专利名称：一种植物气孔特异性启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种植物气孔特异性启动子及其应用。
背景技术：
启动子(Promoter)是基因组基因的一个重要组成部分，它像“开关” 一样，在转录水平上基本决定其控制下的编码基因是否表达、何时表达、何处表达和表达强度。一般根据启动子作用方式和功能将其大体可以分为三大类组成型启动子、特异性启动子和诱导型启动子(王关林，方宏筠，2002，植物基因工程原理与技术(第二版)，北京，科学技术出版社)。但这种分类不是绝对的，在某些情况下，一种类型的启动子往往兼有其它类型启动子的特性，例如，诱导增强性组成型启动子(肖兴国等，发明专利号200710177962. 4)。组成型启动子(Constitutive promoter)是指能够驱使其控制下的编码基因在不同器官和/或组织大体恒定表达的一类启动子。它的特点是受其控制的编码基因的表达具有持续性，但不具有时空特异性；RNA和蛋白质表达量相对恒定，不受外界因素的诱导。 例如花椰菜花叶病毒 35S 启动子 CaMV35S(0dell et al.，Nature，1985，313 :810_812)、 玉米 Ubiquitin 启动子(Holtorf et al.，Plant Mol. Biol.，1995，29 :637_646)和水稻的 Actinl 启动子(McElroy et al，1990，Plant Cell, 2 :163_171)。诱导型启动子(Inducible promoter)是指能够响应某些特定的物理、化学和生物信号(统称为“诱导子”或“诱导因子”)而驱动其控制的编码基因大幅度地增加转录水平的一类启动子。它的特征为，在没有诱导因子存在的条件下，它控制的编码基因不表达或者只有非常低的表达(也称为“本底表达”)，但一旦受到诱导因子的诱导，基因的表达量迅速并且大幅度增加。诱导型启动子常常根据其诱导信号来分类和命名，例如真菌诱导启动子、共生细菌诱导启动子、化学诱导启动子、金属离子诱导启动子、光诱导启动子、热诱导启动子和创伤诱导启动子等。器官和/或组织特异性启动子(0rgan-and/or Tissue-specific promoter)，能够驱使其控制下的编码基因仅仅在生物体的某一或某些特定的器官和/或组织，或者仅仅在生长发育的某一或某些特定阶段表达的一类基因。它的特征为，受其控制或调节的基因表达具有明显的时空性，并往往表现出发育调节的特性。例如，植物上的根特异性启动子、叶片特异性启动子、花特异性启动子、气孔特异性启动子、气孔绒毡层特异性启动子、花粉特异性启动子、果实特异性启动子、种子特异性启动子、胚乳特异性启动子、棉花纤维特异性启动子和韧皮部特异性启动子等等。气孔(Stomatal pore)是植物与外界环境进行气体交换的门户，也是水分蒸腾的通道。植物进行光合作用所必需的CO2依靠气孔进入体内，而呼吸作用所产生的O2则依靠气孔排除到体外。此外，植物的水分蒸腾也依靠气孔作为主要通道。因此，气孔的开关控制着植物的蒸腾作用、光合作用和呼吸作用等重要生理过程。一般植物的气孔 由一对保卫细胞组成，有些植物中还有副卫细胞(Subsidiary cells)围绕着这一对保卫细胞，组成气孔复合体(Stomatal complex)或称气孔器(Stomaltal apparatus) 0气孔分布在植物的地上部分，主要集中在叶片。组成气孔的保卫细胞是一种高度分化的细胞，在大多数双子植物和一些单子叶植物、裸子植物、蕨类和藓类上呈肾形，而在禾本科植物和几种苔草上则呈哑铃形。保卫细胞的体积比叶表皮细胞和叶肉细胞的体积小得多。它的细胞壁按其和相邻细胞的相对位置而命名背壁(Dorsal wall)，指和表皮细胞相邻的壁；腹壁(Ventral wall)，与背壁相对、近孔处的壁；外侧壁 (Outer lateral wall)，靠叶片外表面的壁；内侧壁(Inner lateral wall)，靠气孔下腔的壁。保卫细胞的壁各处厚薄不均，一般背壁薄而腹壁特别加厚。这样，在细胞膨压大时， 保卫细胞呈弯月形，气孔开放；在细胞膨压小时，保卫细胞呈直肾形或圆柱形，气孔关闭 (Wilmer and Fricker，1996，Stomata，Ed Chapman and Hall，London，1-375)。保卫细胞正是通过自身的膨压大小的改变而改变自身体积的大小和形状来调控气孔的开、关和张开程度以应对其感受的外界环境中的生物和非生物刺激(例如々8々、0)2和干旱等)以及由自身植物根传来的信号(Bergmann and Sack FD, 2007, Annu Rev Plant Biol，58 :163_81)。 引起这种自身的膨压大小的改变及由此导致的自身体积大小和形状的改变的机理，一般认为，主要是通过细胞膜和液泡膜的一些通道蛋白进行的跨膜离子和水的运输(Pandey et al.,2007, FEBS Lett,581 2325-36 ；Schroeder et al.，2001，Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol，52 :627_58)。在C3和C4植物上，能够引起气孔开放的主要环境因子有 蓝光、红光、高湿和低 CO2 (Marten et al，2007，Plant J, 2007. 50 129-139 ；Shimazaki et al, 2007, Annu Rev Plant Biol，58 :219_47)；能够引起气孔关闭的主要环境因子有黑暗、干旱、高 CO2 和高臭氧浓度(Sirichandra et al，2009，J Exp Bot，60 1439-63)。此夕卜，内源激素 ABA 能够引起气孔关闭(Wilkinson and Davies，2002，Plant Cell Env,25 195-210 ；Israelsson M et al, 2006，Curr Opin Plant Biol，9 :654_63)，其它激素，如生长素、激动素、乙烯、芥末酸和油菜素内酯，对气孔的开关也都有一定的影响(Acharya and Assmann，2009，Plant Mol Biol. 69 :4451_4462 ；Kim et al，2010，Annu Rev Plant Biol, 61 561-591)气孔运动(开和关)是一个非常复杂的生理过程，有人认为它是植物适应环境变化的一种主动调节，也有人认为是被动调节，并且都有一定的实验结果作为支撑。无论是主动调节还是被动调节，人们都希望从调控气孔开关运动入手，提高植物的节水抗旱能力和光合效率[李军等，中国科学C辑生命科学，2004，34 (4) :299-303]，从而提高植物、特别是作物的产量和品质。为此，鉴定、分离和功能研究保卫细胞特异性基因及其主要调控者-启动子的研究在全世界展开。Zhao 等从 22000 多株拟南芥(Arabidopsis thaliana)中分离到 3X IO8 个保卫细胞叶绿体，由此鉴定出1734种独特蛋白[Zhao et al. 2008，Plant Cell,20(12) 3210-3226]。一些保卫细胞优势表达和/或特异性表达的蛋白和/或其编码基因，如拟南芥 Aktl (Sentenac et al, 1992, Science，256 :663_665)、Katl (Anderson et al, 1992, PNAS，89 3736-3740)和 TPCl(Rienmuller et al，2010，Plant and Cell Physiol,51 91548-91554)以及马铃薯Kstl (MulIer-Roeber et al, 1995,EMBO J, 14 2409-2416)等陆续被鉴定和/或克隆。随着这些基因的克隆，其主要调控区域_启动子的鉴定、分离、重组和功能研究方面，近年来取得了明显的进展。例如，Katl启动子(Nakamura et al,1995, Plant Physiol, 109 :371-374)、Kstl (Plesch et al，2000，Gene, 249 :83 89)、Abhl 启动子(Hugouvieux et al.