸形(例如，法洛四联症(Tetralogy of Fallot))以及骨髓成红血细胞增多症(蓝婴综合症(blue baby syndrome)) 如本文所用，术语“生物样品”是指任何得自受试者的样品。这种样品优选为体液。合格的样品包括但不限于血液、血浆、血清、羊水、痰、唾液、精液、尿液、粪便、骨髓和脑脊液(CSF)。术语“血清”是指移除纤维蛋白凝块和血细胞之后获得的血液的流体部分，区别于循环血液中的血浆。术语“血浆”是指血液的流体、非细胞部分，区别于凝固后获得的血清。 在一些实施方案中，生物样品选自痰或唾液。通常对样品进行处理以从中移除细胞部分，即变成无细胞RNA样品，如下文进一步论述。从受试者获得生物样品的程序是本领域熟知的。这些程序包括但不限于血液取样、羊膜穿刺术、绒毛膜绒毛取样和尿液采集。如本文所用，“受试者”是指任何温血动物，尤其包括哺乳动物类的成员，例如但不限于人类和非人灵长类，例如黑猩猩和其他类人猿以及猴物种；农场动物，例如牛、绵羊、猪、山羊和马；驯养哺乳类动物，例如狗和猫；实验室动物，包括啮齿类例如小鼠、大鼠和豚鼠，等等。该术语并不表示特定年龄或性别，并因此包括成年和新生受试者，不论雄性或雌性。在本发明上下文中的受试者优选为人类受试者。如本文所用，短语“无细胞核糖核酸(RNA) ” (也称为循环RNA或ciRNA)是指存在于样品的无细胞部分中的这类RNA(例如，mRNA)。本文所述的无细胞RNA不包含在完整细胞(即，包含未受损的细胞质膜)中但通常与粒子相关(例如，来源于胎盘的合体滋养细胞微粒，参见Rusterholz等，上文；或凋亡小体，参见Hasselmann等，ClinChem (2001) 47:1488-1489)。在一些实施方案中，该无细胞RNA是完整的(即，未成片段的)。可根据本领域已知的任何方法从生物样品中提取无细胞RNA样品(参见实施例部分的通用材料和方法部分)。例如，在获得生物样品(即血液)之后，如此前所述(参见例如Ng等，上文)来制备样品。简而言之，通过两个离心周期(例如，于4°C下以l，600Xg进行10分钟)从样品移除所有有核细胞。将所得的无细胞样品(例如，血浆或血清)转移到干净的管(例如，埃彭道夫管(eppendorftube))中，与TRIzol LS试剂(Invitrogen, Carlsbad, CA)加氯仿进行混合并离心(例如，于4°C下以ll，900Xg进行15分钟)。将水性层转移到新管中并与70%乙醇(以I: I比率)混合。然后根据制造商的推荐规范将混合物转移到RNeasy微型柱(RNeasy微型试剂盒,Qiagen, Valencia, CA)中并用不含RNA酶的水洗脱总RNA。根据本发明的对无细胞RNA的定量可通过本领域已知的任何方法或采用这类方法的试剂盒来实现。这类方法的一些非限制性实例包括逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、实时 RT-PCR(例如，IaoiManJi 和 Assays-on-Demand , (Applied Biosystems, FosterCity, CA, USA)、分子信标(Molecular Beacons)、Scorpions 和⑩ Green (分子探针))、血衆/血清循环RNA纯化试剂盒(例如,Norgen’ s www. norgenbiotek. com)以及RNA微阵列。在一些实施方案中，将无细胞RNA进一步对多个看家基因(例如，β-肌动蛋白、GAPDH、CypA、HPRT、Ki-67、SDHA、HPRTl、HBSlL、AHSP、β_2_ 微球蛋白)进行归一化以便提供对生物样品中无细胞RNA的更加 准确的测量。用于进行RNA定量的试剂通常包含至少一种用于与所述至少一种Ρ53诱导型基因特异性杂交的引物和/或探 针。如本文所用，术语“特异性杂交”是指形成诸如RNA:RNA、RNAiDNA和/或DNA = DNA分子的双链分子。扩增和/或检测特定基因的无细胞RNA通常涉及使用至少一种序列特异性寡核苷酸(参见以下的实施例部分的通用材料和方法部分)。所述寡核苷酸可具有至少10、至少15、至少20、至少25或至少30个与本发明的多核苷酸序列特异性杂交的碱基。