专利名称：携带轮状病毒抗原表位的重组嵌合蛋白及其制备的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种重组嵌合蛋白，尤其是一种携带轮状病毒抗原表位的重组嵌合蛋白及其制备，属于医学生物技术领域。
背景技术：
轮状病毒(Rotavirus，简称RV)是婴幼儿腹泻的主要病原体。世界范围内每年大约有60多万例RV感染患者死亡，其中80%发生在发展中国家。RV属呼肠病毒科(Meoviridae)，轮状病毒属iRotavirus\ RV基因组由11个片段的双链RNA组成，分别编码6个结构蛋白(VP1-VP4, VP6和VP7)和6个非结构蛋白(NSP1-NSP5/NSP6)。 根据RV组(亚组)抗原蛋白VP6的抗原性的不同，可将至今已发现的轮状病毒RV分为A G七个组，A组是婴幼儿腹泻的主要病原体。根据病毒蛋白编码框(ORF)核苷酸序列同源性差异，可将A组轮状病毒RV的12个蛋白(基因)分为不同的基因型。根据RV基因型分类标准，A组轮状病毒RV的结构蛋白VP6至少可分为16个基因型(11-116型)。VP6蛋白由第6基因片段编码，含397个氨基酸，分子量约为44. 8KDa。VP6蛋白是轮状病毒RV中含量最丰富的蛋白，约占病毒总蛋白量的51%。RV内壳中间层由260个致密的VP6蛋白三聚体共780个蛋白分子构成。VP6蛋白具有重要的生物学功能，是病毒基因组转录和病毒组装不可缺少的成分。VP6蛋白也具有重要的免疫学性质。近年进行的VP6蛋白免疫学研究表明，一些抗VP6蛋白的IgA单克隆抗体诸如7D9所产生的IgA具有保护作用，在SCID鼠中可清除其慢性RV病毒感染。一些研究表明VP6蛋白的抗病毒作用可能是通过IgA的分泌途径而阻碍了病毒的复制循环过程，或作为一种黏膜的分泌型IgAJf RV感染的上皮细胞排除，从而起到保护作用。研究发现VP6蛋白分子中至少存在两个Th细胞抗原表位和一个交叉反应的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位。有研究表明在使用麦芽糖结合VP6蛋白对小鼠进行黏膜免疫后，IFN- y被认为是⑶4+T细胞分泌的唯一有效的抗RV的细胞因子。众多的实验表明，经VP6蛋白免疫后，在动物体内确实能引起抗RV感染的作用。抗VP6蛋白单克隆抗体具有抑制病毒转录活性和保护小鼠免受病毒感染的作用。用重组表达的VP6蛋白免疫小鼠，也可诱导小鼠产生免疫保护作用。VP6蛋白可自我组装成病毒样颗粒(VLPs)。由于VLPs没有感染性，在研究细胞相互作用，开发诊断制剂和疫苗方面，具有更好的安全性。与单一分子的重组抗原相比，VLPs具有更好的免疫原性，可刺激机体产生体液和细胞免疫反应。由于VLPs具有高密度的呈递抗原表位，可产生很强的免疫反应，是许多疫苗研制中很有前景的材料。至今所有已用于人体的轮状病毒RV疫苗都是减毒活疫苗。1997年始用于人体的多价减毒重组活疫苗Rotashield因后来发现与肠套叠有关联而在使用一年后即停止使用。2006年和2008年分别获准在人群中使用的5价重组减毒活疫苗RotaTeq和单价重组减毒活疫苗Rotarix现也已发现有猪环状病毒DNA污染。Rotarix已在美国人群中停止使用，RotaTeq在人群中尚可正常使用。由于上述用于人类的RV疫苗存在肠套叠和其他病毒核酸污染等风险，且都存在只能降低RV感染引起的死亡率和重症腹泻，不能完全保护RV感染的不足，在Rotarix停用后，RV感染率似有所提高。在尚无理想的治疗轮状病毒RV感染的药物，以及轮状病毒RV疫苗尚不十分理想的今天，进一步研制更安全有效的新型轮状病毒RV疫苗具有重要的经济与社会价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种携带有轮状病毒P[4] 223抗原表位的重组蛋白及其制备，以用作联合重组嵌合疫苗。本发明的目的在于提供一种携带有轮状病毒P [4] 56抗原表位的重组蛋白及其制 备，以用作联合重组嵌合疫苗。本发明的目的又在于提供一种携带有轮状病毒Gl [142]抗原表位的重组蛋白及其制备，以用作联合重组嵌合疫苗。本发明的目的还在于提供一种携带有轮状病毒G4[208]抗原表位的重组蛋白及其制备，以用作联合重组嵌合疫苗。本发明的目的再在于提供一种携带有轮状病毒P [8] 296抗原表位的重组蛋白及其制备，以用作联合重组嵌合疫苗。本发明的目的还在于提供一种携带有轮状病毒G2 [87]抗原表位的重组蛋白及其制备，以用作联合重组嵌合疫苗。本发明的目的在于提供一种携带有轮状病毒P [4] 223、P [4] 56,Gl [142]、G4 [208]、P[8]296和G2[87]抗原表位的重组蛋白及其制备，以用作联合重组嵌合疫苗。本发明提供的携带轮状病毒P[4]223抗原表位的重组蛋白的氨基酸序列为
Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys He Val
Glu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu He Gln Gln Phe Asn Gln Met He IleThr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly He Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn TrpSer Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val GluThr Ala Arg Asn Thr He Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp GluMet Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly He Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys LeuSer Gly He Lys Phe Lys Arg He Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr He Glu Asn TrpAsn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn He Phe ProTyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Pro Pro He GlnAsn Thr Arg Asn Val Val Pro Glu Leu Met Gly Thr Met Trp Leu Asn Ala Gly Ser GluHe Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn He Gln Gln Phe Glu His He Val Gln LeuArg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr He Thr Leu Leu Pro Asp Ala Glu Arg Phe Ser PhePro Arg Val He Asn Ser Ala Asp Gly Thr Thr Trp Tyr Phe Asn Pro Val He Leu ArgPro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly Gln He He Asn Thr Tyr Gln AlaPro Arg Phe Gly Thr He Val Ala Arg Asn Phe Asp Thr He Arg Leu Ser Phe Gln LeuMet Arg Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu His His Ala Thr Val Gly Leu ThrLeu Arg He Glu Ser Ala He Cys Glu Ser Val Leu Ala Asp Ala Ser Glu Thr Met LeuAla Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala lie Pro Val Gly Pro Val Phe Pro ProGly Met Asn Trp Thr Asp Leu He Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg Glu Asp Asn Leu GlnArg Val Phe Thr Val Ala Ser lie Arg Ser Met Leu Val Lys其中，P[4] 223抗原表位的氨基酸序列为
Leu Pro Pro He Gln Asn Thr Arg Asn Val Val Pro。本发明提供的携带轮状病毒P[4]56抗原表位的重组蛋白的氨基酸序列为
Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys He ValGlu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu He Gln Gln Phe Asn Gln Met He IleThr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly He Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn TrpSer Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val GluThr Ala Arg Asn Thr He Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp GluMet Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly He Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys LeuSer Gly He Lys Phe Lys Arg He Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr He Glu Asn TrpAsn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn He Phe ProTyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Met Gly Thr MetTrp Leu Asn Ala Gly Ser Glu He Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn Asp Ser ThrThr Val Glu Pro Val Leu Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Ser Asn He Gln Gln Phe Glu HisHe Val Gln Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr He Thr Leu Leu Pro Asp Ala GluArg Phe Ser Phe Pro Arg Val He Asn Ser Ala Asp Gly Thr Thr Trp Tyr Phe Asn ProVal He Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly Gln Ile He AsnThr Tyr Gln Ala Pro Arg Phe Gly Thr He Val Ala Arg Asn Phe Asp Thr He Arg LeuSer Phe Gln Leu Met Arg Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu His His Ala ThrVal Gly Leu Thr Leu Arg He Glu Ser Ala He Cys Glu Ser Val Leu Ala Asp Ala SerGlu Thr Met Leu Ala Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala He Pro Val Gly ProVal Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu He Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg GluAsp Asn Leu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser He Arg Ser Met Leu Val Lys其中，P[4] 56抗原表位的氨基酸序列为
Asn Asp Ser Thr Thr Val Glu Pro Val Leu Asp Gly Pro Tyr Gln Pro。本发明提供的携带轮状病毒Gl [142]抗原表位的重组蛋白的氨基酸序列为
Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys He ValGlu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu He Gln Gln Phe Asn Gln Met He IleThr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly He Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn TrpSer Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val GluThr Ala Arg Asn Thr He Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp GluMet Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly He Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys LeuSer Gly He Lys Phe Lys Arg He Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr He Glu Asn TrpAsn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn He Phe ProTyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Met Gly Thr MetTrp Leu Asn Ala Gly Ser Glu He Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn lie Gln GlnPhe Glu His He Val Gln Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr lie Thr Leu Leu ProAsp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val lie Asn Ser Ala Asp Gly Thr Met Lys TyrAsp Gln Ser Leu Lys Leu Asp Met Gly Thr Thr Trp Tyr Phe Asn Pro Val lie Leu ArgPro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly Gln lie lie Asn Thr Tyr Gln AlaPro Arg Phe Gly Thr He Val Ala Arg Asn Phe Asp Thr lie Arg Leu Ser Phe Gln LeuMet Arg Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu His His Ala Thr Val Gly Leu ThrLeu Arg He Glu Ser Ala He Cys Glu Ser Val Leu Ala Asp Ala Ser Glu Thr Met LeuAla Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala He Pro Val Gly Pro Val Phe Pro ProGly Met Asn Trp Thr Asp Leu He Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg Glu Asp Asn Leu GlnArg Val Phe Thr Val Ala Ser lie Arg Ser Met Leu Val Lys
其中，Gl[142]的氨基酸序列为Met Lys Tyr Asp Gln Ser Leu Lys Leu Asp Met。本发明提供的携带轮状病毒G4[208]抗原表位的重组蛋白的氨基酸序列为
Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys He ValGlu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu He Gln Gln Phe Asn Gln Met He IleThr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly He Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn TrpSer Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val GluThr Ala Arg Asn Thr He Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp GluMet Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly He Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys LeuSer Gly He Lys Phe Lys Arg He Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr He Glu Asn TrpAsn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn He Phe ProTyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Met Gly Thr MetTrp Leu Asn Ala Gly Ser Glu He Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn He Gln GlnPhe Glu His He Val Gln Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr He Thr Leu Leu ProAsp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val He Asn Ser Ala Asp Gly Thr Thr Trp TyrPhe Asn Pro Val He Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly GlnHe He Asn Thr Tyr Gln Ala Pro Arg Gln Thr Thr Asn Thr Ala Thr Phe Glu Thr ValAla Asp Pro Arg Phe Gly Thr He Val Ala Arg Asn Phe Asp Thr He Arg Leu Ser PheGln Leu Met Arg Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu His His Ala Thr Val GlyLeu Thr Leu Arg He Glu Ser Ala He Cys Glu Ser Val Leu Ala Asp Ala Ser Glu ThrMet Leu Ala Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala He Pro Val Gly Pro Val PhePro Pro Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu He Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg Glu Asp AsnLeu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser He Arg Ser Met Leu Val Lys
其中G4[208]的氨基酸序列为Gln Thr Thr Asn Thr Ala Thr Phe Glu Thr Val Ala
Asp0本发明提供的携带轮状病毒P[8]296抗原表位的重组蛋白的氨基酸序列为
Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys He ValGlu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu He Gln Gln Phe Asn Gln Met He IleThr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly He Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn TrpSer Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val GluThr Ala Arg Asn Thr He Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp GluMet Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly He Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys LeuSer Gly He Lys Phe Lys Arg He Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr lie Glu Asn TrpAsn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn lie Phe ProTyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Met Gly Thr MetTrp Leu Asn Ala Gly Ser Glu He Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn lie Gln GlnPhe Glu His He Val G ln Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr lie Thr Leu Leu ProAsp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val He Asn Ser Ala Asp Gly Thr Thr Trp TyrPhe Asn Pro Val He Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly GlnHe He Asn Thr Tyr Gln Ala Pro Arg Phe Gly Thr lie Val Ala Arg Asn Phe Asp ThrHe Arg Leu Ser Phe Gln Leu Met Arg Pro Arg Lys Ala Ala Asn Tyr Gln Tyr Asn TyrLeu Arg Asp Gly Glu Gln Val Thr Ala Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu HisHis Ala Thr Val Gly Leu Thr Leu Arg He Glu Ser Ala lie Cys Glu Ser Val Leu AlaAsp Ala Ser Glu Thr Met Leu Ala Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala I Ie ProVal Gly Pro Val Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu lie Thr Asn Tyr Ser ProSer Arg Glu Asp Asn Leu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser lie Arg Ser Met Leu ValLys
其中，P[8] 296的氨基酸序列为
Lys Ala Ala Asn Tyr Gln Tyr Asn Tyr Leu Arg Asp Gly Glu Gln Val Thr Ala。
本发明提供的携带轮状病毒G2[87]抗原表位重组蛋白的氨基酸序列为
Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys He ValGlu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu He Gln Gln Phe Asn Gln Met He IleThr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly He Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn TrpSer Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val GluThr Ala Arg Asn Thr He Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp GluMet Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly He Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys LeuSer Gly He Lys Phe Lys Arg He Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr He Glu Asn TrpAsn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn He Phe ProTyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Met Gly Thr MetTrp Leu Asn Ala Gly Ser Glu He Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn He Gln GlnPhe Glu His He Val Gln Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr He Thr Leu Leu ProAsp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val He Asn Ser Ala Asp Gly Thr Thr Trp TyrPhe Asn Pro Val He Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly GlnIle He Asn Thr Tyr Gln Ala Pro Arg Phe Gly Thr He Val Ala Arg Asn Phe Asp ThrHe Arg Leu Ser Phe Gln Leu Met Arg Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu AlaGlu Ala Lys Asn Glu He Ser Asp Asp Glu Trp Glu Asn Thr Leu Glu His His Ala ThrVal Gly Leu Thr Leu Arg He Glu Ser Ala He Cys Glu Ser Val Leu Ala Asp Ala SerGlu Thr Met Leu Ala Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala He Pro Val Gly ProVal Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu lie Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg GluAsp Asn Leu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser lie Arg Ser Met Leu Val Lys其中，G2[87]的氨基酸序列为
Ala Glu Ala Lys Asn Glu lie Ser Asp Asp Glu Trp Glu Asn Thr0本发明提供的携带有轮状病毒P[4] 223、P[4]56，Gl [142]，G4[208]，P[8] 296 和G2 [87]抗原表位重组蛋白的氣基酸序列
Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys He ValGlu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu He Gln Gln Phe Asn Gln Met He IleThr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly He Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn TrpSer Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val Glu Thr Ala Arg Asn Thr He Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp GluMet Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly He Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys LeuSer Gly He Lys Phe Lys Arg He Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr He Glu Asn TrpAsn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn He Phe ProTyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Pro Pro He GlnAsn Thr Arg Asn Val Val Pro Glu Leu Met Gly Thr Met Trp Leu Asn Ala Gly Ser GluHe Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn Asp Ser Thr Thr Val Glu Pro Val Leu AspGly Pro Tyr Gln Pro Ser Asn He Gln Gln Phe Glu His He Val Gln Leu Arg Arg ValLeu Thr Thr Ala Thr He Thr Leu Leu Pro Asp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg ValHe Asn Ser Ala Asp Gly Thr Met Lys Tyr Asp Gln Ser Leu Lys Leu Asp Met Gly ThrThr Trp Tyr Phe Asn Pro Val He Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu LeuAsn Gly Gln He He Asn Thr Tyr Gln Ala Pro Arg Gln Thr Thr Asn Thr Ala Thr PheGlu Thr Val Ala Asp Pro Arg Phe Gly Thr He Val Ala Arg Asn Phe Asp Thr He ArgLeu Ser Phe Gln Leu Met Arg Pro Arg Lys Ala Ala Asn Tyr Gln Tyr Asn Tyr Leu ArgAsp Gly Glu Gln Val Thr Ala Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu Ala Glu AlaLys Asn Glu He Ser Asp Asp Glu Trp Glu Asn Thr Leu Glu His His Ala Thr Val GlyLeu Thr Leu Arg He Glu Ser Ala He Cys Glu Ser Val Leu Ala Asp Ala Ser Glu ThrMet Leu Ala Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala He Pro Val Gly Pro Val PhePro Pro Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu He Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg Glu Asp AsnLeu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser He Arg Ser Met Leu Val Lys0本发明提供的携带有轮状病毒P[4]223抗原表位的重组蛋白，携带有轮状病毒P [4] 56抗原表位的重组蛋白，携带有轮状病毒Gl [142]抗原表位的重组蛋白，携带有轮状病毒G4 [208]抗原表位的重组蛋白，携带有轮状病毒P [8] 296抗原表位的重组蛋白，携带有轮状病毒G2[87]抗原表位的重组蛋白均通过下列步骤制备
1A、根据抗原表位氨基酸序列，分别设计下列引物
P[4]223F CCCACCAATTCAAAATACTAGAAATGTAGTTCCAGAGCT ；
P[4]223R CTGGAACTACATTTCTAGTATTTTGAATTGGTGGGAGCT ；
P[4]56F CGAATGATTCAACTACAGTGGAACCAGTTTTAGATGGTCCTTATCAACCTT ；
P[4]56R CGAAGGTTGATAAGGACCATCTAAAACTGGTTCCACTGTAGTTGAATCATT ；Gl[142]F CATGAAATATGACCAAAGTCTTAAATTAGATATGGGTAC ；
Gl[142] R CCATATCTAATTTAAGACTTTGGTCATATTTCATGGTAC ；
G4[208]F CTAGGCAAACGACAAATACAGCTACTTTTGAAACAGTTGCTGATC ；
G4[208]R CTAGGATCAGCAACTGTTTCAAAAGTAGCTGTATTTGTCGTTTGC ；
P[8] 296F GGAAGGCAGCAAATTATCAATATAATTACTTACGTGACGGTGAACAAGTAACCGCACCGC ；
P[8] 296R GGTGCGGTTACTTGTTCACCGTCACGTAAGTAATTATATTGATAATTTGCTGCCTTCCGC ；G2[87]F TCGAGGCAGAAGCTAAAAATGAGATTTCAGATGATGAATGGGAAAATACTC ； G2[87]R TCGAGAGTATTTTCCCATTCATCATCTGAAATCTCATTTTTAGCTTCTGCC ；
IB、将步骤IA的各引物分别进行下列配对
将VP4抗原表位P [4] 223的两条人工合成的寡核苷酸即正链P [4] 223F和负链P[4]223R 配成引物对P[4]223F/P[4]223R ；
将VP4抗原表位P [4] 56的两条人工合成的寡核苷酸即正链P [4] 56F和负链P[4]56R配成引物对P[4]56F/P[4]56R ；
将VP7抗原表位Gl [142]的两条人工合成的寡核苷酸即正链Gl [142]F和负链Gl [142]R 配成引物对G1[142]F/G1[142]R；
将VP7抗原表位G4 [208]的两条人工合成的寡核苷酸即正链G4 [208] F和负链G4 [208]R 配成引物对G4[208]F/G4[208]R ；
将VP4抗原表位P8 [296]的两条人工合成的寡核苷酸即正链P8 [296]F和负链P8 [296]R 配成引物对P8[296]F/P8[296]R ；
将VP7抗原表位G2 [87]的两条人工合成的寡核苷酸即正链G2 [87]F和负链G2 [87] R配成引物对G2[87]F/ G2[87]R；
IC、将步骤IB的各引物对分别在下列条件下进行退火，退火混合液中分别含有2yl的正向引物，2iU的反向引物，以及7iU的PCR缓冲液和59 ill的水；将退火混合液于65°C水浴反应5分钟后，再于37°C水浴反应45分钟，反应体系中加入400 U I的TE，并与等体积异丙醇充分混匀，室温放置10分钟后，4°C，15，OOOrpm离心15min，沉淀用质量浓度为75%的乙醇漂洗，干燥后，用IOiU的TE溶解；分别得到在5’端和3’端分别带Sac I位点，或者BspT104 I位点，或者Kpn I位点，或者Bln I位点、或者Sac II位点，或者Xho I位点的下列六条互补双链P[4]223互补双链、P [4] 56互补双链、Gl [142]互补双链、G4 [208]互补双链、P [8] 296互补双链、G2 [87]互补双链
ID、将携带有SacI位点、BspT104 I位点、Kpn I位点、Bln I位点、Sac II位点及XhoI位点的重组轮状病毒VP6载体蛋白编码基因的质粒PETP6F，在下列条件下分别用Sac I，BspT104 I, Kpn I, Bln I, Sac II，Xho I 酶切酶切混合液分别含 3 的 Sac I, BspT104I, Kpn I, Bln I, Sac II 或 Xho I 内切酶(15U)，以及 10 y I 的 pETP6F DNA, 7 U I 的 IOX缓冲液，50 Ul的水；将酶切混合液于37°C水浴反应3小时，分别得六条下列酶切质粒片段Sac I酶切质粒片段、BspT104 I酶切质粒片段、Kpn I酶切质粒片段、Bln I酶切质粒片段、Sac II酶切质粒片段、Xho I酶切质粒片段，用I. 5%的琼脂糖凝胶电泳分离和纯化所得六条带有不同切口的酶切质粒片段；
IE、将步骤ID所得六个酶切质粒片段分别与步骤IC所得六个互补双链进行如下相应的配对Sac I酶切质粒片段/P[4]223互补双链；
BspT104 I酶切质粒片段/P [4] 56互补双链；
Kpn I酶切质粒片段/Gl [142]互补双链；
Bln I酶切质粒片段/G4 [208]互补双链；
Sac II酶切质粒片段/P[8] 296互补双链；
Xho I酶切质粒片段/G2 [87]互补双链；
将上述配对的各片段分别与T4 DNA连接酶及缓冲液混合后，在18°C连接反应6h，分别 得到下列六个重组质粒
在Sac I位点携带有P4[223]抗原表位基因的重组质粒pETP6F174S/P [4] 223 ；
在BspT104 I位点携带有P [4] 56抗原表位基因的重组质粒pETP6F/P [4] 56 ；
在Kpn I位点携带有Gl [142]抗原表位基因的重组质粒PETP6F/G1 [142]；
在Bln I位点携带有G4 [208]抗原表位基因的重组质粒pETP6F/G4 [208]；
在Sac II位点携带有P[8]296抗原表位基因的重组质粒pETP6F/P[8]296 ；
在Xho I位点携带有G2 [87]抗原表位基因的重组质粒pETP6F/G2[87]；
IF、将步骤IE得到的六个重组质粒，在下列条件下分别转化BL21 (DE3)感受态细胞