，Cell, 2001,106 :477_487)、Chll 启动子(Guo et al.，Plant Cell，2001，13 :1761-1777)、0sml 启动子(Zhu et al. ,Plant Cell，2002，14 :3009_3028)、 Ostl 启动子(Mustilli et al.，Plant Cell，2002，14 :3089_3099)，Racl (Lemichez et al.，Genes Dev.，2001，15 :1808_1816)、SLACl 启动子(Vahisalu et al，2008，Nature， 452 :487-491)、CDeT6-19启动子以及拟南芥单加氧酶基因CYP86A2启动子(Taylor et al, 1995,Plant Journal,7(1) 129-134 ；Galbiati et al,2008,Plant Journal, 53 750-762. Francia et al，2008，Plant Signaling & Behavior，3 (9) :684_686)等。然而，这些启动子虽然能够驱动其控制的基因在气孔强势表达，但同时也在它组织和器官有不同程度的表达。也就是说，它们还缺乏气孔表达的特异性。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物气孔特异性启动子及其应用。本发明所提供的植物气孔特异性启动子来源于海岛棉(Gossypium barbadense L.)，是下述a)或b)或c)的DNA片段a)3'端至少含有序列表中序列1的第529-993位核苷酸序列(GbSLSP_F5)，并且从序列1的第529位开始、按照序列1的核苷酸序列向序列1的5'端延长，得到长度为465 至993bp的任意一个DNA片段；所述DNA分子具有启动子功能；b)与a)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同源性，且具有启动子功能的 DNA片段；c)在严格条件下与a)或b)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA片段。所述严格条件是在2XSSC，0. 1% SDS的溶液中，在68°C下杂交并洗膜2次。每次 5min. 0. 5X SSC, 0. 1% SDS的溶液中，在68°C下杂交并洗膜2次。每次15min。所述启动子的最后一位核苷酸是序列1的第993位。所述启动子为下述1)-3)中任一种1)核苷酸序列的3'端至少含有序列表中序列1的第511-993位核苷酸序列 (GbSLSP-F4)，并且从序列1的第511位开始、按照序列1的核苷酸序列向序列1的5'端延长，得到长度为483至993bp的任意一个DNA片段；2)核苷酸序列的3'端至少含有序列表中序列1的第401-993位核苷酸序列 (GbSLSP-F3)，并且从序列1的第401位开始、按照序列1的核苷酸序列向序列1的5'端延长，得到长度为593至993bp的任意一个DNA片段；3)核苷酸序列的3'端至少含有序列表中序列1的第346-993位核苷酸序列 (GbSLSP-F2)，并且从序列1的第346位开始、按照序列1的核苷酸序列向序列1的5'端延长，得到长度为648至993bp的任意一个DNA片段。在本发明的实施例中，所述启动子具体为下述al)_a5)中任一种 al)核苷酸序列为序列表中序列1所示的DNA分子(GbSLSP)；a2)核苷酸序列为序列表中序列1的第346-993位核苷酸所示DNA分子 (GbSLSP-F2)；a3)核苷酸序列为序列表中序列1的第401-993位核苷酸所示DNA分子(GbSLSP-F3)a4)核苷酸序列为序列表中序列1的第511-993位核苷酸所示DNA分子 (GbSLSP-F4)；a5)核苷酸序列为序列表中序列1的第529-993位核苷酸所示DNA分子 (GbSLSP-F5)。本发明提供的植物气孔特异性启动子，还可以是下述d)或e)或f)的DNA片段d) 3 ‘端至少含有序列表中序列1的第346-634位核苷酸序列(GbSLSP-SH)，并且从序列1的第346位开始、按照序列1的核苷酸序列向序列1的5'端延长，得到长度为289 至634bp的任意一个DNA片段；所述启动子的最后一位核苷酸是序列1的第634位；e)与d)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同源性，且具有启动子功能的 DNA片段；f)在严格条件下与d)或e)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA片段。所述严格条件是在2XSSC，0. 1% SDS的溶液中，在68°C下杂交并洗膜2次。每次 5min. 0. 5X SSC, 0. 1% SDS的溶液中，在68°C下杂交并洗膜2次。每次15min。在本发明的实施例中，所述启动子具体为下述bl)或b2 bl)核苷酸序列为序列表中序列1的第1-634位核苷酸所示的DNA分子 (GbSLSP-SH)；b2)核苷酸序列为序列表中序列1的自第346-634位核苷酸所示DNA分子 (GbSLSPF2-SH)。对GbSLSP启动子(序列表中序列1)进行5’端删除分析得到的仍然具有气孔特异性驱动能力的启动子序列。其中，GbSLSP-F5(序列表中序列1的第529-993位核苷酸) 为GbSLSP启动子5’端删除直到转录起始位点(序列表中序列1自5'端第625位核苷酸) 上游96bp仍具有气孔特异性启动子活力的小片段，是GbSLSP启动子的核心片段。对GbSLSP(序列表中序列1)进行3'端删除分析得到的仍然具有气孔特异性驱动能力的启动子序列。其中，GbSLSPF2-SH(序列表中序列1的第346-634位核苷酸序列)为 GbSLSP启动子3'端删除直到距离转录起始位点(序列表中序列1自5'端第625位核苷酸)9bp仍具有气孔特异性启动子活力的小片段。GbSLSP启动子由993个脱氧核苷酸组成，其核苷酸序列为序列表中序列1，其中第594-599位脱氧核苷酸为TATA盒(TATA box)，第625位脱氧核苷酸为转录起始位点，第 626-993位脱氧核苷酸为5'端非翻译区(5‘ -UTR)。GbSLSP_F2启动子由648个脱氧核苷酸组成，其核苷酸序列为序列表中序列1的第 346-993位。其中序列1的第594-599位脱氧核苷酸为TATA盒(TATA box)，第625位脱氧核苷酸为转录起始位点，第626-993位脱氧核苷酸为5'端非翻译区(5‘ -UTR)。GbSLSP_F3启动子由593个脱氧核苷酸组成，其核苷酸序列为序列表中序列1的第 401-993位。其中序列1的第594-599位脱氧核苷酸为TATA盒(TATA box)，第625位脱氧核苷酸为转录起始位点，第626-993位脱氧核苷酸为5'端非翻译区(5‘ -UTR)。GbSLSP_F4启动子由483个脱氧核苷酸组成，其核苷酸序列为序列表中序列1的第 511-993位。其中序列1的第594-599位脱氧核苷酸为TATA盒(TATA box)，第625位脱氧核苷酸为转录起始位点，第626-993位脱氧核苷酸为5'端非翻译区(5' -UTR)。GbSLSP-F5启动子由465个脱氧核苷酸组成，其核苷酸序列为序列表序列1的第 529-993位。其中序列1的第594-599位脱氧核苷酸为TATA盒(TATAbox)，第625位脱氧核苷酸为转录起始位点，第626-993位脱氧核苷酸为5'端非翻译区(5‘ -UTR)。GbSLSP-SH启动子由634个脱氧核苷酸组成，其核苷酸序列为序列表序列1的第 1-634位。其中序列1的第594-599位脱氧核苷酸为TATA盒(TATAbox)，第625位脱氧核苷酸为转录起始位点，第626-634位脱氧核苷酸为5'端非翻译区(5‘ -UTR)。GbSLSPF2_SH启动子由289个脱氧核苷酸组成，其核苷酸序列为序列表序列1的第 346-634位。