可使用多种方法进行杂交双链体的检测，包括通过序列特异性探针(例如，MGB-探针)。通常,标签或标记附接(偶联)至探针。这些标签或标记在本领域具有标准用途并且包括放射性、荧光、生物或酶标签或标记。传统的杂交测定包括PCR、RT-PCR、RNA酶保护；原位杂交、引物延伸、RNA印迹(Northern Blot)和斑点印迹分析(参见下文实施例部分)。适于检测某些p53诱导型基因的特异性引物和探针的实例在以下的实施例部分提供。本领域的任何技术人员将能够使用本领域熟知的方法基于本文提供或本领域可获得的可用基因序列生成合适的引物和探针。如本文所用，术语“p53诱导型基因”是指其中基因的表达直接或间接地受蛋白质53(p53)调节的基因。在一些实施方案中，p53对所述基因的调节通过转录调节进行，由此该基因的表达水平改变取决于基因的转录速率(例如，通过影响转录起始)。当在转录水平调节基因时，p53蛋白可通过结合DNA结合位点(其有时位于基因的启动子附近)或通过结合调节结合位点以打开基因(即激活基因)或关闭基因(即抑制基因)来调节基因的表达。在一些实施方案中，基因调节在转录后修饰(例如，糖基化、乙酰化、脂肪酰化、二硫键形成等)、RNA转运、RNA翻译(例如,翻译起始)、蛋白质转运、蛋白质稳定性、mRNA降解(即转录物稳定性)、影响基因的染色质组分(例如，影响染色质对于RNA聚合酶和转录因子的可接近性)中的一个或多个的水平进行。如本文所用，术语“与至少一种p53诱导型基因相关的预定范围”通常是指限定得自未患有任何与缺氧相关的病状的健康受试者的样品(即正常、对照的、未受缺氧影响的样品)中测量的无细胞RNA的水平的p53诱导型基因的浓度范围。这种对照样品通常得自具有相同年龄范围、生理状态(例如，妊娠)和性别的受试者。在某些情况下，其甚至可来自在缺氧状态之前的相同受试者，例如来自可能发展与缺氧相关的病状的受试者(例如，妊娠前)。在一些实施方案中，所述预定范围是限定从得自处于与缺氧相关的病状的各个阶段(例如，对于MI-心肌梗塞的急性阶段、治疗阶段或治愈阶段，如本文所述)的受试者的样品测量的无细胞RNA的水平的p53诱导型基因的浓度范围。该预定范围可用试验方法确定(例如，通过从得自MI患者的血液取样无细胞RNA)或来源于文献(如果可用的话)。因此，根据本发明，测量为统计上不同于(即高于或低于)如上定义的至少一种P53诱导型基因的预定浓度范围的无细胞RNA的水平指示受试者患有与缺氧相关的病状。
在一些实施方案中，所述与缺氧相关的病状选自胎儿窘迫、动脉硬化性血管疾病、心肌缺血、心肌梗塞、不稳定型心绞痛、心脏性猝死、冠状动脉斑块破裂或它们发生的所有阶段的血栓形成。如本文所用，术语“局部缺血”是指通常由堵塞的动脉导致的涉及至器官的血液供应不足的病状。如本文所用，术语“心肌缺血”是指由至心脏的肌肉组织的血流不足引起的心脏功能的病症。局部缺血可为无症状或有症状的。血流减少可例如由冠状动脉变窄(冠状动脉硬化)、由血栓阻塞(冠状动脉血栓形成)、或不那么常见地由心脏内的小动脉和其他小血管分散性变窄而导致。如本文所用，术语“心肌梗塞(MI) ”(也称为急性心肌梗塞(AMI)或心脏病发作)是指继发于长期局部缺血的心肌不可逆坏死。通常，心肌梗塞由供应心肌的动脉闭塞或堵塞引起并导致心肌损伤或坏死(即心脏病发作)。在本发明的上下文中，心肌梗塞是指所述疾病的任何阶段(例如，心肌梗塞的急性阶段、治疗阶段或治愈阶段，如本文所述)。如本文所用，术语“胎儿窘迫”是指胎儿有发展成妊娠相关的并发症的风险的任何病状。胎儿窘迫包括但不限于营养物质供应不足和胎儿生长中止。胎儿窘迫可影 响胎儿发育和脑功能并在与早产和紧急分娩(例如，剖腹产)有关的妊娠结局中发挥重要作用。与胎儿窘迫相关的病状包括但不限于异常妊娠、胎儿缺氧、胎儿窘迫、宫内生长迟缓(IUGR)、胎儿生长受限(FGR)、胎儿酒精综合症(FAS)、烟碱摄入、酒精摄入、营养不足、孕妇糖尿病、孕妇高龄和孕妇过度锻炼。与胎儿窘迫相关的妊娠相关缺氧病状的其他实例在上文中详细举例说明。