专利名称：一种锰过氧化物酶固态发酵基质及其制备和使用方法
技术领域：
本发明涉及固态 发酵基质领域，确切地说是一种锰过氧化物酶固态发酵基质及其制备和使用方法。
背景技术：
猛过氧化物酶(Manganese-dependedperoxidase EC I. 11. I. 13)是由白腐真菌分泌的主要胞外酶之一,其能催化Mn2+成为Mn'而Mn3+能氧化大量的酚类化合物、胺类和染料等，在纸浆的漂白、有机污染物降解、染料脱色、褐煤的生物降解、处理农作物废弃物、催化聚合反应等方面具有重要作用，因此备受人们的重视。目前，锰过氧化物酶的研究大多利用合成培养基进行液态发酵，需添加昂贵的诱导物藜芦醇、吐温80等及有机酸草酸等，并且发酵周期长、成本高、酶活低，发酵废弃液对环境也造成污染。而相比与液态发酵，固态发酵产量更高、操作更简单、成本也更低.。近年来，应用固态发酵产锰过氧化物酶的报道越来越多的，主要是选用农作物废弃物作为固态基质，然后加入水、各种诱导剂、金属离子及有机酸等物质，虽然在一定程度上，提高了酶活，但成本较高，对环境依然会造成污染。
发明内容
本发明的目的是以筛选出的裂褶菌F17为研究对象，对其进行固态发酵产锰过氧化物酶MnP，对发酵条件和基质进行优化，以获得提高MnP的酶活力高的固态发酵基质，提供一种主要由农作物废物、营养液组成，不添加任何诱导剂、有机酸等物质的锰过氧化物酶固态发酵基质及其使用方法。上述目的通过以下方案实现
一种锰过氧化物酶固态发酵基质，其特征在于其是由每70-100ml浓度为30-40%的营养液与15-25g作为固态基质的农作物废弃物配制而成。所述的一种锰过氧化物酶固态发酵基质，其特征在于所述的营养液为西红柿汁、土豆汁、胡萝卜汁、桔子皮汁中的一种，所述的农作物废弃物为松木屑、稻草、稻壳或树叶中的一种或几种。所述的一种锰过氧化物酶固态发酵基质，其特征在于所述的营养液为胡萝卜汁，所述的农作物废弃物为稻草、稻壳、树叶按照I. 8-2. 2:0. 8-1. 3:0. 8-1. 0的重量比混合制成。所述的一种锰过氧化物酶固态发酵基质，其特征在于所述的农作物废弃物为稻草、稻壳、树叶按照2:1. 1:0.9的重量比混合制成。所述的锰过氧化物酶固态发酵基质的制备方法，其特征在于包括以下步骤
(1)、称取胡萝卜、土豆、西红柿或者桔子皮300-400g，匀浆打碎，加热煮18-22分钟，用6-9层的纱布过滤，最后定容至IL即得营养液；
(2)、按重量比称取农作物废弃物混匀作为固态基质，其中稻草、树叶需剪成2-3cm，稻壳、松木屑可直接称取，再在其中按比例加入营养液，配好之后，放入灭菌锅内，115-123°C灭菌18-22min，得锰过氧化物酶固态发酵基质。所述的一种锰过氧化物酶固态发酵基质，其特征在于制备方法为所述的锰过氧化物酶 固态发酵基质的含水率为4. 0ml/g左右。所述的锰过氧化物酶固态发酵基质的使用方法，其特征在于，包括以下步骤
(1)、菌种活化在斜面培养基中接种裂褶菌F17，在生化培养箱中培养4-6天，恒温24-26°C，斜面长满菌丝后，利用无菌水清洗菌丝，19000-2100r/min下匀浆2_4次，获得菌悬液，将菌悬液接种于液体培养基中，再在24-26°C恒温培养中恒温培养四天，然后将液体培养基19000-2100r/min下匀浆2_4次，得液体菌种备用；
(2)、接种将配好的锰过氧化物酶固态发酵基质放入无菌室，打开紫外灯紫外线照28-32min后关掉紫外灯，放入无菌室进行接种，将步骤(I)所得液体菌种接种于锰过氧化物酶固态发酵基质内，在恒温培养箱24-26°C培养2-4天即可开始测酶活。所述的一种锰过氧化物酶固态发酵基质的使用方法，其特征在于每Ig干锰过氧化物酶固态发酵基质接种液体菌种3. Oml左右，
所述的一种锰过氧化物酶固态发酵基质的使用方法，其特征在于所述的斜面培养基为PDA培养基，每I L的PDA培养基是由土豆200 g左右、葡萄糖20 g左右、琼脂20 g左右制得；每I L的液体培养基是由土豆200 g左右，葡萄糖20 g左右，KH2 PO4 3 g左右，MgSO4 7H20 I. 5 g 左右，VB1 0. 01 g 左右制得。本发明的有益效果为