其中序列1的第594-599位脱氧核苷酸为TATA盒(TATA box)，第625位脱氧核苷酸为转录起始位点，第626-634位脱氧核苷酸为5'端非翻译区(5‘ -UTR)。从海岛棉(Gossypium barbadense)中分别克隆得到GdSLSP全长启动子，并对其进行功能分析，产生了本发明。含有上述启动子的遗传材料或获得所述启动子的一个引物对也属于本发明的保护范围。所述遗传材料为表达盒、重组表达载体、重组菌、转基因植物细胞或组织或器官在所述表达盒中，所述气孔特异性启动子的下游连接结构基因，或调节基因，或结构基因或调节基因的反义基因，或者能够干扰内源基因表达的小RNA的编码DNA，用于驱动结构基因，或调节基因，或结构基因或调节基因的反义基因，或者天然小RNA或人工合成的小RNA的表达。所述重组表达载体是含有上述表达盒，例如但不限于质粒和病毒。所述重组表达载体也可为重组植物表达载体。所述重组植物表达载体含有上述表达盒并且能够将所述的表达盒转送进入植物宿主细胞、组织或器官及其后代并且能够或者至少方便所述的表达盒整合到宿主的基因组中，它包括但不限于双元载体、共合载体。在本发明的实施例中，所述重组表达载体具体为在PBI121质粒的多克隆位点插入所述启动子的核苷酸序列得到的重组质粒。所述重组表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导或基因枪等常规生物学方法转化植物器官或组织或细胞，得到转基因植物细胞或组织或器官及由此分化、再生的完整植株及其无性系或其后代。在本发明的实施例中，具体使用的是农杆菌介导法。在本发明的实施例中，所述引物对具体为下述cl)_c5)中的任一对cl)序列表中序列3的第7-30位核苷酸所示DNA片段和序列2的第7_27位核苷酸所示DNA片段组成的引物对；c2)序列表中序列3的第7-30位核苷酸所示DNA片段和序列5的第7_21位核苷酸所示DNA片段组成的引物对；c3)序列表中序列3的第7-30位核苷酸所示DNA片段和序列6的第7_28位核苷酸所示DNA片段组成的引物对；c4)序列表中序列3的第7-30位核苷酸所示DNA片段和序列7的第7_34位核苷酸所示DNA片段组成的引物对；c5)序列表中序列8的第7-22位核苷酸所示DNA片段和序列2的第7_27位核苷酸所示DNA片段组成的引物对。所述启动子在植物中启动目的基因表达中的应用也属于本发明的保护范围。
所述植物是陆生植物，优选是双子叶植物，更优选是拟南芥或烟草；所述表达为气孔特异性表达。实验证明，本发明所提供的启动子(包括GbSLSP-F2、GbSLSP-F3、GbSLSP-F4)均可启动报告基因GUS和/或GFP (绿色荧光蛋白)在烟草和/或拟南芥的气孔中特异表达，说明本发明所提供的启动子具有良好的气孔特异性。同时经相关实验还证明该特异性能够稳定地传递给后代。将本发明的启动子下游衔接内源基因、外源基因及其反义基因或能够干扰内源基因表达的小RNA(包括天然的和人工合成的小RNA)的编码DNA，构建表达盒并与不同的表达载体连接，转化到植物中，利用其气孔异性表达活性，在气孔中特异性表达其控制或指导的所述内源基因、外源基因及其反义基因或小RNA。在转基因植株中使其内源基因、外源基因及其反义基因或能够干扰内源基因表达的小RNA(包括天然的和人工合成的小RNA)的表达局限于气孔中，排除了这些基因在植体其它组织或器官的表达。利用本发明的启动子的气孔特异性表达活性，用含有本发明启动子或该启动子与内源基因与外源基因及其反义基因、能够干扰内源基因表达的小RNA(包括天然的和人工合成的小RNA)编码DNA的表达载体转化宿主细胞或宿主组织及其后代细胞，并由此再生完整的转基因植株，培育耐旱、耐高或低浓度CO2、抗真菌病害和高光合效率的植物或作物品种。所述植物是显花植物，包括但不限于陆生植物、被子植物和裸子植物、单子叶植物和双子叶植物、草本植物、藤本植物和木本植物、园林园艺植物和农作物及牧草植物、一年生植物和多年生植物以及有性和无性繁殖植物，优选为陆生植物。本发明的气孔特异性启动子可用于功能分析、鉴定和分离植物气孔形成和发育所必须的基因和调控气孔运动的基因，同时可以用于培育耐旱、耐高或低CO2、抗真菌病害、高光合效率和高产优质的植物或作物品种。具体可在本发明的气孔特异性启动子下游衔接异源或同源基因或其反义基因或小RNA编码DNA，并构建到植物表达载体，转化宿主植物，在其气孔表达目的蛋白、抑制或干扰目标基因的转录或翻译，以开或关气孔或者增强或降低气孔的开关程度。本发明分离的气孔特异性启动子对植物气孔生长和发育基因的功能分析和鉴定、培育耐旱、耐高或低CO2、抗真菌病害、高光合效率和高产优质的植物或作物品种等都具有重大的应用前景。本发明这不仅对气孔和保卫细胞的分子生物学研究和气孔运动等的理论研究具有重要的意义，而且在培育抗旱和抗病作物而去提高作物的光合效率进而提高产量和品质等方面具有重大的应用价值和广阔的市场前景。
图1为GbSLSP启动子全长克隆的PCR产物电泳图。其中泳道M为分子量标记 λ DNA/EcoRI+Hind III ；泳道1为引物1和引物2双引物PCR扩增产物；泳道2为引物1单弓丨物PCR扩增产物；泳道3为引物2单引物PCR扩增产物；泳道4为无模板DNA的双引物 PCR扩增对照。图2为外加酶切位点的GbSLSP启动子全长序列图。其中，下划线部分为外加的限制性内切酶识别位点(5'端为Hind 111,3'端为BamH I)；方框处为TATA盒；加粗带底纹的“A”为转录起始位点；加粗斜体的碱基为序列自身的Hind III酶切位点。图3为气孔特异性启动子GbSLSP驱动报告基因⑶S或GFP的植物表达载体图谱。 A为GbSLSP驱动报告基因GUS的植物表达载体，其中pGbSLSP-GUS表示pBI-GbSLSP-GUS， B为GbSLSP驱动报告基因GFP的植物表达载体，其中pGbSLSP-GFP表示pBI_GbSLSP_GFP。图4为转pBI-GbSLSP-GUS的烟草Ttl代植株PCR鉴定 图。其中，泳道M为DNA大小分子标记λ DNA/EcoR I+Hind III ；泳道1_8为转基因烟草Ttl代8个独立的单株；泳道9 为载体质粒(pBI-GbSLSP-GUS)对照；泳道10为未转基因的烟草NC89对照；泳道11为蒸馏水为模板的对照。图5为转pBI-GbSLSP-GUS拟南芥T1代植株的PCR鉴定图。其中，泳道M为DNA 大小分子标记λ DNA/EcoR I+Hind III ；泳道1_8为转基因拟南芥T1代8个独立的单株 (其中泳道1、4、5、6、7对应的T1代拟南芥植株为GbSLSP阳性植株)；泳道9为载体质粒 (pBI-GbSLSP-GUS)对照；泳道10为未转基因的拟南芥对照；泳道11为蒸馏水为模板的对照。图6为转pBI-GbSLSP-GUS烟草Ttl代植株的叶片圆盘的⑶S染色图。其中，A为转 pBI-GbSLSP-GUS烟草Ttl代植株的叶圆盘；a为A所示叶圆盘的局部放大照片。图7为转pBI-GbSLSP-GUS烟草T1代植株幼苗⑶S染色图。其中A为 pBI-GbSLSP-GUS烟草T1代幼苗整株的⑶S染色照片；a为A所示幼苗对应株的真叶⑶S染色的局部放大照片。图8为转pBI-GbSLSP-GUS拟南芥T1代植株不同器官的⑶S染色图。其中，A为花序；B为花；C为柱头；D为花药；E为茎；F为花梗；G为花萼；H为果夹；I为叶片J为I的局部放大照片。 图9为转pBI-GbSLSP-GFP基因烟草Ttl代植株叶片的GFP共聚焦激光扫描显微图。图10为气孔特异性启动子GbSLSP的5'端删除和3'端删除不同长度后的各个片段(GbSISP-F2、GbSISP-F3、GbSLSP_F4、GbSLSP_F5、GbSLSP-SH 和 GbSISPF2_SH)与全长启动子(GbSLSP)之间的关系示意图。其中，位于转录起始位点(TSS)上游(即左端)的数据-X表示GbSLSP经过5'端删除后残留的核苷酸片段的长度。图11气孔特异性启动子GbSLSP 5'端删除和3'端删除不同长度后的各个片段连接在PBS-T载体上的酶切电泳图。其中，泳道Ml和M2分别为DNA分子量标记λ DNA/ EcoRI+Hindlll 和 Marker I (IOObp 标记)；泳道 1 至 7 分别为 pBS-GbSLSP、pBS-GbSLSP_SH、 pBS-GbSLSP-F2、pBS-GbSLSP-F3、pBS-GbSLSP-F4、pBS-GbSLSP-F5 的 Hind III 和 BamH I 双