在一些实施方案中，如本文所定义的胎儿窘迫与缺氧相关，所述缺氧与诸如以下的妊娠相关缺氧病状有关子痫前期、子痫、轻度子痫前期、慢性高血压、EPH妊娠中毒、妊娠期高血压、并发子痫前期(包括与慢性高血压、慢性肾病或狼疮并发的子痫前期)、HELLP综合症(溶血、肝酶升高、血小板数目减少)、肾病、妊娠期糖尿病、胎盘缺氧、胎儿缺氧、宫内生长迟缓(IUGR)、胎儿生长受限(FGR)、胎儿酒精综合症(FAS)。在一些实施方案中，所述至少一种p53诱导型基因选自p21 (GeneBank 登录号 U09579)、VEGF (GeneBank 登录号 NM_001025366)、HIFl a (GeneBank 登录号ΝΜ_001530. 2)、MDM2 (EST=MDM2, GeneBank 登录号 M92424)和 TP5313 (GeneBank 登录号NM 147184. I)、Fas 抗原/TNFR6 (GeneBank 登录号 X89101)、TNFR18 (GeneBank 登录号AI923712)、凝溶胶蛋白(Gelsolin) (GeneBank 登录号 X04412)、btgl (GeneBank 登录号X61123)、EST=PIG8(依托泊苷(Etoposide)诱导的，GeneBank 登录号 R11732)、TlOmRNA/人小泛素相关修饰物(human sentrin)/SUMO (GeneBank 登录号 U83117)、Apaf I (GeneBank登录号AL135220)、ANGL2, EST=血管生成素样(GeneBank登录号AF125175)、和胞质腺苷酸激酶(GeneBank登录号J04809)、SlOO钙-结合蛋白A4 (GeneBank登录号M80563)、细胞周期蛋白G2 (GeneBank登录号U47414)、EST=Ras抑制剂Rin I (GeneBank登录号L36463)、B-细胞转位基因 2，抗增殖剂(GeneBank 登录号 U72649)、ERCC5 (GeneBank 登录号 AW502004)、H2B 和 H2A 组蛋白基因(291A, GeneBank 登录号 Z83336)、Notch 同源基因I (果蝇属GeneBank登录号AI566271)、Eph受体A2 (GeneBank登录号M59371)、肝细胞生长因子样蛋白基因(GeneBank登录号U37055)和EST= a-L岩藻糖苷酶前体(GeneBank登录号Μ29877)、甘露糖苷酶2，a BI (GeneBank登录号U37248)、磷酸甘露糖酶Sec53p同源物(GeneBank登录号U86070)、亚精胺(GeneBank登录号U40369)、过氧化物酶体膜内在蛋白PMP34(GeneBank登录号AI871429)、假定蛋白/人立方蛋白(Cubilin) (GeneBank登录号AF034611)、精氨基琥珀酸合成酶I (GeneBank登录号AA069289)、脂皮质蛋白I/人膜联蛋白Al (GeneBank登录号ASW379702)、EST=黄嘌呤脱氢酶(GeneBank登录号U39487)和EST=前列腺素合成酶(GeneBank登录号M98539)、生物素羧化酶/人神经元酸性蛋白(GeneBank登录号AI422580)、Ly-6同种抗原/人二氢喃唳酶(GeneBank登录号D78014)、神经视锥蛋白样蛋白3 (NVP-3, GeneBank登录号Al391924)、EST=芳烃受体相互作用蛋白(GeneBank登录号U78521)、PIGF，磷脂酰肌醇聚糖，F类3A(GeneBank登录号 WO15279)、EST=UNC-51 样激酶 I (GeneBank 登录号 AL046256)、tob 家族 /ERBB2 转导子的DNA(GeneBank登录号D38305)、TYRO蛋白质酪氨酸激酶结合蛋白(GeneBank登录号 AI299346)、p53_ 诱导型锌指蛋白(Wig_l/ZMAT3)mRNA(GeneBank 登录号 AI457344)和GATA-I的辅因子(FOG) I (GeneBank登录号AF488691)、T复合体相关睾丸表达3 (GeneBank 登录号 AA781436)、硒结合蛋白 I (GeneBank 登录号 U29091)、EST=BPMl/ 人网蛋白I (GeneBank登录号Z54367)、EST=Vamp2/人小突触泡蛋白2 (GeneBank登录号M36205)、Fas/ΑΡΟ-Ι 细胞表面抗原(GeneBank 登录号 X63717)、Bcl-2 结合组分 3 (bbc3/PUMA, GeneBank 登录号 U82987)、Bcl-6 (GeneBank 登录号 UOOl 15)、Bak (GeneBank 登录 号 U16811)、ATL 衍生的 PMA 响应肽(GeneBank 登录号 D90070)和 GADD45 (GeneBank 登录号M60974)、BTG2 (GeneBank登录号U72649)、损伤特异性DNA结合蛋白(GeneBank登录号U18300)、组蛋白 2A 样蛋白(GeneBank 登录号 U90551)、PCNA(GeneBank 登录号 M15796)、内皮糖蛋白(GeneBank登录号X72012)、多功能蛋白聚糖(GeneBank登录号U16306)、重链 4F2 (GeneBank 登录号 M21904)、SMAD7 (GeneBank 登录号 AFO10193)、TGF- β 超家族蛋白(GeneBank登录号ΑΒ000584)和IGFBP6 (GeneBank登录号Μ62402)、巯基氧化酶(Quiescin) /QSCN6 (GeneBank 登录号 L42379)、脂肪组织分化相关蛋白(Adipophilin)(GeneBank登录号Χ97324)、多发性外生骨疣类型II蛋白(GeneBank登录号U72263)、血管平滑肌Ct-肌动蛋白(GeneBank登录号Χ13839)、平滑肌蛋白(Smoothelin) (GeneBank登录号Ζ49989)、神经微丝亚基NF-L(GeneBank登录号Χ05608)、NB胸腺素β (GeneBank登录号D82345)、LIM域蛋白(GeneBank登录号Χ93510)、赖氨酰氧化酶样蛋白(GeneBank登录号U24389)和UDP-半乳糖4差向异构酶(GALE，GeneBank登录号L38668)、cAMP活化蛋白激酶B (GeneBank登录号Y12556)、溶酶体α -甘露糖苷酶B (GeneBank登录号U05572)、羧酸酯酶(肝脏，GeneBank登录号Y09616)、ABC3 (GeneBank登录号U78735)、载脂蛋白C-I (VLDL, GeneBank 登录号 M20902)、CART(GeneBank 登录号 U20325)、卵磷脂-胆固醇酰基转移酶(GeneBank登录号M12625)、硫氰酸酶(GeneBank登录号D87292)、NECDIN相关蛋白(GeneBank 登录号 U35139)和 NSCL-2 基因(GeneBank 登录号 M96740)、FEZI-T 基因(GeneBank登录号U60062)、神经损伤诱导蛋白(Ninjurin) I (GeneBank登录号U72661)、淀粉样蛋白前体样蛋白(GeneBank登录号U48437)、c_Ha_ras (GeneBank登录号J00277)、肠VIPR相关蛋白(GeneBank登录号X77777)、二酰基甘油激酶(α，GeneBank登录号Χ62535)、推定 ser/thr 蛋白激酶(GeneBank 登录号 U56998)、DM 激酶(GeneBank 登录号 L08835)、DRAL-FHL2 (GeneBank 登录号 L42176)和激活转录因子 3 (GeneBank 登录号 L19871)、ZNF127-Xp (GeneBank 登录号 U38315)、LISCH7 (GeneBank 登录号 AD000684)、锌指蛋白7 (GeneBank 登录号 M29580) ,Tip-I (GeneBank 登录号 U90913)、核因子 NF-116 (GeneBank 登录号 HG3494)、P0M-ZP3 (GeneBank 登录号 U10099)、KIAAA0247 (GeneBank 登录号 D87434)、乳腺珠蛋白I (GeneBank登录号U33147)、二硫化物异构酶相关蛋白(GeneBank登录号J05016)和0S4(GeneBank登录号U81556)、不孕症相关精子蛋白(GeneBank登录号S58544)、KIAAO147 (GeneBank 登录号 D63481)、SURF-I (GeneBank 登录号 Z35093)、WD 重复蛋白 HANll(GeneBank 登录号 U94747)、p53 诱导基因 3(PIG3, GeneBank 登录号 AF010309)、MIC-I/⑶F15，TGF-L家族成员(GeneBank登录号AFO 19770)、参与核苷酸切除修复的DDB2 (GeneBank 登录号 U18300a)、MYD88,骨髓分化(GeneBank 登录号 U70451a)、视黄酸受体 L (GeneBank 登录号 X07282)和 Fas/APOl (GeneBank 登录号 Z70519)、MAPK14 (GeneBank登录号L35253)、Bcl2相关X蛋白(Bax, GeneBank登录号L22474)、FKBP4 (可能的肽基脯氨酰-顺式-反式-异构酶，GeneBank登录号M88279)、线粒体应激70蛋白前体(致死蛋白(Mortalin) 2，GeneBank 登录号 LI5189a)、p57KIP2 (CDK 抑制剂 1C, GeneBank 登录号U22398)、DNA连接酶I (LIG1，GeneBank登录号M36067)、DNA切除修复相关蛋白
I(ERCC5, GeneBank 登录号 L20046a)、G/T 错配胸腺嘧啶 DNA 糖基化酶(TDG，GeneBank 登录号 U51166)、同源盒蛋白 I (H0XD3, GeneBank 登录号 D111117a)和 MAP4K5 (Jun N-末 端激酶的激活因子，GeneBank登录号U77129、复制因子A蛋白I (RPAI，GeneBank登录号M63488)、Bcl2拮抗物/杀伤因子I (BAK1，GeneBank登录号U23765)、TGF-L诱导型早期生长应答基因 CHEG，GeneBank 登录号 S81439a)、MAP2K1 (MEK11. 5 激酶，GeneBank 登录号L05624)、硫酸软骨素蛋白聚糖2 (CSPG2，GeneBank登录号U16306a)和锌指蛋白197 (pl8蛋白，ZNF197, GeneBank 登录号 Z21707a)、腺苷酸激酶 3 (GeneBank 登录号 J04809)、醛缩酶 A (GeneBank 登录号 NM_000034)、醛缩酶 C (GeneBank 登录号 NM_0051654)、烯醇化酶 I (EN01, GeneBank Accession No. NM_001428)、葡萄糖转运蛋白 I (GeneBank 登录号NM_153369)、葡萄糖转运蛋白3 (GeneBank登录号ΝΜ_001009770)、甘油醛_3_磷酸酯脱氢酶(GeneBank登录号NM_002046)、己糖激酶I (GeneBank登录号Nm_000188X)和己糖激酶2 (GeneBank登录号Nm_000189X)、胰岛素样生长因子2 (IGF-2, GeneBank登录号NM_000612)、IGF 结合蛋白 I (IGFBP-1, GeneBank 登录号 ucOOlgkz. I)、IGFBP-3 (GeneBank登录号uc003tnr. I)、乳酸脱氢酶A (GeneBank登录号NM_005566)、磷酸甘油酸激酶I (GeneBank登录号NM_000291)、丙酮酸激酶M(GeneBank登录号M23725)、转化生长因子β 3 (TGF β 3，GeneBank 登录号 ucOOldoh. I)、血浆铜蓝蛋白(GeneBank登录号 NM_000096)、促红细胞生成素(GeneBank登录号NM_000799)、转铁蛋白(GeneBank登录号NM_001063)和转铁蛋白受体(GeneBank登录号NM_003234)、a IB-肾上腺素受体(GeneBank登录号NM_000679)、肾上腺髓质素(GeneBank登录号NM_001124)、内皮素_1 (GeneBank登录号ΝΜ_001101696)、血红素加氧酶 I (GeneBank 登录号 NM_002133)、一氧化氮合酶 2 (GeneBank登录号 uc002gzu. I)和 VEGF 受体 FLT-1 (GeneBank 登录号 NM 001025366)以及 BCL2/ 腺病毒ElB 19kd-相互作用蛋白3样蛋白(BNIP3L, GeneBank登录号NM_004331. 