10u I的步骤IE的对应重组质粒与100 u I BL21(DE3)感受态细胞混匀，冰上放置30分钟，42°C放置70秒钟，加入500 u I LB培养液后，在37°C培养30分钟，培养物涂在含200 u g/ml氨节青霉素的I. 5%琼脂培养板,培养板于37°C培养14个小时,挑取单个菌落放入含200 u g/ml氨苄青霉素的LB培养液中培养和表达，分别得到
携带P4[223]抗原表位的重组蛋白rVP6F/P[4]223 ；
携带P [4] 56抗原表位的重组蛋白rVP6F/P[4]56 ；
携带Gl [142-152]抗原表位的重组蛋白rVP6F/Gl[142]；
携带G4[208-221]抗原表位的重组蛋白rVP6F/G4[208]；
携带P[8] 296抗原表位的重组蛋白rVP6F/P[8] 296 ；
携带/G2[87]抗原表位的重组蛋白rVP6F/G2[87]。本发明提供的同时携带有 P [4] 223、P [4] 56,Gl [142]、G4 [208]、P [8] 296 和 G2 [87]抗原表位的重组蛋白通过下列步骤制备
2A、同上述IA ；
2B、同上述IB ；
2C、同上述IC ；
2D、同上述ID ；
2E、同上述IE ；
2F、将步骤2E所得重组质粒pETP6F174S/P[4]223用BspT104 I酶切，并与步骤2C所得的在5’端和3’端分别带BspT104 I位点的P[4]56互补双链进行连接，得到在Sac I位点和BspT104 I位点携带有对应的P4[223]和P [4] 56抗原表位基因的重组质粒pETP6F/P[4]223/P[4]56 ；
2G、将步骤2F所得重组质粒pETP6F/P[4]223/P[4]56用Kpn I酶切，并与步骤2C所得的在5’端和3’端分别带Kpn I位点的Gl [142]互补双链进行连接，得到在Sac I位点、BspT104 I位点和Kpn I位点携带有对应的P4 [223]、P [4] 56和Gl [142]抗原表位基因的重组质粒 pETP6F/P [4] 223/P [4] 56/G1 [142]；
211、将步骤26所得重组质粒？￡了 6 / [4]223/ [4]56/61[142]用Bln I酶切，并与步骤2C所得的在5’端和3’端分别带Bln I位点的G4[208]互补双链进行连接，得到在Sac
I、BspT104 I, Kpn I 和 Bln I 位点携带有对应的 P4[223]、P[4] 56、Gl [142]和 G4[208]抗原表位基因的重组质粒 pETP6F/P[4]223/P[4]56/Gl[142]/ G4[208]；
21、将步骤 2H 所得重组质粒 pETP6F/P[4]223/P[4]56/Gl[142]/G4[208]用 Sac II 酶切，并与步骤2C所得的在5’端和3’端分别带Sac II位点的P[8]296互补双链进行连接，得到在 Sac I、BspT104 I、Kpn I、Bln I 和 Sac II 位点携带有对应的 P4[223]、P[4]56、Gl [142], G4 [208]和P [8] 296抗原表位基因的重组质粒
PETP6F/P[4]223/P[4]56/G1[142]/G4[208]/P[8]296 ；
2J、将步骤 21 所得重组质粒 pETP6F/P[4] 223/P[4] 56/G1 [142]/G4[208]/P[8] 296 用Xho I酶切，并与步骤2C所得的在5’端和3’端分别带Xho I位点的G2[87]互补双链进行连接，得到在Sac I、BspT104 I,Kpn I,Bln I,Sac II和Xho I位点携带有对应的P4[223]、P [4] 56、Gl [142]、G4 [208]、P [8] 296、G2[87]抗原表位基因的重组质粒pETP6F/P [4] 223/P [4] 56/G1 [142] /G4 [208] /P [8] 296/G2 [87];按常规将该重组质粒经菌体转化扩增后，进行酶切鉴定和核苷酸序列测定；
2K、将步骤2J得到重组质粒，在与IF相同的条件下转化BL21 (DE3)感受态细胞得到携带有不同抗原表位的下列重组蛋白
携带有 P[4] 223，P[4] 56，Gl [142]，G4[208], P[8] 296 和 G2[87]抗原表位的重组蛋白rVP ⑥ R。所述步骤ID或2D的携带有Sac I位点、BspT104 I位点、Kpn I位点、Bln I位点、Sac II位点及Xho I位点的重组轮状病毒VP6载体蛋白编码基因的质粒PETP6F通过下列步骤构建
I)人工设计下列引物对
P174F CATGAGCTCATGGGTACAATGTGG ；
P174R CATGAGCTCATGCGCAGGTTGTGA ；
P197F GATTATTCGAACATACAGCAATTTGAGCAT ；
P197R TATGTTCGAATAATCAAATCCAGCAAC ；
P244F GATGGTACCACATGGTATTTTAATCCA ；
P244R ；TGTGGTACCATCAGCTGAATTAATTAC ；
P275F GCACCTAGGTTTGGTACAATTGTA ；
P275R AAACCTAGGTGCCTGATAAGTATTTAT ；
P298F AGACCGCGGACCCCATCAGTCGCA ；
P298R GGTCCGCGGTCTCATCAATTGAAATGA ；
P308F GCACTCGAGCATCATGCTACTGTA ；
P308R ATGCTCGAGTGCTGCGACTGATGG ；
以及下列引物
PETL5 ATCATATGGAGGTTCTGTACTC ；
PVP6-3 TAGGATCCTTATCATTTAACAAGCATGCTTCTAAT ；2)以轮状病毒TB-Chen株VP6蛋白编码基因为模板，以下列为引物对，进行PCR扩增
PETL5/P174R 和 P174F/PVP6-3 ；
PETL5/P197R 和 P197F/PVP6-3 ；
PETL5/P244R 和 P244F/PVP6-3 ；
PETL5/P275R 和 P275F/PVP6-3 ；
PETL5/P298R 和 P298F/PVP6-3 ；
PETL5/P308R 和 P308F/PVP6-3 ；
具体是
在PCR反应体系为PCR反应混合液体积为100 ill，包含30ng模板DNA，I X IO5 pmol的dNTPs, IOX PCR缓冲液 IOii I，5U Taq DNA聚合酶，60pmol 的引物对PETL5/P174R和 P174F/PVP6-3，其余用水补足；PCR反应条件为94°C预变性3 min，94°C变性40s，56°C复性30s，72°C延伸反应lmin，共40个循环，最后72°C延伸10 min ;得到带有NdeI和Sac I位点序列的PCR扩增片段6174F和带有Sac I和BamH I位点序列的PCR扩增片段6174R ;用I. 5%的琼脂糖凝胶电泳分离和纯化该扩增片段；将PCR扩增片段6174F和6174R分别用Nde I/Sac I 和 Sac I/BamH I 双酶切，即
A、6174F酶切片段制备酶切反应体系为3iil的6174 片段，311的NdeI (15U)，3iU的Sac I (15U),8u I的IOX缓冲液，63 yl的水；将酶切混合液分别于37°C水浴反应3小时后，得酶切片段，用I. 5%的琼脂糖凝胶电泳分离和纯化该酶切片段；
B、除使用SacI/BamH I双酶切外，6174R酶切片段制备与6174F酶切片段相同；
C、酶切片段的连接将6174F和6174R酶切片段与T4DNA连接酶及缓冲液混合后，在18°C连接反应6h，得到携带有Sac I位点(gagctc)的VP6编码基因
3)运用步骤2)的PCR扩增、酶切和连接，使用对应的PETL5/P197R和P197F/PVP6-3引物对及内切酶Nde I/BspT104 I和BspT104 I/BamH I，在步骤2)获得的携带有Sac I位点的VP6编码基因上插入BspT104 I (ttcgaa)位点，得到携带有Sac I位点和BspT104 I位点的VP6编码基因；
4 )用与步骤2 )相同的PCR扩增、酶切和连接，使用对应的PETL5/P244R和P244F/PVP6-3引物对及内切酶Nde I/Kpn I和Kpn I/BamH I，在步骤3)所得携带有Sac I位点和BspT104 I位点的VP6编码基因上插入Kpn I (ggtacc)位点，得到携带有Sac I位点、BspT104 I位点及Kpn I (ggtacc)位点的VP6编码基因;
5)用与步骤2)相同的PCR扩增、酶切和连接，使用对应的PETL5/P275R和P275F/PVP6-3引物对及内切酶Nde I/Bln I和Bin I/BamH I，在步骤4)所得携带有Sac I位点、BspT104 I位点及Kpn I (ggtacc)位点的VP6编码基因上插入Bln I (cctagg)位点，得到携带有 Sac I 位点、BspT104 I 位点、Kpn I (ggtacc)位点及 Bln I (cctagg)位点的 VP6编码基因；
6 )用与步骤2 )相同的PCR扩增、酶切和连接，使用对应的PETL5/P298R和P298F/PVP6-3引物对及内切酶Nde I/Sac II和Sac I I/BamH I，在步骤5)所得携带有Sac I位点、BspT104 I位点、Kpn I (ggtacc)位点及Bln I (cctagg)位点的VP6编码基因上插入Sac II (ccgcgg)位点，得到携带有 Sac I 位点、BspT104 I 位点、Kpn I (ggtacc)位点、Sac II (ccgcgg)位点及Sac II (ccgcgg)位点的VP6编码基因；7)、用与步骤2)相同的PCR扩增、酶切和连接，使用对应的PETL5/P308R和P308F/PVP6-3引物对及内切酶Nde I/Xho I和Xho I/BamH I，在步骤6)所得携带有Sac I位点、BspT104 I 位点、Kpn I (ggtacc)位点、Bln I (ccgcgg)位点及 Sac II (ccgcgg)位点的VP6编码基因上插入Xho I (ctcgag)位点，得到携带有Sac I位点、BspT104 I位点、KpnI (ggtacc)位点、Bln I (ccgcgg)位点、Sac II (ccgcgg)位点及 Xho I (ctcgag)位点的VP6载体蛋白编码基因，该VP6F载体蛋白编码基因由1146个核苷酸组成，前端为编码蛋氨酸(M)的起始秘密子ATG，末端由2个终止密码子(TGA TAA)组成，其核苷酸序列为
I atggatgttt tgtattcat t atcaaaaact cttaaggatg ctagagacaa 51 aattgtcgaa ggcactttat actctaatgt tagtgatcta attcaacaat 101 ttaatcaaat gataattact atgaatggaa atgaatttca aactggagga 151 attggtaatc taccaaccag aaattggagt tttgattttg gtttacttgg 201 aactacgctt ttgaatttag atgccaatta tgttgaaact gcgcgtaaca 251 caattgatta ttttgttgat tttgtagata acgtatgtat ggatgagatg 301 gttagagaat cacaaagaaa cggaattgca ccgcagtcag aatcacttag 351 aaaactatca gggattaagt ttaaaagaat aaattttgac aattcgtcgg 401 aatacataga aaactggaac ttgcaaaata gaagacaaag aactggtttt 451 acatttcata aaccaaacat ctttccatat tcagcttcat ttacgttaaa 501 tagatcacaa cctgcgcatg_agctcatggg tacaatgtgg ttgaatgcag 551 gttcagagat tcaagttgct ggatttgatt attcRaacat acagcaattt 601 gagcatatag ttcagctccg tagggtgtta acgacggcta caataactct 651 tttaccagat gctgaaaggt ttagtttccc tagagtaatt aattcagctg 701 atRRtaccac atggtatttt aatccagtaa tacttagacc gaataatgtc 751 gaagtagaat ttctattgaa tggacagata ataaatactt atcaggcacc 801 taggtttggt acaattgtag ctagaaattt tgatactatt agattatcat 851 ttcaattgat gagaccgcgg accccatcag tcRcagcact CRaRcatcat 901 gctactgtag gactaacatt acgcattgaa tctgcaattt gtgagtcagt 951 gcttgctgat gctagtgaaa caatgttagc taatgtaaca tctgttagac 1001 aagaatatgc aataccagtt gggccagttt ttccaccagg tatgaattgg 1051 actgatttga ttactaacta ctcaccatct agagaggata atttacaacg 1101 tgtgtttaca gtagcttcca ttagaagcat gcttgttaaa tgataa