1、优化的固态发酵基质中除了农作物废弃物和营养液外，没有添加任何其他物质，基质组成非常的简单，不仅减少了工作量，而且提高了酶活，甚至比添加了诱导剂、有机酸、金属离子等物质后的MnP酶活都高，达到了 17. 92U/g ；
2、本实验在固态发酵裂褶菌F17产锰过氧化物酶过程中，采用以营养液代替水的方法进行发酵，营养不仅为F17提供生长所需的部分营养物质，而且也提高了 MnP的酶活，酶活高达 17. 92U/g ；
3、该方法进行发酵，实验过程简单，成本低，对环境几乎无污染，是纯天然的产酶过程。
具体实施例方式实施例I
所述的一种锰过氧化物酶固态发酵基质，其是由每80ml浓度为35%的营养液与20g作为固态基质的农作物废弃物配制而成。所述的营养液为胡萝卜汁，所述的营养液的配制方法为称取胡萝卜350g，匀浆打碎，加热煮20分钟,用8层的纱布过滤,最后定容至IL即可。所述的农作物废弃物为稻草、稻壳、树叶按照2:1. 1:0. 9的比例混合制成。所述的锰过氧化物酶固态发酵基质的使用方法，其特征在于，包括以下步骤
(I )、菌种活化在斜面培养基中接种裂褶菌F17，在生化培养箱中培养5天，恒温25°C，斜面长满菌丝后，利用无菌水清洗菌丝，2000r/min下匀浆3次，获得菌悬液，将菌悬液接种于液体培养基中，再在25°C恒温培养中恒温培养四天，然后将液体培养基2000r/min下匀浆3次，得液体菌种备用；(2)、固态培养基的配制取农作物废弃物作为固态基质，在其中按比例加入营养液，配好之后，放入灭菌锅内，121 °C灭菌20min，得固态培养基；
(3)、接种将配好的固态培养基放入无菌室，打开紫外灯紫外线照30min后关掉紫外灯，放入无菌室进行接种，将步骤(I)所得液体菌种取20ml，接种于固态培养基内，在恒温培养箱25°C培养3天即可。第三天提取粗酶液并测锰过氧化物酶的酶活，连续测酶活到第七天。该过程中得到的最高酶活为17. 79U/g，比报道中加水进行实验产酶(MnP)酶活高(16.39U/g)。所述的一种锰过氧化物酶固态发酵基质的使用方法，其特征在于每Ig干培养基接种液体菌种3. 0ml，所述的固态发酵基质的含水率为4. 0ml/go所述的斜面培养基为PDA培养基，每I L的PDA培养基是由土豆200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g制得；每I L的液体培养基是由土豆 200 g，葡萄糖 20 g, KH2 PO4 3 g, MgSO4 7H20 I. 5 g, VB1 0. 01 g 制得。 粗酶液的提取固态发酵完成后，取2 g固态培养物于150 mL三角瓶中，加入20mL乙酸钠缓冲溶液(0. 01 mol/L, pH=6),在120 r/min下振荡浸提30 min,过滤除去残洛，滤液于10000 r/min下离心5 min，上清液即为粗酶液。取2 g固态培养物于60 °C下烘干至恒重,称重即得固态培养物干重。酶活的测定方法体系为3. 7 mL的0. 11 mol/L乳酸钠缓冲液(pH 4. 5)、0. I mL的粗酶液、0. I mL 的 40 mmol/LMnS04、用 0. I mL 的 I. 6 mmol/L H2 O2 启动反应，在 25 V下水浴5 min后终止反应，在240 nm下测定吸光度，空白对照用0. I mL缓冲液代替MnS04。定义每分钟氧化I ii moIMn2 +成为Mn3 +所需的酶量为I个酶活力单位⑶，并将实验结果表示为单位质量干培养物的酶活力(U/g)。实施例2
所述的一种锰过氧化物酶固态发酵基质，其是由每80ml浓度为35%的营养液与20g作为固态基质的农作物废弃物配制而成。所述的营养液为土豆汁，所述的营养液的配制方法为称取土豆350g，匀浆打碎，加热煮20分钟，用8层的纱布过滤，最后定容至IL即可。所述的农作物废弃物为稻草、稻壳、树叶按照2:1. 1:0. 9的比例混合制成。所述的锰过氧化物酶固态发酵基质的使用方法，其特征在于，包括以下步骤