2。在一些实施方案中，所述p53诱导型基因选自TP53、P21、ERCC5、MDM2、TP53I3(PIG3)、NOTCH、PIGF、BTG2、ZMAT3(WIGl)、APAFl、FAS、ANGPTL2、PUMA(BBC3)、IGFBP6、GDF15、BNIP3L、TGF-β 3、VEGF、HIFl a (如表I中所示)并使用IaqMan恥基因表达测定(Applied Biosystems)(也如表I中所示)或使用技术人员普遍接受的等同形式商业或设计引物/探针组进行定量。
在一些实施方案中，所述p53诱导型基因选自TP53、P21、ERCC5、MDM2、TP53I3 (PIG3)、NOTCH、PIGF、BTG2、ZMAT3(WIGl)、APAFU FAS、ANGPTL2、PUMA(BBC3)、IGFBP6、GDF15、BNIP3L、TGF-β 3、VEGF、HIFl α (如表 3 中所示)并使用Assays-on-DemandTM, Applied Biosystems (也如表3中所示)或使用技术人员普遍接受的等同形式商业或设计引物/探针组进行定量。表I :p53诱导型基因
权利要求
1.一种用于检测受试者的与缺氧相关的病状的方法，所述方法包括确定得自所述受试者的生物样品中至少一种P53诱导型基因的无细胞核糖核酸(RNA)的水平，其中高于或低于与所述至少一种P53诱导型基因相关的预定范围的所述无细胞RNA的水平指示所述受试者患有与缺氧相关的病状。
2.一种用于确定受试者的与缺氧相关的病状的严重程度的方法，包括确定得自所述受试者的生物样品中至少一种P53诱导型基因的无细胞RNA的水平和将所述p53诱导型基因的所述无细胞RNA的所述水平与预定范围进行比较，所述预定范围使所述至少一种p53诱导型基因的所述水平与所述与缺氧相关的病状的所述严重程度相关联，所述比较允许确定所述受试者的与缺氧相关的所述病状的所述严重程度。
3.一种用于确定对受试者的与缺氧相关的病状的治疗性治疗的效果的方法，包括确定来自两个或更多个生物样品的至少一种P53诱导型基因的无细胞RNA的水平，所述生物样品在两个或更多个时间点从所述受试者获得，所述时间点中的至少一个在所述治疗期间或之后，其中 (i)对于在与缺氧相关的病状中过表达的P53诱导型基因而言，在所述两个或更多个样品之间所述P53诱导型基因的所述无细胞RNA的所述水平降低指示所述治疗性治疗的效果; ( )对于在与缺氧相关的病状中受抑制的P53诱导型基因而言，在所述两个或更多个样品之间所述P53诱导型基因的所述无细胞RNA的所述水平提高指示所述治疗性治疗的效果O
4.根据权利要求3所述的方法，其中在开始所述治疗之前的时间点取得一个或多个第一样品并且在所述治疗期间或之后的时间点取得一个或多个第二样品。
5.根据权利要求3所述的方法，其中在所述治疗期间的时间点取得一个或多个第一样品并且在所述治疗期间继所述一个或多个第一样品的所述时间点之后的时间点取得一个或多个第二样品。
6.根据权利要求3所述的方法，其中在所述治疗期间的时间点取得一个或多个第一样品而在已中止所述治疗之后的时间点取得一个或多个第二样品。
7.一种用于选择患有与缺氧相关的病状的受试者以接受治疗性治疗以便治疗所述病状的方法，所述方法包括确定得自所述受试者的生物样品中至少一种P53诱导型基因的无细胞RNA的水平和在至少一种p53诱导型基因的无细胞RNA的所述水平高于或低于与所述至少一种p53诱导型基因相关的预定范围的情况下选择所述受试者以接受所述治疗性治疗。
8.一种用于执行根据权利要求I至7中任一项所述的方法的试剂盒，包含至少一种用于扩增来自生物样品的至少一种P53诱导型基因的无细胞RNA的试剂和用于执行根据权利要求I至7中任一项所述的方法的说明书。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其中所述至少一种试剂包含用于与所述至少一种P53诱导型基因特异性杂交的引物或探针。