8)、将步骤7)得到的VP6载体蛋白编码基因用常规的基因克隆和重组技术，连接到pET表达质粒DNA的Nde I/BamH I位点，得到携带VP6F载体蛋白编码基因的重组质粒pET6F。所述步骤2 )的轮状病毒TB-Chen株为公知的病毒株。本发明具有下列优点和效果采用上述方案获得的各个携带轮状病毒不同抗原表位的重组嵌合蛋白，经免疫学Western Blot检测，所述各个重组嵌合蛋白均能与抗轮状病毒全病毒，抗轮状病毒的VP6和抗相应轮状病毒的VP4/VP7抗体发生特异性免疫反应。说明上述各个重组表达的重组嵌合蛋白具有VP6载体蛋白和所插入的轮状病毒抗原表位的良好的免疫反应性，且不具有传染性，没有毒力返祖和肠套叠等副作用，对进一步开发轮状病毒RV重组嵌合疫苗，具有较高的应用价值。
具体实施方式
实施例I
通过下列步骤构建携带有Sac I位点、BspT104 I位点、Kpn I位点、Bln I位点、SacII位点及Xho I位点的重组轮状病毒VP6载体蛋白编码基因的质粒PETP6F
1)人工设计下列引物对
P174F CATGAGCTCATGGGTACAATGTGG ；
P174R CATGAGCTCATGCGCAGGTTGTGA ；
P197F GATTATTCGAACATACAGCAATTTGAGCAT ；
P197R TATGTTCGAATAATCAAATCCAGCAAC ；
P244F GATGGTACCACATGGTATTTTAATCCA ；
P244R ； TGTGGTACCATCAGCTGAATTAATTAC ；
P275F GCACCTAGGTTTGGTACAATTGTA ；
P275R AAACCTAGGTGCCTGATAAGTATTTAT ；
P298F AGACCGCGGACCCCATCAGTCGCA ；
P298R GGTCCGCGGTCTCATCAATTGAAATGA ；
P308F GCACTCGAGCATCATGCTACTGTA ；
P308R ATGCTCGAGTGCTGCGACTGATGG ；
以及下列引物
PETL5 ATCATATGGAGGTTCTGTACTC ；
PVP6-3 TAGGATCCTTATCATTTAACAAGCATGCTTCTAAT ；
2)以公知的轮状病毒TB-Chen株VP6蛋白编码基因为模板，以下列为引物对，进行PCR扩增
PETL5/P174R 和 P174F/PVP6-3 ；
PETL5/P197R 和 P197F/PVP6-3 ；
PETL5/P244R 和 P244F/PVP6-3 ；
PETL5/P275R 和 P275F/PVP6-3 ；
PETL5/P298R 和 P298F/PVP6-3 ；
PETL5/P308R 和 P308F/PVP6-3 ；
具体是
在PCR反应体系为PCR反应混合液体积为100 ill，包含30ng模板DNA，I X IO5 pmol的dNTPs, IOX PCR缓冲液 IOii I，5U Taq DNA聚合酶，60pmol 的引物对PETL5/P174R和P174F/PVP6-3，其余用水补足；PCR反应条件为94°C预变性3 min，94°C变性40s，56°C复性30s，72°C延伸反应lmin，共40个循环，最后72°C延伸10 min ;得到带有NdeI和Sac I位点序列的PCR扩增片段6174F和带有Sac I和BamH I位点序列的PCR扩增片段6174R ;用I. 5%的琼脂糖凝胶电泳分离和纯化该扩增片段；将PCR扩增片段6174F和6174R分别用Nde I/Sac I 和 Sac I/BamH I 双酶切，即
A、6174F酶切片段制备酶切反应体系为3iil的6174 片段，311的Nde I (15U)，3iU的Sac I (15U),8u I的IOX缓冲液，63 yl的水；将酶切混合液分别于37°C水浴反应3小时后，得酶切片段，用I. 5%的琼脂糖凝胶电泳分离和纯化该酶切片段；
B、除使用SacI/BamH I双酶切外，6174R酶切片段制备与6174F酶切片段相同；
C、酶切片段的连接将6174F和6174R酶切片段与T4DNA连接酶及缓冲液混合后，在18°C连接反应6h，得到携带有Sac I位点(gagctc)的VP6编码基因
3)运用步骤2)的PCR扩增、酶切和连接，使用对应的PETL5/P197R和P197F/PVP6-3引物对及内切酶Nde I/BspT104 I和BspT104 I/BamH I，在步骤2)获得的携带有Sac I位点的VP6编码基因上插入BspT104 I (ttcgaa)位点，得到携带有Sac I位点和BspT104 I位点的VP6编码基因；
4)用与步骤2 )相同的PCR扩增、酶切和连接，使用对应的PETL5/P244R和P244F/PVP6-3引物对及内切酶Nde I/Kpn I和Kpn I/BamH I，在步骤3)所得携带有Sac I位点和BspT104 I位点的VP6编码基因上插入Kpn I (ggtacc)位点，得到携带有Sac I位点、BspT104 I位点及Kpn I (ggtacc)位点的VP6编码基因;
5)用与步骤2)相同的PCR扩增、酶切和连接，使用对应的PETL5/P275R和P275F/PVP6-3引物对及内切酶Nde I/Bln I和Bin I/BamH I，在步骤4)所得携带有Sac I位点、BspT104 I位点及Kpn I (ggtacc)位点的VP6编码基因上插入Bln I (cctagg)位点，得到携带有 Sac I 位点、BspT104 I 位点、Kpn I (ggtacc)位点及 Bln I (cctagg)位点的 VP6编码基因；
6 )用与步骤2 )相同的PCR扩增、酶切和连接，使用对应的PETL5/P298R和P298F/PVP6-3引物对及内切酶Nde I/Sac II和Sac I I/BamH I，在步骤5)所得携带有Sac I位点、BspT104 I位点、Kpn I (ggtacc)位点及Bln I (cctagg)位点的VP6编码基因上插入Sac II (ccgcgg)位点，得到携带有 Sac I 位点、BspT104 I 位点、Kpn I (ggtacc)位点、SacII (ccgcgg)位点及Sac II (ccgcgg)位点的VP6编码基因；
7)、用与步骤2)相同的PCR扩增、酶切和连接，使用对应的PETL5/P308R和P308F/PVP6-3引物对及内切酶Nde I/Xho I和Xho I/BamH I，在步骤6)所得携带有Sac I位点、BspT104 I 位点、Kpn I (ggtacc)位点、Bln I (ccgcgg)位点及 Sac II (ccgcgg)位点的VP6编码基因上插入Xho I (ctcgag)位点，得到携带有Sac I位点、BspT104 I位点、Kpn
I(ggtacc)位点、Bln I (ccgcgg)位点、Sac II (ccgcgg)位点及 Xho I (ctcgag)位点的VP6载体蛋白编码基因，该VP6F载体蛋白编码基因由1146个核苷酸组成，前端为编码蛋氨酸(M)的起始秘密子ATG，末端由2个终止密码子(TGA TAA)组成，其核苷酸序列为
I atggatgttt tgtattcatt atcaaaaact cttaaggatg ctagagacaa 51 aattgtcgaa ggcactttat actctaatgt tagtgatcta attcaacaat 101 ttaatcaaat gataattact atgaatggaa atgaatttca aactggagga 151 attggtaatc taccaaccag aaattggagt tttgattttg gtttacttgg 201 aactacgctt ttgaatttag atgccaatta tgttgaaact gcgcgtaaca 251 caattgatta ttttgttgat tttgtagata acgtatgtat ggatgagatg 301 gttagagaat cacaaagaaa cggaattgca ccgcagtcag aatcacttag 351 aaaactatca gggattaagt ttaaaagaat aaattttgac aattcgtcgg 401 aatacataga aaactggaac ttgcaaaata gaagacaaag aactggtttt 451 acatttcata aaccaaacat ctttccatat tcagcttcat ttacgttaaa、501 tagatcacaa cctgcgcatg_agctcatggg tacaatgtgg ttgaatgcag551 gttcagagat tcaagttgct ggatttgatt attcgaacat acagcaattt601 gagcatatag ttcagctccg tagggtgtta acgacggcta caataactct651 tttaccagat gctgaaaggt ttagtttccc tagagtaatt aattcagctg701 atggtaccac atggtatttt aatccagtaa tacttagacc gaataatgtc751 gaagtagaat ttctattgaa tggacagata ataaatactt atcaggcacc801 taggtttggt acaattgtag ctagaaattt tgatactatt agattatcat851 ttcaattgat gagaccgcgg accccatcag tcgcagcact cgagcatcat901 gctactgtag gactaacatt acgcattgaa tctgcaattt gtgagtcagt951 gcttgctgat gctagtgaaa caatgttagc taatgtaaca tctgttagac1001 aagaatatgc aataccagtt gggccagttt ttccaccagg tatgaattgg1051 actgatttga ttactaacta ctcaccatct agagaggata atttacaacg1101 tgtgtttaca gtagcttcca ttagaagcat gcttgttaaa tgataa
8)、将步骤7)得到的VP6载体蛋白编码基因用常规的基因克隆和重组技术，连接到pET表达质粒DNA的Nde I/BamH I位点，得到携带VP6F载体蛋白编码基因的重组质粒pET6F。
实施例2
本发明提供的携带有P[4]223抗原表位的重组蛋白通过下列步骤制备
A、根据抗原表位氨基酸序列，设计下列引物
P[4]223F CCCACCAATTCAAAATACTAGAAATGTAGTTCCAGAGCT ；
P[4]223R CTGGAACTACATTTCTAGTATTTTGAATTGGTGGGAGCT ；
B、将步骤A的引物进行下列配对
将VP4抗原表位P [4] 223的两条人工合成的寡核苷酸即正链P [4] 223F和负链P[4]223R 配成引物对P[4]223F/ P[4]223R ；
C、将步骤B的引物对在下列条件下进行退火，退火混合液中含有2iU的正向引物，
2Ul的反向引物，以及7 ill的PCR缓冲液和59 u I的水；将退火混合液于65°C水浴反应5分钟后，再于37°C水浴反应45分钟，反应体系中加入400 ii I的TE，并与等体积异丙醇充分混匀，室温放置10分钟后，4°C，15，OOOrpm离心15min，沉淀用质量浓度为75%的乙醇漂洗，干燥后，用10 Ul的TE溶解；得到在5’端和3’端分别带Sac I位点的互补双链P[4]223互补双链；
D、将携带有SacI位点的重组轮状病毒VP6载体蛋白编码基因的质粒pETP6F，在下列条件下用Sac I酶切酶切混合液含3 ill的Sac I内切酶(15U)，以及10 的pETP6FDNA,7u I的IOX缓冲液，50iU的水；将酶切混合液于37°C水浴反应3小时，得酶切质粒片段Sac I酶切质粒片段、用I. 5%的琼脂糖凝胶电泳分离和纯化所得酶切质粒片段；
E、将步骤D所得酶切质粒片段与步骤C所得互补双链进行如下相应的配对
Sac I酶切质粒片段/P [4] 223互补双链；
将配对的Sac I酶切质粒片段/P[4]223互补双链与T4 DNA连接酶及缓冲液混合后，在18°C连接反应6h，得到在Sac I位点携带有P4[223] 抗原表位基因的重组质粒pETP6F174S/P[4]223 ；
F、将步骤E得到的重组质粒pETP6F174S/P[4]223，在下列条件下转化BL21(DE3)感受态细胞=IOiIl的重组质粒pETP6F174S/P[4]223与IOOiIl的BL21 (DE3)感受态细胞混匀，冰上放置30分钟，42 °C放置70秒钟，加入500 的LB培养液后，在37°C培养30分钟，培养物涂含有200 u g/ml氨苄青霉素的I. 5%琼脂培养板，于37°C培养14个小时，挑取单个菌落放入含200 u g/ml氨苄青霉素的LB培养液中培养和表达，得到携带有P [4] 223抗原表位的重组蛋白rVP6/P[4]223。实施例3 A、引物设计为
P[4]56F CGAATGATTCAACTACAGTGGAACCAGTTTTAGATGGTCCTTATCAACCTT ；
P[4]56R CGAAGGTTGATAAGGACCATCTAAAACTGGTTCCACTGTAGTTGAATCATT ；
B、引物配对为将￥ 4抗原表位？[4]56的两条人工合成的寡核苷酸即正链P[4]56F和负链P[4]56R配成引物对P[4]56F/P[4]56R ；
C、同实施例2
D、将携带有BspT104I位点的重组轮状病毒VP6载体蛋白编码基因的质粒PETP6F，在与实施例2步骤D相同条件下用BspT104 I位点酶切，得酶切质粒片段BspT104 I酶切质粒片段；
E、将步骤D所得酶切质粒片段与步骤C所得互补双链进行如下相应的配对
BspT104 I酶切质粒片段/P [4] 56互补双链；
将配对的BspT104 I酶切质粒片段/P [4] 56互补双链与T4 DNA连接酶及缓冲液混合后，在18°C连接反应6h，得到在BspT104 I位点携带有P[4] 56抗原表位基因的重组质粒PETP6F/P[4]56 ；