(I )、菌种活化在斜面培养基中接种裂褶菌F17，在生化培养箱中培养5天，恒温25°C，斜面长满菌丝后，利用无菌水清洗菌丝，2000r/min下匀浆3次，获得菌悬液，将菌悬液接种于液体培养基中，再在25°C恒温培养中恒温培养四天，然后将液体培养基2000r/min下匀浆3次，得液体菌种备用；
(2)、固态培养基的配制取农作物废弃物作为固态基质，在其中按比例加入营养液，配好之后，放入灭菌锅内，121 °C灭菌20min，得固态培养基；
(3)、接种将配好的固态培养基放入无菌室，打开紫外灯紫外线照30min后关掉紫外灯，放入无菌室进行接种，将步骤(I)所得液体菌种取20ml，接种于固态培养基内，在恒温培养箱25°C培养3天即可。第三天提取粗酶液并测锰过氧化物酶的酶活，连续测酶活到第七天。该过程中得到的最高酶活为16. 96U/g，比报道中加水进行实验产酶(MnP)酶活高(16.39U/g)。所述的一种锰过氧化物酶固态发酵基质的使用方法，其特征在于每Ig干培养基接种液体菌种3. Oml，所述的固态发酵基质的含水率为4. 0ml/go所述的斜面培养基为PDA培养基，每I L的PDA培养基是由土豆200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g制得；每I L的液体培养基是由土豆 200 g，葡萄糖 20 g, KH2 PO4 3 g, MgSO4 7H20 I. 5 g, VB1 0. 01 g 制得。粗酶液的提取固态发酵完成后，取2 g固态培养物于150 mL三角瓶中，加入20mL乙酸钠缓冲溶液(0. 01 mol/L, pH=6),在120 r/min下振荡浸提30 min,过滤除去残洛，滤液于10000 r/min下离心5 min，上清液即为粗酶液。取2 g固态培养物于60 °C下烘干至恒重,称重即得固态培养物干重酶活的测定方法体系为:3. 7 mL的0. 11 mol/L乳酸钠缓冲液(pH 4. 5)、0. I mL的粗酶液、0. I mL 的 40 mmol/LMnS04、用 0. I mL 的 I. 6 mmol/L H2 O2 启动反应，在 25 V下水浴5 min后终止反应，在240 nm下测定吸光度，空白对照用0. I mL缓冲液代替MnS04。定义每分钟氧化I ii moIMn2 +成为Mn3 +所需的酶量为I个酶活力单位⑶，并将实验结果表示为单位质量干培养物的酶活力(U/g)。实施例3
所述的一种锰过氧化物酶固态发酵基质，其是由每80ml浓度为35%的营养液与20g作为固态基质的农作物废弃物配制而成。所述的营养液为西红柿汁，所述的营养液的配制方法为称取西红柿350g，匀浆打碎，加热煮20分钟,用8层的纱布过滤,最后定容至IL即可。所述的农作物废弃物为稻草、稻壳、树叶按照2:1. 1:0. 9的比例混合制成。所述的锰过氧化物酶固态发酵基质的使用方法，其特征在于，包括以下步骤
(I )、菌种活化在斜面培养基中接种裂褶菌F17，在生化培养箱中培养5天，恒温25°C，斜面长满菌丝后，利用无菌水清洗菌丝，2000r/min下匀浆3次，获得菌悬液，将菌悬液接种于液体培养基中，再在25°C恒温培养中恒温培养四天，然后将液体培养基2000r/min下匀浆3次，得液体菌种备用；
(2)、固态培养基的配制取农作物废弃物作为固态基质，在其中按比例加入营养液，配好之后，放入灭菌锅内，121 °C灭菌20min，得固态培养基；