10.根据权利要求8或9所述的试剂盒，所述试剂盒还包含至少一种用于从生物样品中提取无细胞RNA的试剂。
11.根据权利要求I至7中任一项所述的方法或根据权利要求8至10中任一项所述的试剂盒，其中所述样品为体液样品。
12.根据权利要求11所述的方法或试剂盒，其中所述样品为体液样品，其为血液样品。
13.根据权利要求11所述的方法或试剂盒，其中所述样品为血清样品。
14.根据权利要求11所述的方法或试剂盒，其中所述样品为血浆样品。
15.根据权利要求I至7中任一项所述的方法或根据权利要求8至10中任一项所述的试剂盒，其中至少一种P53诱导型基因的无细胞RNA的水平通过RT-PCR确定。
16.根据权利要求15所述的方法或试剂盒，其中至少一种p53诱导型基因的无细胞RNA的水平通过实时定量RT-PCR确定。
17.根据权利要求I至7中任一项所述的方法或根据权利要求8至10中任一项所述的试剂盒，其中所述与缺氧相关的病状选自心血管疾病、癌症、脑血管意外(CVA)和胎儿窘迫。
18.根据权利要求17所述的方法或试剂盒，其中所述与缺氧相关的病状是胎儿窘迫。
19.根据权利要求17所述的方法或试剂盒，其中所述心血管疾病是心肌梗塞。
20.根据权利要求18或19所述的方法或试剂盒，其中所述至少一种p53诱导型基因选自 TP53 (GeneBank 登录号 Nm_000546)、p21 (GeneBank 登录号 Nm_000389)、ERCC5 (GeneBank登录号 Nm_000123)、MDM2 (GeneBank 登录号 Nm_0006878)、TP53I3 (GeneBank 登录号Nm_004881)、NOTCHl (GeneBank 登录号 Nm_017617)、PIGF(GeneBank 登录号 Nm_002643)、BTG2 (GeneBank 登录号 Nm_006763)、ZMAT3 (GeneBank 登录号 Nm_0022470)、APAFl (GeneBank登录号 Nm_013229)、FAS (GeneBank 登录号 Nm_l52873)、ANGPTL2 (GeneBank 登录号Nm_012098)、PUMA (GeneBank 登录号 Nm_014417)、IGFBP6 (GeneBank 登录号 Nm_002178)、⑶F15 (GeneBank 登录号 Nm_004864)、BNIP3L (GeneBank 登录号 Nm_004331. 2)、TGF β 3 (GeneBank 登录号 Nm_003239)、VEGF (GeneBank 登录号 Nm_001025366)和 HIF-1 α。
21.根据权利要求20所述的方法或试剂盒，其中所述至少一种ρ53诱导型基因选自p21 (GeneBank 登录号 Nm_000389)、BTG2 (GeneBank 登录号 Nm_006763)、HIF-I a (GeneBank登录号 Nm_001530)、NOTCHl (GeneBank 登录号 Nm_017617)、TGF β 3 (GeneBank 登录号Nm_003239)和 ZMAT3 (GeneBank 登录号 Nm_0022470)。
22.根据权利要求20所述的方法或试剂盒，其中所述至少一种p53诱导型基因是p21 (GeneBank 登录号 Nm_000389)。
23.根据权利要求20所述的方法或试剂盒，其中所述至少一种p53诱导型基因是BTG2 (GeneBank 登录号 Nm_006763)。
全文摘要
本发明提供用于检测受试者的与缺氧相关的病状的方法、用于确定与缺氧相关的病状的严重程度的方法、用于确定对与缺氧相关的病状的治疗性治疗的效果的方法以及用于选择患有与缺氧相关的病状的受试者以接受治疗性治疗的方法，其中本发明的方法基于测量受试者中p53诱导型基因的无细胞核糖核酸(RNA)的水平。本发明还涉及用于执行本发明的方法的试剂盒。
文档编号C12Q1/68GK102933723SQ201180028167
公开日2013年2月13日 申请日期2011年6月6日 优先权日2010年6月7日
发明者奥斯娜特·阿舒尔-费边 申请人:奥斯娜特·阿舒尔-费边