酶切结果。图12为气孔特异性启动子GbSLSP 5'端删除和3'端删除不同长度后的各个片段连接到PBI121载体上的PCR鉴定电泳图。其中，泳道Ml和M2分别为DNA分子量标记 λ DNA/EcoRI+HindIII 和 Marker 1 (IOObp 标记)；泳道 1 至 7 分别为 pBI-GbSLSP、 pBI-GbSLSPF2、 pBI_GbSLSP_SH、 pBI_GbSLSPF3、 pBI_GbSLSPF4、 pBI_GbSLSPF5、 pBI-GbSLSPF2-SH 的 PCR 产物电泳图。图13为转GbSLSPX-⑶S (F = 2、3、4、5、-SH或F2-SH)基因烟草Ttl代植株叶片和花的⑶S染色图。其中，F2表示GbSLSPF2-GUS在转基因烟草Ttl代植株驱动⑶S基因表达的⑶S染色图；F3表示GbSLSPF3-GUS在转基因烟草Ttl代植株驱动⑶S基因表达的⑶S 染色图；F4表示GbSLSPF4-GUS在转基因烟草Ttl代植株驱动⑶S基因表达的⑶S染色图； F5表示GbSLSPF5-GUS在转基因烟草Ttl代植株驱动⑶S基因表达的⑶S染色图；F-SH表示GbSLSP-SH-GUS在转基因烟草Ttl代植株驱动⑶S基因表达的⑶S染色图；F2-SH表示 GbSLSPF2-SH-GUS在转基因烟草Ttl植株驱动⑶S基因表达的⑶S染色图。F2至F2-SH共6 个系列图中，均是左侧(A)为叶盘的GUS染色图，中间(a)为左侧(A)图片的局部放大图， 右侧⑶为花的GUS染色图。图 14 为转 GbSLSPX-GUS (F = 2、4、5、-SH 或 F2-SH)基因烟草 T1 代幼苗的 GUS 染色图。其中，F2表示GbSLSPF2-GUS在转基因烟草T1代植株驱动⑶S基因表达的⑶S染色图；F4表示GbSLSPF4-GUS在转基因烟草T1代植株驱动⑶S基因表达的⑶S染色图； F5表示GbSLSPF5-GUS在转基因烟草T1代植株驱动⑶S基因表达的⑶S染色图；F-SH表示GbSLSP-SH-GUS在转基因烟草T1代植株驱动⑶S基因表达的⑶S染色图；F2-SH表示 GbSLSPF2-SH-GUS在转基因烟草T1代植株驱动⑶S基因表达的⑶S染色图。上述F2至F2-SH 的5个系列图中，均是上方(A)为转基因烟草T1植株幼苗整株的GUS染色图，下方(B)为上方(A)的真叶局部放大图。图15为转GbSLSPX-⑶S (X = 2,5)基因拟南芥T1代植株不同器官的气孔特异性表达的⑶S染色图。其中，F2表示GbSLSPF2-GUS在转基因拟南芥T1代植株驱动⑶S基因表达的⑶S染色图；F5表示GbSLSPF5-GUS在转基因拟南芥T1代植株驱动⑶S基因表达的 GUS染色图。A为花絮；B为花；C为柱头；D为花药；E为茎；F为花梗；G为花萼；H为果夹； I为叶片。图16为转GbSLSPF2_GUS基因拟南芥1~2代幼苗⑶S染色图。其中，A为幼苗整株； B为子叶；b为B的局部放大图；C为真叶；c为C的局部放大图。图17转GbSLSPX-GFP (F = 2、3、4、5、-SH或F2-SH)基因烟草Ttl代植株叶片气孔特异性表达的GFP共聚焦激光扫描显微图。其中，A表示GbSLSPF2-GFP在转基因烟草Ttl代植株驱动GFP基因表达的共聚焦激光扫描显微图；B表示GbSLSPF3-GFP在转基因烟草Ttl代植株驱动GFP基因表达的共聚焦激光扫描显微图；C表示GbSLSPF4-GFP在转基因烟草Ttl代植株驱动GFP基因表达的共聚焦激光扫描显微图；D表示GbSLSPF5-GFP在转基因烟草Ttl代植株驱动GFP基因表达的共聚焦激光扫描显微图；E表示GbSLSP-SH-GFP在转基因烟草Ttl 代植株驱动GFP基因表达的共聚焦激光扫描显微图；F表示GbSLSPF2-SH-GFP在转基因烟草Ttl代植株驱动GFP基因表达的共聚焦激光扫描显微图。图18为用于构建GbSLSPX-GFP (F = 2、3、4、5、_SH或F2-SH)系列载体所用的GFP 基因的核苷酸序列。
具体实施例方式本发明中所述的启动子核苷酸序列可以是其中一个或多个核苷酸发生取代、缺失、插入或倒位的核苷酸序列，即所分离的核苷酸序列的人工突变体或“天然”突变体，它保留其启动子功能；还可以是所述的核苷酸序列与其它启动子序列或启动子区保守调控序列 (“motif”或“box”)的融合序列。本发明中所述的“启动子”为具有TATA盒(TATAbox)的启动子；TATA盒或类似区域，定位于转录起始位点(TSS，在核苷酸计数上为“+1”)上游并且具有指导RNA聚合酶在正确位置上启动转录的功能，但不限于该区域附近的部分；此外，它还可含有与除RNA聚合酶以外的蛋白质相关联的用于调节表达的另一个必须区域。本发明中所述的“启动子区域”定义为含有上文中定义的启动子的区域和转录起始位点下游至少 10个核苷酸的区域。本发明中所述的“启动子活性”是指当以某种基因的可表达方式将其连接到启动子的下游，并导入到宿主中，该宿主显示具有在宿主内或宿主外生产该基因产物的能力和功能时，该启动子具有启动活性。通常，是将编码容易定性或定量检测的蛋白质的基因(例如，报告基因)连接到该启动子的下游，将该基因导入宿主内，并检测所表达的蛋白质，可确定特定启动子的活性或是否存在该启动子或者该启动子的效力。本发明中所述的结构基因是指能够编码某种蛋白质或其它活性物质功能的一段核苷酸序列，包括RNA 或DNA序列。所述的调节基因是指其编码的某种RNA或蛋白质或其它活性物质能够对其它结构基因的表达进行调节或调控的一段核苷酸序列，包括RNA或DNA序列。所述的正义基因包括上述的结构基因和调节基因。所述的反义基因是指与上述结构基因或调节基因编码的RNA互补的RNA或DNA序列。所述的内源基因是指来自宿主自身的基因，包括RNA或DNA 序列。所述外源基因是指任何一段核酸序列，并具有编码某种蛋白质或其它活性物质功能， 包括天然的和人工合成的RNA或DNA序列，该序列与气孔特异性启动子在正常情况不相结合。所述的小RNA是指分离自生物体的或人工合成的RNA序列片段，其长度通常为20-26 个脱氧核苷酸或者在导入宿舍细胞后能够被剪切成20-26个脱氧核苷酸的RNA片段，它本身对生物体无毒或毒性极低本发明中所述的转化是指现有技术中已知的、能够将外源基因导入植物细胞或植物组织的任何一种植物转化方法，如农杆菌介导法和基因枪等。本发明中所述的宿主细胞或宿主组织或宿主器官及其后代细胞是指所有植物细胞或植物组织或植物器官或由这些细胞、组织或器官通过组织分化或无性胚再生并且发育成熟的整体植株(包括种子)。术语“核酸序列，，或“核苷酸序列，，指含有天然存在的核苷酸或核苷单体的序列。 该序列也包括具有相似功能的非天然存在的单体或其部分的修饰的或取代的序列。术语“气孔特异性启动子”是指能够指导其控制下的基因仅仅在气孔表达而在植体的其它组织不表达或按照常规方法检测不到表达的启动子。术语“具有75%或75%以上同源性的序列”是指与上述启动子的核苷酸序列相比有75%或75%以上的核苷酸序列相同或相似的那些核酸序列或核苷酸序列，这些序列以基本相同的方式发挥作用并且能够驱动其下游基因的气孔特异性表达，它们与上述启动子中序列的差异可能是由于局部结构上的修饰或突变，包括人工突变和非人工突变。术语“严谨杂交条件”是指本领域技术人员已知的，或者可以在分子生物学或基因工程实验指南，例如《Molecular Cloning》GlrdEd) (Sambrook 等，Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 2001)(以下简称“《分子克隆》第三版”)中的通用方案中找到，具体为在2XSSC，0. SDS的溶液中，在68°C下杂交并洗膜2次。每次5min. 0. 5X SSC, 0. 1% SDS的溶液中，在68 °C下杂交并洗膜2次。每次15min。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。烟草Ttl代表示由愈伤组织得到的转基因植株及其无性系,T1表示Ttl代自交产生的种子及由它所长成的植株和无性系；拟南芥T1代表示通过直接“蘸花”侵染后产生的种子发芽形成的植株及其无性系。实施例1、海岛棉气孔特异启动子SLSP(GbSLSP)的克隆与分离1、海岛棉总DNA的提取