(3)、接种将配好的固态培养基放入无菌室，打开紫外灯紫外线照30min后关掉紫外灯，放入无菌室进行接种，将步骤(I)所得液体菌种取20ml，接种于固态培养基内，在恒温培养箱25°C培养3天即可。第三天提取粗酶液并测锰过氧化物酶的酶活，连续测酶活到第七天。该过程中得到的最高酶活为16. 79U/g，比报道中加水进行实验产酶(MnP)酶活高(16.39U/g)。所述的一种锰过氧化物酶固态发酵基质的使用方法，其特征在于每Ig干培养基接种液体菌种3. 0ml，所述的固态发酵基质的含水率为4. 0ml/go所述的斜面培养基为PDA培养基，每I L的PDA培养基是由土豆200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g制得；每I L的液体培养基中是由土豆 200 g，葡萄糖 20 g，KH2 P04 3 g, MgS04 7H20 1.5 g，VBl 0.01 g 制得。粗酶液的提取固态发酵完成后，取2 g固态培养物于150 mL三角瓶中，加入20mL乙酸钠缓冲溶液(0. 01 mol/L, pH=6),在120 r/min下振荡浸提30 min,过滤除去残洛，滤液于10000 r/min下离心5 min，上清液即为粗酶液。取2 g固态培养物于60 °C下烘干
至恒重,称重即得固态培养物干重。
酶活的测定方法体系为3. 7 mL的0. 11 mol/L乳酸钠缓冲液(pH 4. 5)、0. I mL的粗酶液、0. I mL 的 40 mmol/LMnS04、用 0. I mL 的 I. 6 mmol/L H2 O2 启动反应，在 25 V下水浴5 min后终止反应，在240 nm下测定吸光度，空白对照用0. I mL缓冲液代替MnS04。定义每分钟氧化I ii moIMn2 +成为Mn3 +所需的酶量为I个酶活力单位⑶，并将实验结果表示为单位质量干培养物的酶活力(U/g)。实施例4
所述的一种锰过氧化物酶固态发酵基质，其是由每80ml浓度为35%的营养液与20g作为固态基质的农作物废弃物配制而成。所述的营养液为桔子皮汁，所述的营养液的配制方法为称取桔子皮350g，匀浆打碎，加热煮20分钟,用8层的纱布过滤,最后定容至IL即可。所述的农作物废弃物为稻草、稻壳、树叶按照2:1. 1:0. 9的比例混合制成。所述的锰过氧化物酶固态发酵基质的使用方法，其特征在于，包括以下步骤
(I )、菌种活化在斜面培养基中接种裂褶菌F17，在生化培养箱中培养5天，恒温25°C，斜面长满菌丝后，利用无菌水清洗菌丝，2000r/min下匀浆3次，获得菌悬液，将菌悬液接种于液体培养基中，再在25°C恒温培养中恒温培养四天，然后将液体培养基2000r/min下匀浆3次，得液体菌种备用；
(2)、固态培养基的配制取农作物废弃物作为固态基质，在其中按比例加入营养液，配好之后，放入灭菌锅内，121 °C灭菌20min，得固态培养基；
(3)、接种将配好的固态培养基放入无菌室，打开紫外灯紫外线照30min后关掉紫外灯，放入无菌室进行接种，将步骤(I)所得液体菌种取20ml，接种于固态培养基内，在恒温培养箱25°C培养3天即可。第三天提取粗酶液并测锰过氧化物酶的酶活，连续测酶活到第七天。该过程中得到的最高酶活为17. 09U/g,比报道中加水进行实验产酶(MnP)酶活高(16.39U/g)。所述的一种锰过氧化物酶固态发酵基质的使用方法，其特征在于每Ig干培养基接种液体菌种3. 0ml，所述的固态发酵基质的含水率为4. 0ml/go所述的斜面培养基为PDA培养基，每I L的PDA培养基中是由土豆200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g制得；每I L的液体培养基中是由土豆 200 g，葡萄糖 20 g，KH2 PO4 3 g，MgSO4 7H20 I. 5 g，VB1 0. 01 g 制得。粗酶液的提取固态发酵完成后，取2 g固态培养物于150 mL三角瓶中，加入20mL乙酸钠缓冲溶液(0. 01 mol/L, pH=6),在120 r/min下振荡浸提30 min,过滤除去残洛，滤液于10000 r/min下离心5 min，上清液即为粗酶液。取2 g固态培养物于60 °C下烘干