F、将步骤E得到的重组质粒pETP6F/P[4]56在与实施例2步骤F相同的条件下转化BL21 (DE3)感受态细胞，得到携带有P[4]56抗原表位的重组蛋白rVP6F/P[4]56。实施例4 除引物为
Gl[142]F CATGAAATATGACCAAAGTCTTAAATTAGATATGGGTAC ；
Gl[142] R CCATATCTAATTTAAGACTTTGGTCATATTTCATGGTAC ；
酶切时将携带有Kpn I (RRtacc)位点的重组轮状病毒VP6载体蛋白编码基因的质粒PETP6F，用Kpn I酶切外，其余均同实施例2，得到携带Gl [142]抗原表位的重组蛋白rVP6F/Gl[142]。实施例5 除引物为
G4[208]F CTAGGCAAACGACAAATACAGCTACTTTTGAAACAGTTGCTGATC ；
G4[208]R CTAGGATCAGCAACTGTTTCAAAAGTAGCTGTATTTGTCGTTTGC ；
酶切时将携带有Bin I (ccrcrr)位点的重组轮状病毒VP6载体蛋白编码基因的质粒PETP6F，用Bln I酶切外，其余均同实施例2，得到携带G4 [208]抗原表位的重组蛋白rVP6F/G4[208]。实施例6 除引物为
P[8] 296F GGAAGGCAGCAAATTATCAATATAATTACTTACGTGACGGTGAACAAGTAACCGCACCGC ；P[8] 296R GGTGCGGTTACTTGTTCACCGTCACGTAAGTAATTATATTGATAATTTGCTGCCTTCCGC ；
酶切时将携带有P [8] 296位点的重组轮状病毒VP6载体蛋白编码基因的质粒pETP6F，用Sac II酶切外，其余均同实施例2，得到携带P[8] 296抗原表位的重组蛋白rVP6F/P[8]296。实施例7
除引物为
G2[87]F TCGAGGCAGAAGCTAAAAATGAGATTTCAGATGATGAATGGGAAAATACTC ； G2[87]R TCGAGAGTATTTTCCCATTCATCATCTGAAATCTCATTTTTAGCTTCTGCC ；
酶切时将携带有G2 [87]位点的重组轮状病毒VP6载体蛋白编码基因的质粒PETP6F，用Xho I酶切外，其余均同实施例2，得到携带G2[87]抗原表位的重组蛋白rVP6F/G2[87]。实施例8
携带有 P [4] 223、P [4] 56、Gl [142]、G4 [208]、P [8] 296 和 G2 [87]抗原表位的重组蛋白通过下列步骤制备
A、同实施例2步骤A;
B、同实施例2步骤B;
C、同实施例2步骤C;
D、同实施例2步骤D;
E、同实施例2步骤E;
F、将步骤E所得重组质粒pETP6F174S/P[4]223用BspT104I酶切，并与步骤C所得的在5’端和3’端分别带BspT104 I位点的P [4] 56互补双链进行连接，得到在Sac I位点和BspT104 I位点携带有对应的P4[223]和P[4] 56抗原表位基因的重组质粒pETP6F/P[4]223/P[4]56 ；
G、将步骤F所得重组质粒pETP6F/P[4] 223/P [4] 56用Kpn I酶切，并与步骤C所得的在5’端和3’端分别带Kpn I位点的Gl [142]互补双链进行连接，得到在Sac I位点、BspT104I位点和Kpn I位点携带有对应的P4[223]、P [4] 56和Gl [142]抗原表位基因的重组质粒PETP6F/P[4]223/P[4]56/G1[142]；
!1、将步骤6所得重组质粒？￡了 6 / [4]223/ [4]56/61[142]用Bln I酶切，并与步骤C所得的在5’端和3’端分别带Bln I位点的G4[208]互补双链进行连接，得到在Sac I、BspT104 I, Kpn I 和 Bln I 位点携带有对应的 P4[223]、P[4]56、Gl [142]和 G4[208]抗原表位基因的重组质粒 pETP6F/P[4]223/P[4]56/Gl[142]/ G4[208]；
1、将步骤!1所得重组质粒？￡1 6 / [4]223/ [4]56/61[142]/64[208]用 Sac II 酶切，并与步骤C所得的在5’端和3’端分别带Sac II位点的P[8]296互补双链进行连接，得到在 Sac I、BspT104 I,Kpn I,Bln I 和 Sac II 位点携带有对应的P4[223]、P[4] 56、G1 [142]、G4[208]和P [8] 296抗原表位基因的重组质粒
PETP6F/P[4]223/P[4]56/G1[142]/G4[208]/P[8]296 ；
J、将步骤 I 所得重组质粒口￡1 6 / [4]223/ [4]56/61[142]/64[208]/ [8]296 用父110I酶切，并与步骤C所得的在5’端和3’端分别带Xho I位点的G2[87]互补双链进行连接，得到在 Sac I、BspT104 I, Kpn I, Bln I, Sac II 和 Xho I 位点携带有对应的 P4[223]、P [4] 56、Gl [142]、G4 [208]、P [8] 296、G2[87]抗原表位基因的重组质粒pETP6F/P [4] 223/P [4] 56/G1 [142] /G4 [208] /P [8] 296/G2 [87]；按常规将该重组质粒经菌体转化扩增后，进行酶切鉴定和核苷酸序列测定；
K、将步骤J得到的重组质粒，在与实施例2步骤F相同的条件下转化BL21 (DE3)感受态细胞，得到携带有P [4] 223，P [4] 56，Gl [142]，G4 [208]，P [8] 296和G2 [87]抗原表位的重组蛋白rVP6F⑥R。本发明所得各个携带轮状病毒不同抗原表位的重组嵌合蛋白，经下列免疫学Western Blot 检测
1)将携带有轮状病毒P[4] 223抗原表位的重组蛋白rVP6/P [4] 223，携带有轮状病毒P[4] 56抗原表位的重组蛋白1^ 6 外[4]56，携带有轮状病毒61[142]抗原表位的重组蛋白rVP6F/Gl[142]，携带有轮状病毒G4[208]抗原表位的重组蛋白rVP6F/G4 [208]，携带有轮状病毒P [8] 296抗原表位的重组蛋白rVP6F/P[8]296，携带有轮状病毒G2[87]抗原表位的重组蛋白 rVP6F/G2[87]，和同时携带 P[4]223、P[4]56、Gl [142]、G4[208]、P[8]296 和G2[87]六个抗原表位的重组蛋白rVP6F⑥R，以及用作对照的重组轮状病毒NSP2蛋白和用作对照的牛血清白蛋白，各取g分别溶于20iU水，分别加入5iU 5X变性缓冲液，混匀后，在100。。变性5min ；
2)将上述I)的变性蛋白样品分别用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳(10%SDS-PAGE)分离，并在电压15V、电流50mA的条件下，电泳转印25 min,转移到PVDF膜上；将膜置于含5%脱脂奶粉的PBS/T液中于4° C封闭过夜；
3)用PBS/T洗膜5次，分别加入抗轮状病毒全病毒豚鼠免疫血清抗体(5%脱脂奶粉1:400稀释)，或抗重组轮状病毒VP6蛋白豚鼠免疫血清抗体(1%脱脂奶粉1:400稀释)，或抗重组轮状病毒NSP2蛋白豚鼠免疫血清抗体(1%脱脂奶粉1:400稀释)，或抗重组轮状病毒VP4蛋白豚鼠免疫血清抗体(1%脱脂奶粉1:400稀释)，或抗重组轮状病毒VP7蛋白豚鼠免疫血清抗体(1%脱脂奶粉1:400稀释)，于37°C孵育I. 5 h ;用PBS/T液洗膜5次，每次
5min ；
4)加入HRP标记的羊抗豚鼠IgG(1:2，000如上稀释)，于371孵育I h ;用PBS/T漂洗5次，DAB显色；显色后，用蒸馏水漂洗膜，终止显色，观察并分析结果如下
携带有轮状病毒P [4] 223抗原表位的重组蛋白rVP6/P [4] 223，携带有轮状病毒P [4] 56抗原表位的重组蛋白1^ 6 外[4]56，携带有轮状病毒61[142]抗原表位的重组蛋白rVP6F/Gl [142]，携带有轮状病毒G4 [208]抗原表位的重组蛋白rVP6F/G4 [208]，携带有轮状病毒P[8]296抗原表位的重组蛋白rVP6F/P[8]296，携带有轮状病毒G2[87]抗原表位的重组蛋白rVP6F/G2 [87]，均能与抗轮状病毒全病毒豚鼠免疫血清抗体发生特异性免疫反应，均能与抗轮状病毒VP6蛋白豚鼠免疫血清抗体发生特异性免疫反应，不能与抗重组轮状病毒NSP2蛋白豚鼠免疫血清抗体发生特异性免疫反应。携带有轮状病毒P[4]223抗原表位的重组蛋白rVP6/P[4]223，携带有轮状病毒P [4] 56抗原表位的重组蛋白rVP6F/P [4] 56，和携带有轮状病毒P [8] 296抗原表位的重组蛋白rVP6F/P[8]296，均能与轮状病毒VP4蛋白豚鼠免疫血清抗体发生特异性免疫反应。携带有轮状病毒Gl [142]抗原表位的重组蛋白rVP6F/Gl[142]，携带有轮状病毒G4[208]抗原表位的重组蛋白rVP6F/G4[208]，携带有轮状病毒G2[87]抗原表位的重组蛋白rVP6F/G2[87]，均能与轮状病毒VP7蛋白免疫豚鼠血清抗体发生特异性免疫反应。、
同时携带P [4] 223、P [4] 56、Gl [142]、G4 [208]、P [8] 296 和 G2 [87]六个抗原表位的重组蛋白rVP6F⑥R，能与抗轮状病毒全病毒豚鼠免疫血清抗体发生特异性免疫反应，能与抗轮状病毒VP6蛋白豚鼠免疫血清抗体发生特异性免疫反应，能与轮状病毒VP4蛋白豚鼠免疫血清抗体发生特异性免疫反应，能与轮状病毒VP7蛋白免疫豚鼠血清抗体发生特异性免疫反应，不能与抗重组轮状病毒NSP2蛋白豚鼠免疫血清抗体发生特异性免疫反应。用作阴性对照的重组轮状病毒NSP2蛋白只能 与抗重组轮状病毒NSP2蛋白豚鼠血清抗体发生特异性免疫反应。用作阴性对照的牛血清白蛋白，不能与上述所有检测抗体发生特异性免疫反应。结论上述所有的重组嵌合蛋白均具有载体蛋白和所携带的抗原表位特异的抗原反应性。序列表
携带轮状病毒P[4]223抗原表位的重组蛋白的氨基酸序列
Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys He ValGlu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu He Gln Gln Phe Asn Gln Met He IleThr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly He Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn TrpSer Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val GluThr Ala Arg Asn Thr He Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp GluMet Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly He Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys LeuSer Gly He Lys Phe Lys Arg He Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr He Glu Asn TrpAsn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn He Phe ProTyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Pro Pro He GlnAsn Thr Arg Asn Val Val Pro Glu Leu Met Gly Thr Met Trp Leu Asn Ala Gly Ser GluHe Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn He Gln Gln Phe Glu His He Val Gln LeuArg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr He Thr Leu Leu Pro Asp Ala Glu Arg Phe Ser PhePro Arg Val He Asn Ser Ala Asp Gly Thr Thr Trp Tyr Phe Asn Pro Val He Leu ArgPro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly Gln He He Asn Thr Tyr Gln AlaPro Arg Phe Gly Thr He Val Ala Arg Asn Phe Asp Thr He Arg Leu Ser Phe Gln LeuMet Arg Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu His His Ala Thr Val Gly Leu ThrLeu Arg He Glu Ser Ala He Cys Glu Ser Val Leu Ala Asp Ala Ser Glu Thr Met LeuAla Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala He Pro Val Gly Pro Val Phe Pro ProGly Met Asn Trp Thr Asp Leu He Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg Glu Asp Asn Leu GlnArg Val Phe Thr Val Ala Ser He Arg Ser Met Leu Val LysP [4] 223抗原表位的氨基酸序列