材料取自海岛棉(Gossypium barbadense L.)品种“SHZ2-214”(从新疆石河子大学购得)，嫩叶片l_2g，用CTAB法(《分子克隆》第三版)提取总DNA。取1_5 μ 1 DNA样品，用紫外分光光度计测量其浓度和纯度，用0. 8%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度和完整性。将提取的DNA于-20°C保存。2、PCR扩增与扩增片段的回收设计并合成如下两条引物(引物1和引物2)扩增海岛棉气孔特异性启动子，为了方便以后的克隆和构建，在两条引物的5'端分别加入了限制性内切酶Hind III和BamH I 的识别序列位点(下列引物序列中的下划线序列)引物 1 :5 ‘ -AAGCTTACAACTTTTCTCTACCAATCA-3 ‘ (Hind III)(序列 2)；引物 2 5 ‘ -GGATCCGCTAGAGAAAAATGGGAAGGTGAG-3 ‘ (BamH I)(序列 3)。以步骤1提取的棉花基因组DNA为模板，进行PCR反应反应体系为模板DNA 800ng ； 10 XEx buffer 2 μ 1 ；dNTP 混合物(2. 5mM) 2 μ 1 ； ExTaq DNA Polymerase (5U/μ 1)0. 5μ 1 ；引物 1(10μΜ)2μ 1 ；引物 2 (10 μ Μ) 2 μ 1 ；无菌重蒸馏水(SddH2O)补足至20 μ 1。PCR反应程序先94°C预变性5min ；然后94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸 Imin, 30个循环。PCR结果如图1所示，PCR反应完成后，取15 μ 1扩增产物经1. 0%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下快速用一次性刀片小心切下位于DNA标记IOOObp左右的特异片段，用DNA片段回收试剂盒回收并纯化(北京鼎国公司产品)，溶于50μ1 ddH20中，-20°C保存备用。3、回收片段的亚克隆与测序采用两步连接法将上述步骤2回收的片段插入到载体pBS-T载体(北京天根公司产品)。具体操作为用Hind III和BamH I双酶切上述步骤2回收的片段，得到大小约为650bp和350bp的两条带(由于回收片段(序列如图2所示)内部含有一个HindIII 酶切位点)。先回大小约为650bp的片段(Hind III和BamH I之间的片段)，插入经过 HindiII-BamHI双酶切的pBS_T载体，形成pBS_Gb650 ；然后回收两个Hind III之间的大小约为350bp的片段，插入经过Hind III单酶切的pBS_Gb650，形成pBS_Gb650+350，通过测序鉴定插入方向。将得到的重组质粒(pBS_Gb650+350)通过“冻融法”转化到大肠杆菌菌株DH5 α 感受态细胞。转化的DH5 α在表面涂有IPTG和Χ-gal的含氨苄青霉素50mg/L的LB固体培养基上于37°C过夜培养，挑取平板上生长的白色菌落，接入氨苄青霉素50mg/L的LB液体培养基中于37°C过夜培养。当菌液浓度达到0D_为0. 8时，离心收集菌体，按小量碱裂解法(《分子克隆》第三版)提取质粒，用限制性酶Hind III和BamH I双酶切后，用1.0% 琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下可见分子大小大约分别为3000bp(载体带)、650bp(目标带 1)和350bp(目标带2)三条带。将酶切验证正确的克隆和由此克隆提取的质粒送交商业测序公司测序。将测序正确的载体命名为pBS-GbSLSP，其中插入片段(目标带1+目标带2=IOOObp)命名为GbSLSP。GbSLSP的测序结果如图2所示，在5'端和3'端分别含有引物1和引物2的序列，表明pBS-GbSLSP中确实含有上述由海岛棉扩增的DNA片段GbSLSP。 GbSLSP的核苷酸序列为序列表中序列1。实施例2、海岛棉气孔特异性启动子(GbSLSP)驱动⑶S基因或GFP基因植物表达载体的构建两步连接法将pBS-GbSLSP用限制性内切酶Hind III和BamH I双酶切后，用 1. 0%琼脂糖凝胶电泳，切取约650bp和约350bp的两条目标带，用DNA片段回收试剂盒 (北京鼎国公司产品)回收并纯化。将纯化后约650bp的目标带(目标带1)与经过Hind III和BamH I双酶切的植物表达载体pBI121质粒(原Clontech公司产品)的大片段 (大约为13. 9kb)相连，得到的重组质粒命名为pBI-Gb650 ；再将纯化后约350bp的目标带(目标带2)与经过Hind III单酶切的重组质粒pBI-Gb650相连，得到转化用重组质粒 pBI-Gb650+350。将上述得到的转化用重组质粒(pBI_Gb650+350)用“冻融法”(《分子克隆》第三版)转化到大肠杆菌菌株DH5 α。转化的DH5 α在表面涂有IPTG和X_gal的含卡那霉素 50mg/L的LB固体培养基上于37°C过夜培养，挑取平板上生长的单菌落，接入含卡那霉素 50mg/L的LB液体培养基中于37°C振荡过夜培养。当菌液浓度达到0D_值0. 6-0. 8时，离心收集菌体，按上述小量碱裂解法提取质粒，用限制性内切酶Hind III和BamH I双酶切后，在1. 0%琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下可见分子大小分别约为13. 9kb(pBI121载体带)、 650bp(目标带1)和350bp(目标带2)的三条带，并且进行测序验证。将酶切和测序表明含有气孔特异性启动子GbSLSP片段(序列表中序列1)和PBI121酶切得到的大片段的重组表达载体命名为pBI-GbSLSP-GUS。同样，用GFP替代pBI_GbSLSP_GUS中的⑶S(限制性内切酶BamH I和Sac I双酶切)，得到植物表达载体pBI-GbSLSP-GFP。具体方法如下将两端带有BamH I和Sac I的GFP基因(序列如图18所示)PCR产物与用BamH I和Sac I双酶切pBI-GbSLSP-GUS得到的大片段连接，得到pB I-Gb SLSP-GFP。在重组表达载体pBI-GbSLSP-GUS中的⑶S基因，和在重组表达载体 ρΒΙ-GbSLSP-GFP中的GFP基因均需要气孔特异启动子GbSLSP驱动表达。所构建的植物双元表达载体pBI-GbSLSP-GUS和pB I-Gb SLSP-GFP的图谱见图3。实施例3、转GbSLSP烟草和拟南芥的获得和鉴定1、农杆菌的转化与转化子的鉴定用CaC12法(《分子克隆》第三版)制备根癌农杆菌菌株LBA4404和GV3101 (美国Life Technology公司产品)的感受态细胞。利用冻融法(《分子克隆》第三版)将实施例2所得的两个重组表达载体(pBI-GbSLSP-GUS和pB I-GbSLSP-GFP)转入制备的LBA4404 感受态细胞，同时，将pBI-GbSLSP-GUS载体转入GV3101感受态细胞。将转化的LBA4404菌株接种到含有链霉素(Str) 100mg/L和卡那霉素(Kan) 50mg/L的YEB固体培养基，将转化的 GV3101菌株接种到含有利福平(Rif) 25mg/L和卡那霉素(Kan) 50mg/L的YEB固体培养基， 置于28°C、在暗处培养48-72h，分别挑取两个平板上的单菌落，各自接入含有相应抗生素的YEB液体培养基，在28°C振荡过夜培养。