至恒重,称重即得固态培养物干重。酶活的测定方法体系为:3. 7 mL的0. 11 mol/L乳酸钠缓冲液(pH 4. 5)、0. I mL 的粗酶液、0. I mL 的 40 mmol/LMnS04、用 0. I mL 的 I. 6 mmol/L H2 O2 启动反应，在 25 V下水浴5 min后终止反应，在240 nm下测定吸光度，空白对照用0. I mL缓冲液代替MnS04。定义每分钟氧化I ii moIMn2 +成为Mn3 +所需的酶量为I个酶活力单位(U)，并将实验结果表示为单位质量干培养物的酶活力(U/g)。
权利要求
1.ー种锰过氧化物酶固态发酵基质，其特征在于其是由每70-100ml浓度为30-40%的营养液与15-25g作为固态基质的农作物废弃物配制而成。
2.根据权利要求I所述的ー种锰过氧化物酶固态发酵基质，其特征在于所述的营养液为西红柿汁、土豆汁、胡萝卜汁、桔子皮汁中的ー种，所述的农作物废弃物为松木屑、稻草、稻壳或树叶中的ー种或几种。
3.根据权利要求I所述的ー种锰过氧化物酶固态发酵基质，其特征在于所述的营养液为胡萝卜汁，所述的农作物废弃物为稻草、稻壳、树叶按照I. 8-2. 2:0. 8-1. 3:0. 8-1. O的重量比混合制成。
4.根据权利要求3所述的ー种锰过氧化物酶固态发酵基质，其特征在于所述的农作物废弃物为稻草、稻壳、树叶按照2:1. 1:0. 9的重量比混合制成。
5.一种如权利要求I所述的锰过氧化物酶固态发酵基质的制备方法，其特征在于包括以下步骤 (1)、称取胡萝卜、土豆、西红柿或者桔子皮300-400g，匀浆打碎，加热煮18-22分钟，用6-9层的纱布过滤，最后定容至IL即得营养液； (2)、按重量比称取农作物废弃物混匀作为固态基质，其中稻草、树叶需剪成2-3cm，稻壳、松木屑可直接称取，再在其中按比例加入营养液，配好之后，放入灭菌锅内，115-123°C灭菌18-22min，得锰过氧化物酶固态发酵基质。
6.根据权利要求I所述的ー种锰过氧化物酶固态发酵基质，其特征在于制备方法为所述的锰过氧化物酶固态发酵基质的含水率为4. 0ml/g左右。
7.—种如权利要求I所述的锰过氧化物酶固态发酵基质的使用方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)、菌种活化在斜面培养基中接种裂褶菌F17，在生化培养箱中培养4-6天,恒温24-26°C，斜面长满菌丝后，利用无菌水清洗菌丝，19000-2100r/min下匀浆2_4次，获得菌悬液，将菌悬液接种于液体培养基中，再在24-26°C恒温培养中恒温培养四天，然后将液体培养基19000-2100r/min下匀浆2_4次，得液体菌种备用； (2)、接种将配好的锰过氧化物酶固态发酵基质放入无菌室，打开紫外灯紫外线照28-32min后关掉紫外灯，放入无菌室进行接种，将步骤(I)所得液体菌种接种于锰过氧化物酶固态发酵基质内，在恒温培养箱24-26°C培养2-4天即可开始测酶活。
8.根据权利要求7所述的ー种锰过氧化物酶固态发酵基质的使用方法，其特征在于每Ig干锰过氧化物酶固态发酵基质接种液体菌种3. Oml左右。
9.根据权利要求7所述的ー种锰过氧化物酶固态发酵基质的使用方法，其特征在于所述的斜面培养基为PDA培养基，每I L的PDA培养基是由土豆200 g左右、葡萄糖20 g左右、琼脂20 g左右制得；每I L的液体培养基是由土豆200 g左右，葡萄糖20 g左右，KH2PO4 3 g 左右，MgS04*7H20 1.5 g 左右，VB1 0.01 g 左右制得。
全文摘要
本发明公开了一种锰过氧化物酶固态发酵基质及其使用方法，其是由每70-100ml浓度为30-40%的营养液与15-25g作为固态基质的农作物废弃物配制而成。本发明优化的固态发酵基质中除了农作物废弃物和营养液外，没有添加任何其他物质，基质组成非常的简单，不仅减少了工作量，而且提高了酶活，利用该方法进行发酵，实验过程简单，成本低，对环境几乎无污染，是纯天然的产酶过程。
文档编号C12N9/08GK102634494SQ20121009013
公开日2012年8月15日 申请日期2012年3月30日 优先权日2012年3月30日
发明者姚俊桃, 荚荣 申请人:安徽大学