当培养物的浓度达到0D600值0. 4-0. 6时，取少量菌液(1.5-2ml)，按上述小量碱裂解法提取质粒，用限制性内切酶Hind III和BamH I 双酶切鉴定，在1. 0%琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下可见分子大小大约分别为13. 9kb(载体带)、650bp(目标带1)和350bp(目标带2)的三条带。根据所含目的基因(⑶S或GFP)以及转化菌株(LBA4404和GV3101)的不同， 将酶切和测序鉴定表明含有GbSLSP片段的转入pBI-GbSLSP-GUS的LBA4404阳性克隆命名为LBA4404/pBI-GbSLSP-GUS、将酶切和测序鉴定表明含有GbSLSP片段的转入 pBI-GbSLSP-GFP 的 LBA4404 阳性克隆命名为 LBA4404/pBI_GbSLSP_GFP、将酶切和测序鉴定表明含有GbSLSP片段的转入pBI-GbSLSP-GUS的GV3101阳性克隆命名为GV3101/ pBI-GbSLSP-GUS。2、转基因烟草的获得1)农杆菌的准备分别挑取携带植物表达载体pBI-GbSLSP-⑶S或pBI-GbSLSP-GFP的农杆菌 LBA4404单菌落，接种于5ml含链霉素(Str) 100mg/L和卡那霉素(Kan) 50mg/L的YEB液体培养基中，28°C振荡培养过夜培养，取活化的农杆菌液，按1 100的比例加入到含链霉素(Str) 100mg/L和卡那霉素(Kan) 50mg/L的YEB液体培养基中，继续培养至0D_值为 0. 4-0. 6 ；5000rpm离心5min，收集菌体；用1/2MS0液体培养基(MS无机盐+B5维生素+肌醇0. lg/L+蔗糖30g/L，pH5. 80)洗涤菌体一次，并将其稀释到离心前菌液3倍体积的1/2MS 液体培养基中，准备侵染用。2)烟草的转化与转化植株的再生烟草的转化根据叶盘法(HorschRB 等，1985，Science，227 :1229_1231)进行。具体操作为选取约30天苗龄的烟草(品种“NC89”，种子购自中国农业科学院)无菌苗，切下鲜嫩浓绿的叶片，用直径9mm的打孔器制取叶盘外植体；将新制备的外植体投入上述步骤1)已准备好的农杆菌菌液中，侵染15min ；取出叶盘，用高压灭菌的吸水纸吸除叶盘表面残余的农杆菌菌液，置于固体再生培养基(MS无机盐+B5维生素+肌醇0. lg/L+BA 2. Omg/ L+IAA 0. 5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉0. 7%,pH5. 8)上暗处共培养2天；将共培养的叶盘转到含有羧苄青霉素(Carb) 500mg/L和Kan 50mg/L的固体再生培养基进行筛选培养，每隔 2-3周更换一次培养基，并逐渐降低Carb至200mg/L。待Kan抗性芽长到1_1. 5cm时，将其切下换到含有Carb 200mg/L和Kan 50mg/L的固体生根培养基(MS无机盐+B5维生素+肌醇0. lg/L+IAAO. 5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉0. 7%，pH5. 80)上诱导生根，获得完整的具有卡那霉素抗性的转基因烟草Ttl代植株。3)拟南芥的转化与筛选拟南芥的转化通过花蘸法(Cloughand Bent, 1998，Plant Journal, 16 (6) 735-743)进行。挑取携带植物表达载体pBI-GbSLSP-GUS的农杆菌GV3101单菌落，接种于 5ml含利福平(Rif) 25mg/L和Kan 50mg/L的YEB液体培养基中，28°C振荡培养过夜。取活化过夜的农杆菌，按1 100的比例加入到含Rif 25mg/L和Kan 50mg/L的新鲜YEB液体培养基中，继续培养至OD6tltl值大约为1. 2-1. 6，5000rpm离心5min，收集菌体大约30mL， 用50mL渗透缓冲液(1 XMS大量元素，5%蔗糖)重悬菌体，加入IOyL 0.02%的Selwet L-77，混勻，分装入5mL Eppendorf(EP)管中，每管3mL。侵染时，将待侵染的拟南芥花序插入菌液中，侵染5min。侵染后，将拟南芥植株平放的托盘上，盖上保鲜膜保湿，16°C黑暗条件下放置24h后恢复正常光照培养，收获种子(转基因T1代种子)。将收好的种子转入到 1.5mL EP管中，加入ImL 75%的乙醇，混勻，表面消毒lmin。然后，倒掉乙醇，加入0. 5%的次氯酸钠lmL，表面消毒lOmin，期间不断的摇勻。倒掉消毒液，加入ImL无菌水，混勻，放置 5min。重复上述步骤给种子消毒2-3次，将消毒好的种子均勻铺在筛选培养基上(MS+Kan 50mg/L)的平板上，置4°C春化2-4d，再转移到培养箱中培养(22°C，16h光照/8h黑暗)，培养10-14d后，挑选长出真叶并且生根较正常的植株，初步定为转基因植株，移入(营养土 蛭石=1 1)的土中生长，两到三个月收获T2代种子。4)转基因烟草Ttl代植株和拟南芥T1代植株的分子鉴定对步骤2)和3)得到的烟草Ttl代和拟南芥T1代植株进行PCR鉴定。根据SDS法和CTAB (《分子克隆》第三版)提取上述得到的具有Kan抗性基因的烟草Ttl代植株、拟南芥 T1代植株和未转基因的对照株(烟草品种“NC89”，拟南芥“哥伦比亚”野生型)的叶片基因组DNA，用气孔特异性启动子GbSLSP两端特异性引物对(引物1和引物2)进行PCR扩增， 结果显示，转基因烟草Ttl代(图4)和拟南芥T1代(图5)均扩增得到大小约为IOOObp的目标带，而未转化的对照植株在相应位置则没有扩增出此目标片段。这一结果初步表明气孔特异性启动子GbSLSP及其目标基因已整合到烟草和拟南芥基因组中。实施例4、利用组织化学检测转基因烟草和拟南芥中⑶S基因的表达，确定GbSLSP 启动子活性和特异性转基因烟草和拟南芥⑶S基因表达的组织化学检测按照Jefferson RA[1987, Plant Mol Biol Rep, 5 (4) 387-405]的方法进行。将转基因烟草Ttl代植株的叶圆盘，T1代植株幼苗，以及转基因拟南芥T1代植株的新鲜的花絮、花、柱头、花药、茎、花梗、花萼、果夹、 叶(叶圆盘)在⑶S染色液(X-GLuc溶液)中于37°C染色12-16h，然后经脱色液(乙醇 冰醋酸=3 1)脱色后，在显微镜下观测样品并拍照。未转基因的受体品种植株同样染色作为对照。烟草叶圆盘取自近叶柄处。转入每个表达载体的烟草Ttl代、T1代植株和拟南芥 T1植株均取10株以上的独立转化单株。转基因Ttl代烟草的GUS染色的结果显示，未转基因的对照植株(CK)的各个组织和器官都不能染色，但转GbSLSP的叶片保卫细胞被深度染色，叶肉细胞、叶脉和表皮毛的染色较弱(图6)。随机取Ttl转基因烟草所结的种子，用5%次氯酸钠表面消毒后接种在含 Kanl00mg/L的固体MS培养基表面，在24士 1°C暗处发芽，发芽后光照条件改为16h光照/8h 黑暗，温度为24士 1°C，在此条件下筛选转基因后代。在Kan抗性苗(T1代)呈现3_4片真叶时，随机取10株以上进行整株⑶S染色。T1代烟草幼苗的⑶S染色显示，子叶和真叶的气孔都被染成⑶S深蓝色，气孔邻近的叶肉也被染色，幼根中轴呈现弱的蓝色(图7)。而未转基因的对照植株(CK)的各个组织和器官都不能染色。转GbSLSP-GUS基因拟南芥T1代植株不同器官的⑶S染色的结果显示，未转基因的对照植株(CK)的各个组织和器官都不能染色，而转基因植株的花序柄、花梗、花萼、花瓣、 花药、花柱、果荚和叶片的气孔都被染成⑶S深蓝色，其它组织不染色(图8)。实施例5、利用共聚焦激光扫描显微镜观察转基因烟草中GFP基因的表达，确定 GbSLSP启动子的活性和特异性在盆栽的转GbSLSP-GFP烟草Ttl代Kan抗性苗长到3_5片叶时，取其顶部第2片嫩叶，在共聚焦激光扫描显微镜(型号Carl Zeiss LSM510)下用488nm波长激发、550nm检测GFP发出的绿色荧光。然后撕下叶片的下表皮，在同样条件下检测绿色荧光并照相。显微检测显示，由GbSLSP驱动的GFP基因的表达产物GFP不仅发出了绿色荧光，而且绿色荧光仅出现在气孔(图9)。实施例6、气孔特异性启动子的最短活性片段的分析对气孔特异性启动子的最短活性片段的分析采用的是GbSLSP启动子片段5'端和/或3'端删除分析法。为了解析气孔特异性启动子GbSLSP的最短活性片段，我们设计了 4 个 5'端删除片段(GbSLSP-F2、GbSLSP-F3、GbSLSP-F4、GbSLSP-F5)和 2 个 3'端删除片段(GbSLSP-SH和GbSLSPF2-SH)。这6个部分片段间的关系及大小如(图10)所示。1、气孔特异性启动子5'端和/或3'端删除片段的克隆与分离根据GbSLSP全长序列设计并合成以下5条引物，其中上游引物(也称5'端引物)3条(F3-F5)，下游引物(也称3'端引物)1条(R2)。为了方便以后的克隆和构建，在 3条上游引物(F3-F5)的5'端加入了限制性内切酶Hind III识别序列位点，在1条下游引物(R2)的3'端加入了限制性内切酶BamH I的识别序列位点(下列引物序列中的下划线序列)。这些引物如下F3 5' -AAGCTTATTTTGGAAGATGAC-3‘(序列 5)；F4 5' -AAGCTTCTTTACATGCATCATGTGATCG-3‘(序列 6)；F5 5' -AAGCTTATCGTGGGGGACCCGAAACTTGGCATAC-3'；(序列 7)R2 5' -GGATCCGTGG TTGGATGAGA CT-3'；(序列 8)。按照实施例1所述方法，以实施例1鉴定正确的含有GbSLSP全长序列的重组质粒 PBS-GbSLSP为模板，将上述3条上游引物(F3-F5)分别与引物2 (序列表中序列3)组合作为引物对进行PCR扩增，得到3条不同长度的两端带有酶切位点的5'端删除启动子片段 (GbSLSP-F3、GbSLSP-F4和GbSLSP_F5)；以全长上游引物(引物1，即序列表中序列2)与 R2(序列8)组合作为引物对进行PCR扩增，得到1条两端带有酶切位点的3'端删除启动子片段GbSLSP-SH ；用Hind III和BamH I双酶切pBS_GbSLSP载体得到的大小约为650bp 的片段为启动子GbSLSP-F2 ；用Hind III和BamH I双酶切pBS_GbSLSP-SH载体得到的小片段(约280bp)为启动子GbSLSPF2-SH。对上述PCR扩增得到的两端带有酶切位点的4个启动子片段(3个5'端删除启动子片段，1个3'端删除启动子片段GbSLSP-SH)以及通过酶切获得的GbSLSPF2-SH启动子片段和GbSLSP-F2启动子片段按照常规方法进行回收，并插入pBS-T载体。之后再将上述的6个重组载体按照实施例1步骤3所述的方法进行转化、挑取单克隆，通过Hind III和 BamH I双切鉴定(图11)，鉴定正确者再通过测序确认。所得重组载体依照含有启动子片段的不同分别命名为pBS_GbSLSPF2、 pBS-GbSLSPF3、pBS_GbSLSPF4、pBS_GbSLSPF5、pBS-GbSLSP-SH、pBS_GbSLSPF2_SH。测序结果表明以上6份质粒中均含有GbSLSP启动子5'端或3'端删除后不同长度后的片段。GbSLSP-F2的核苷酸序列为序列表中序列1的第346-993位，命名为GbSLSP_F2启动子；GbSLSP-F3的核苷酸序列为序列表中序列1的第401-993位，命名为GbSLSP_F3启动子；GbSLSP-F4的核苷酸序列为序列表中序列1的第511-993位，命名为GbSLSP_F4启动子；GbSLSP-F5的核苷酸序列为序列表中序列1的第529-993位，命名为GbSLSP_F5启动子；GbSLSP-SH的核苷酸序列为序列表中序列1的第1-634位，命名为GbSLSP-SH启动子； GbSLSPF2-SH的核苷酸序列为序列表中序列1的第346-634位，命名为GbSLSPF2_SH启动子。2、气孔特异启动子各片段驱动⑶S基因或GFP基因表达的植物表达载体的构建6个气孔特异启动子片段驱动GUS基因植物表达载体的构建采用常规一步酶切连接即可法，使特定的启动子片段替代实施例2pBI-GbSLSP-GUS载体中的GbSLSP全长启动子片段。之后按照实施例2所述方法转化，摇菌，小量碱裂解法提取质粒，再分别用步骤1中各自克隆时所用的特异性引物对，以及序列表中序列4和序列3、序列4和序列8所组成的两对引物对进行PCR鉴定，相应扩增出大小约为650、600、480、460、640或280bp的特异性带 (图 12)，相应为 GbSLSP-F2、GbSLSP-F3、GbSLSP-F4、GbSLSP-F5、GbSLSP-SH 和 GbSLSPF2_SH。 将这些片段与PBI121酶切得到的大片段的重组表达载体，依次名命为pBI-GbSLSPF2-GUS、 pBI-GbSLSPF3-GUS、 pBI_GbSLSPF4_GUS、 pBI_GbSLSPF5_GUS、 pBI_GbSLSP-SH_GUS、 pBI-GbSLSPF2-SH-GUS (简称为 GbSLSPX-GUS ；X = F2、F3、F4、F5、-SH 或 F2-SH)。然后，用GFP替代上述6个表达载体中的⑶S(限制性内切酶BamH I和Sac I双酶切)，相应得到含有气孔特异性启动子片段驱动GFP基因的6个重组表达载体 pBI-GbSLSPF2-GFP、pBI_GbSLSPF3_GFP、pBI_GbSLSPF4_GFP、pBI_GbSLSPF5_GFP、 pBI-GbSLSP-SH-GFP、pBI-GbSLSPF2-SH_GFP (简称为 GbSLSPX-GFP ；X = F2、F3、F4、F5、-SH 或F2-SH)。具体方法同实施例1所述。在上述12个植物表达载体中，GUS基因或GFP基因由各气孔特异启动子片段驱动表达。3、转气孔特异性启动子片段烟草和拟南芥的获得按照实施例3的方法分别将上述GbSLSPX-GUS和GbSLSPX-GFP系列12个植物重组表达载体转入烟草(品种“NC89”，种子购自中国农业科学院)中，同时分别将上述 GbSLSPX-GUS系列的6个重组表达载体转入拟南芥(哥伦比亚生态型)中，从而筛选获得转基因的烟草Ttl代植株和拟南芥T1植株。分别提取转各表达载体的烟草Ttl代植株和拟南芥T1植株基因组DNA，用引物 F2-F5(序列分别为序列4、序列5、序列6、序列7)中任一个与引物2 (序列3)组成引物对进行PCR扩增，或者使用引物1(序列2)、F2(序列4)与引物R2(序列8)组成引物对进行 PCR扩增，从而分别检测转基因的烟草和拟南芥中是否转入了相应的启动子。接着，将检测阳性的转基因烟草和拟南芥进行GUS基因表达的组织化学检测(按照实施例4的方法)和 GFP表达的共聚焦激光扫描显微镜观察(按照实施例5的方法)，详见步骤4和5。4、转GbSLSPX-GUS系列重组载体的烟草和拟南芥⑶S基因表达的组织化学检测按照实施例4的方法分别对上述PCR检测阳性的转GbSLSPX-GUS系列重组表达载体的烟草Ttl代、T1代植株和拟南芥T1代、T2代植株进行GUS基因表达的组织化学染色，每个启动子片段GbSLSPX-GUS阳性的植株均随机取样3-5个独立单株，同时以未转基因的烟草或拟南芥为对照。转基因烟草Ttl代叶片的染色结果如图13中A和a所示。结果表明，GbSLSP_F2 (图 13F2-A和a)、GbSLSP_F3 (图13F3-A和a)都能够驱动GUS基因在保卫细胞中特异性地强表达，尽管在叶肉细胞中似乎有微量的表达；GbSLSP-F4能够驱动⑶S基因在保卫细胞完全特异性表达(图13F4-A和a)，只是表达强度比GbSLSP_F3要弱一些；GbSLSP_F5能够驱动⑶S 基因在保卫细胞优势表达，在叶肉细胞的表达相对较弱(图13F5-A和a) ；GbSLSP-SH驱动的⑶S基因在保卫细胞、叶肉和叶脉中都有表达，尽管在保卫细胞中表达稍强(图13F-SH-A 和a) ；GbSLSPF2-SH驱动的⑶S基因在保卫细胞中有微量表达，而且只能在局部有⑶S着色 (图13F2-SH-A和a)。转基因烟草Ttl代花的⑶S染色结果(图13中B)表明，GbSLSP_F2能够驱动⑶S基因在花的子房、萼片、花瓣、柱头、花药均有一定的表达(图13F2-B) ；GbSLSP-F4 仅能驱动⑶S基因在子房有微弱的表达(图13F4-B) ；GbSLSP-F5能够驱动⑶S基因在花的子房、花瓣、花药中有微弱的表达(图13F5-B) ；GbSLSP-SH仅能驱动GUS基因在子房中有较强的表达(图13F-SH-B) ；GbSLSPF2-SH仅能驱动⑶S基因在花药中有很微弱的表达(图 13F2-SH-B)。转基因烟草T1代幼苗的GUS染色结果(图14)表明，各个构建启动子驱动GUS 基因均能稳定的遗传。而未转基因的对照植株(CK)的各个组织和器官都不能染色。转基因拟南芥T1代的⑶S染色结果如图15所示。转GbSLSP_F2驱动⑶S基因不仅在叶片气孔特异性地表达，而且在茎、花柄、花药、萼片和花柄所有具有气孔的组织都有特异性地表达，这些器官的气孔都被染成GUS蓝色(图15F2)。此外，在花丝上也有很强的 ⑶S染色，但花瓣及果夹上看不到⑶S染色。转GbSLSPF2-GUS的T2代幼苗的⑶S染色结果 (图16)显示，幼苗整株有气孔的部位都能够染成GUS染色(图16A)，其子叶(图16B和b) 和真叶(图16C和c)仅仅气孔呈现出⑶S蓝色，其它的组织不被染色。转GbSLSPF5-GUS 的T1代的⑶S染色结果(图15F5)与转GbSLSPF2-GUS的近似，但强度明显减弱。此外，在花柱除颈之外的部分呈现片状GUS染色(图15F5C)。而未转基因的T1代和T2代对照植株 (CK)的各个组织和器官都不能染色。5、转GbSLSPX-GFP系列烟草Ttl代表达的GFP的共聚焦激光扫描显微镜观察随机选取转GbSLSPFX-GFP系列重组表达载体的烟草Ttl代Kan抗性苗，每个启动子片段GbSLSPX-GFP阳性的植株均随机取样3-5个独立单株，取其幼叶在共聚焦激光扫描显微镜观察下观察GFP的表达情况且照相，照片如图17所示，GbSLSP的6个删除片段所驱动的GFP基因都只特异性地在气孔表达，绿色荧光仅仅在气孔出现，而在其它组织没有检测到。上述的实施例结果表明并且确证，本发明所提供的棉花启动子GbSLSP在气孔中具有较强的优势表达，5，端删除后的启动子片段GbSLSP-F2、GbSLSP-F3、GbSLSP-F4具有良好的气孔特异性，尤其是GbSLSP-F2具有很强的启动子活性。GbSLSP-F5、GbSLSP_F_SH、 GbSLSPF2-SH在气孔中具有较弱的优势表达，而且得到的启动子片段均能稳定地传递给后代。
权利要求
1.DNA分子，是下述a)或b)或c)的DNA片段a)3'端至少含有序列表中序列1的第5四-993位核苷酸序列，并且从序列1的第5 位开始、按照序列1的核苷酸序列向序列1的5'端延长，得到长度为465至99!3bp的任意一个DNA片段；所述DNA分子具有启动子功能；b)与a)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同源性，且具有启动子功能的DNA片段；c)在严格条件下与a)或b)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA片段。
2.根据权利要求1所述的DNA分子，其特征在于所述DNA分子的最后一位核苷酸是序列1的第993位。
3.根据权利要求1或2所述的DNA分子，其特征在于所述DNA分子为下述1)-3)中任一种1)核苷酸序列的3'端至少含有序列表中序列1的第511-993位核苷酸序列，并且从序列1的第511位开始、按照序列1的核苷酸序列向序列1的5'端延长，得到长度为483 至993bp的任意一个DNA片段；2)核苷酸序列的3'端至少含有序列表中序列1的第401-993位核苷酸序列，并且从序列1的第401位开始、按照序列1的核苷酸序列向序列1的5'端延长，得到长度为593 至993bp的任意一个DNA片段；3)核苷酸序列的3'端至少含有序列表中序列1的第346-993位核苷酸序列，并且从序列1的第346位开始、按照序列1的核苷酸序列向序列1的5'端延长，得到长度为648 至993bp的任意一个DNA片段。
4.根据权利要求1-3中任一所述的DNA分子，其特征在于所述DNA分子为下述 al)-a5)中任一种al)核苷酸序列为序列表中序列1所示的DNA分子； a2)核苷酸序列为序列表中序列1的第346-993位核苷酸所示DNA分子； a3)核苷酸序列为序列表中序列1的第401-993位核苷酸所示DNA分子； a4)核苷酸序列为序列表中序列1的第511-993位核苷酸所示DNA分子； a5)核苷酸序列为序列表中序列1的第5四-993位核苷酸所示DNA分子。
5.DNA分子，是下述d)或e)或f)的DNA片段d)3'端至少含有序列表中序列1的第346-634位核苷酸序列，并且从序列1的第346 位开始、按照序列1的核苷酸序列向序列1的5'端延长，得到长度为289至634bp的任意一个DNA片段；所述DNA分子具有启动子功能；所述DNA分子的最后一位核苷酸是序列1的第634位；e)与d)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同源性，且具有启动子功能的DNA片段；f)在严格条件下与d)或e)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA片段。
6.根据权利要求5所述的DNA分子，其特征在于所述DNA分子为下述bl)或1^2) bl)核苷酸序列为序列表中序列1的第1-634位核苷酸所示的DNA分子；b2)核苷酸序列为序列表中序列1的第346-634位核苷酸所示DNA分子。
7.含有权利要求1-6中任一所述DNA分子的遗传材料，或获得权利要求1-6中任一所述DNA分子的一个引物对；所述遗传材料为表达盒、重组载体、重组菌或转基因植物细胞或组织或器官。
8.根据权利要求7所述的引物对，其特征在于所述引物对为下述中的任一对cl)序列表中序列3的第7-30位核苷酸所示DNA片段和序列2的第7_27位核苷酸所示DNA片段组成的引物对；c2)序列表中序列3的第7-30位核苷酸所示DNA片段和序列5的第7_21位核苷酸所示DNA片段组成的引物对；c3)序列表中序列3的第7-30位核苷酸所示DNA片段和序列6的第7- 位核苷酸所示DNA片段组成的引物对；c4)序列表中序列3的第7-30位核苷酸所示DNA片段和序列7的第7_34位核苷酸所示DNA片段组成的引物对；c5)序列表中序列8的第7-22位核苷酸所示DNA片段和序列2的第7_27位核苷酸所示DNA片段组成的引物对。
9.权利要求1-6中任一所述DNA分子在植物中启动目的基因表达中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述植物是陆生植物，优选是双子叶植物，更优选是拟南芥或烟草；所述表达为气孔特异性表达。
全文摘要
本发明公开了一种植物气孔特异性启动子及其应用。本发明所提供的启动子具有下述核苷酸序列1)序列表中序列1；2)将序列表中序列1的核苷酸序列经过5’端删除和/或3’端删除后，并且仍然具有气孔特异性启动子功能的核苷酸序列；3)将1)或2)中核苷酸序列的一个或几个脱氧核苷酸残基经过取代、添加或缺失，且具有气孔特异性启动子功能的核苷酸序列。实验证明本发明所提供的启动子不仅具有良好的气孔特异性，而且该特异性能够稳定地传递给后代。这不仅对气孔和保卫细胞的分子生物学研究和气孔运动等的理论研究具有重要的意义，而且在培育抗旱和抗病作物而去提高作物的光合效率进而提高产量和品质等方面具有重大的应用价值和广阔的市场前景。
文档编号C12N15/11GK102433338SQ20121000111
公开日2012年5月2日 申请日期2012年1月4日 优先权日2012年1月4日
发明者肖兴国, 韩蕾 申请人:中国农业大学