Leu Pro Pro He Gln Asn Thr Arg Asn Val Val Pro。
携带轮状病毒P [4] 56抗原表位的重组蛋白的氨基酸序列
Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys He ValGlu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu He Gln Gln Phe Asn Gln Met He IleThr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly He Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn TrpSer Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val GluThr Ala Arg Asn Thr He Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp GluMet Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly He Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys LeuSer Gly He Lys Phe Lys Arg He Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr lie Glu Asn TrpAsn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn lie Phe ProTyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Met Gly Thr MetTrp Leu Asn Ala Gly Ser Glu He Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn Asp Ser ThrThr Val Glu Pro Val Leu Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Ser Asn lie Gln Gln Phe Glu HisHe Val Gln Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr He Thr Leu Leu Pro Asp Ala GluArg Phe Ser Phe Pro Arg Val He Asn Ser Ala Asp Gly Thr Thr Trp Tyr Phe Asn ProVal He Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly Gln lie lie AsnThr Tyr Gln Ala Pro Arg Phe Gly Thr He Val Ala Arg Asn Phe Asp Thr lie Arg LeuSer Phe Gln Leu Met Arg Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu His His Ala ThrVal Gly Leu Thr Leu Arg He Glu Ser Ala He Cys Glu Ser Val Leu Ala Asp Ala SerGlu Thr Met Leu Ala Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala lie Pro Val Gly ProVal Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu He Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg GluAsp Asn Leu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser lie Arg Ser Met Leu Val Lys
P [4] 56抗原表位的氨基酸序列
Asn Asp Ser Thr Thr Val Glu Pro Val Leu Asp Gly Pro Tyr Gln Pro。携带轮状病毒Gl [142]抗原表位的重组蛋白的氨基酸序列
Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys He ValGlu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu He Gln Gln Phe Asn Gln Met He IleThr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly He Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn TrpSer Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val GluThr Ala Arg Asn Thr He Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp GluMet Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly He Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys LeuSer Gly He Lys Phe Lys Arg He Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr He Glu Asn TrpAsn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn He Phe ProTyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Met Gly Thr MetTrp Leu Asn Ala Gly Ser Glu He Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn He Gln GlnPhe Glu His He Val Gln Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr He Thr Leu Leu ProAsp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val He Asn Ser Ala Asp Gly Thr Met Lys TyrAsp Gln Ser Leu Lys Leu Asp Met Gly Thr Thr Trp Tyr Phe Asn Pro Val He Leu ArgPro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly Gln He He Asn Thr Tyr Gln AlaPro Arg Phe Gly Thr He Val Ala Arg Asn Phe Asp Thr He Arg Leu Ser Phe Gln LeuMet Arg Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu His His Ala Thr Val Gly Leu ThrLeu Arg He Glu Ser Ala He Cys Glu Ser Val Leu Ala Asp Ala Ser Glu Thr Met LeuAla Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala He Pro Val Gly Pro Val Phe Pro ProGly Met Asn Trp Thr Asp Leu He Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg Glu Asp Asn Leu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser He Arg Ser Met Leu Val LysGl [142]的氨基酸序列Met Lys Tyr Asp Gln Ser Leu Lys Leu Asp Met。携带轮状病毒G4[208]抗原表位的重组蛋白的氨基酸序列
Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys He ValGlu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu He Gln Gln Phe Asn Gln Met He IleThr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly He Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn TrpSer Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val GluThr Ala Arg Asn Thr He Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp GluMet Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly He Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys LeuSer Gly He Lys Phe Lys Arg He Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr He Glu Asn TrpAsn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn He Phe ProTyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Met Gly Thr MetTrp Leu Asn Ala Gly Ser Glu He Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn He Gln GlnPhe Glu His He Val Gln Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr He Thr Leu Leu ProAsp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val He Asn Ser Ala Asp Gly Thr Thr Trp TyrPhe Asn Pro Val He Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly GlnHe He Asn Thr Tyr Gln Ala Pro Arg Gln Thr Thr Asn Thr Ala Thr Phe Glu Thr ValAla Asp Pro Arg Phe Gly Thr He Val Ala Arg Asn Phe Asp Thr He Arg Leu Ser PheGln Leu Met Arg Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu His His Ala Thr Val GlyLeu Thr Leu Arg He Glu Ser Ala He Cys Glu Ser Val Leu Ala Asp Ala Ser Glu ThrMet Leu Ala Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala He Pro Val Gly Pro Val PhePro Pro Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu He Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg Glu Asp AsnLeu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser He Arg Ser Met Leu Val Lys
G4[208]的氨基酸序列Gln Thr Thr Asn Thr Ala Thr Phe Glu Thr Val Ala Asp0携带轮状病毒P [8] 296抗原表位的重组蛋白的氨基酸序列
Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys He ValGlu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu He Gln Gln Phe Asn Gln Met He IleThr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly He Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn TrpSer Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val GluThr Ala Arg Asn Thr He Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp GluMet Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly He Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys LeuSer Gly He Lys Phe Lys Arg He Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr He Glu Asn TrpAsn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn He Phe ProTyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Met Gly Thr MetTrp Leu Asn Ala Gly Ser Glu He Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn He Gln GlnPhe Glu His He Val Gln Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr He Thr Leu Leu ProAsp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val He Asn Ser Ala Asp Gly Thr Thr Trp TyrPhe Asn Pro Val He Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly GlnHe He Asn Thr Tyr Gln Ala Pro Arg Phe Gly Thr He Val Ala Arg Asn Phe Asp ThrHe Arg Leu Ser Phe Gln Leu Met Arg Pro Arg Lys Ala Ala Asn Tyr Gln Tyr Asn TyrLeu Arg Asp Gly Glu Gln Val Thr Ala Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu HisHis Ala Thr Val Gly Leu Thr Leu Arg He Glu Ser Ala lie Cys Glu Ser Val Leu AlaAsp Ala Ser Glu Thr Met Leu Ala Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala lie ProVal Gly Pro Val Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu lie Thr Asn Tyr Ser ProSer Arg Glu Asp Asn Leu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser lie Arg Ser Met Leu ValLys
P [8] 296的氨基酸序列
Lys Ala Ala Asn Tyr Gln Tyr Asn Tyr Leu Arg Asp Gly Glu Gln Val Thr Ala。携带轮状病毒G2 [87]抗原表位重组蛋白的氨基酸序列 Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys He ValGlu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu He Gln Gln Phe Asn Gln Met He IleThr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly He Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn TrpSer Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val GluThr Ala Arg Asn Thr He Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp GluMet Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly He Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys LeuSer Gly He Lys Phe Lys Arg He Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr He Glu Asn TrpAsn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn He Phe ProTyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Met Gly Thr MetTrp Leu Asn Ala Gly Ser Glu He Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn He Gln GlnPhe Glu His He Val Gln Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr He Thr Leu Leu ProAsp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val He Asn Ser Ala Asp Gly Thr Thr Trp TyrPhe Asn Pro Val He Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly GlnIle He Asn Thr Tyr Gln Ala Pro Arg Phe Gly Thr He Val Ala Arg Asn Phe Asp ThrHe Arg Leu Ser Phe Gln Leu Met Arg Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu AlaGlu Ala Lys Asn Glu He Ser Asp Asp Glu Trp Glu Asn Thr Leu Glu His His Ala ThrVal Gly Leu Thr Leu Arg He Glu Ser Ala He Cys Glu Ser Val Leu Ala Asp Ala SerGlu Thr Met Leu Ala Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala He Pro Val Gly ProVal Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu He Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg GluAsp Asn Leu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser He Arg Ser Met Leu Val Lys
G2[87]的氨基酸序列
Ala Glu Ala Lys Asn Glu He Ser Asp Asp Glu Trp Glu Asn Thr0携带有轮状病毒P [4] 223、P [4] 56，Gl [142]，G4 [208]，P [8] 296 和 G2 [87]抗原表位重组蛋白的氨基酸序列
Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys He ValGlu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu He Gln Gln Phe Asn Gln Met He IleThr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly He Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn TrpSer Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val GluThr Ala Arg Asn Thr He Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp GluMet Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly He Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys LeuSer Gly He Lys Phe Lys Arg He Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr lie Glu Asn TrpAsn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn lie Phe ProTyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Pro Pro lie GlnAsn Thr Arg Asn Val Val Pro Glu Leu Met Gly Thr Met Trp Leu Asn Ala Gly Ser GluHe Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn Asp Ser Thr Thr Val Glu Pro Val Leu AspGly Pro Tyr Gln Pro Ser Asn He Gln Gln Phe Glu His lie Val Gln Leu Arg Arg ValLeu Thr Thr Ala Thr He Thr Leu Leu Pro Asp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg ValHe Asn Ser Ala Asp Gly Thr Met Lys Tyr Asp Gln Ser Leu Lys Leu Asp Met Gly ThrThr Trp Tyr Phe Asn Pro Val He Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu LeuAsn Gly Gln He He Asn Thr Tyr Gln Ala Pro Arg Gln Thr Thr Asn Thr Ala Thr PheGlu Thr Val Ala Asp Pro Arg Phe Gly Thr lie Val Ala Arg Asn Phe Asp Thr lie ArgLeu Ser Phe Gln Leu Met Arg Pro Arg Lys Ala Ala Asn Tyr Gln Tyr Asn Tyr Leu ArgAsp Gly Glu Gln Val Thr Ala Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu Ala Glu AlaLys Asn Glu He Ser Asp Asp Glu Trp Glu Asn Thr Leu Glu His His Ala Thr Val GlyLeu Thr Leu Arg He Glu Ser Ala He Cys Glu Ser Val Leu Ala Asp Ala Ser Glu ThrMet Leu Ala Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala lie Pro Val Gly Pro Val PhePro Pro Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu He Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg Glu Asp AsnLeu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser lie Arg Ser Met Leu Val Lys0
引物
P[4]223F CCCACCAATTCAAAATACTAGAAATGTAGTTCCAGAGCT ；
P[4]223R CTGGAACTACATTTCTAGTATTTTGAATTGGTGGGAGCT ；
P[4]56F CGAATGATTCAACTACAGTGGAACCAGTTTTAGATGGTCCTTATCAACCTT ；
P[4]56R CGAAGGTTGATAAGGACCATCTAAAACTGGTTCCACTGTAGTTGAATCATT ；
Gl[142] F CATGAAATATGACCAAAGTCTTAAATTAGATATGGGTAC ；
Gl[142]R CCATATCTAATTTAAGACTTTGGTCATATTTCATGGTAC ；
G4[208]F CTAGGCAAACGACAAATACAGCTACTTTTGAAACAGTTGCTGATC ；
G4[208]R CTAGGATCAGCAACTGTTTCAAAAGTAGCTGTATTTGTCGTTTGC ；
P[8] 296F GGAAGGCAGCAAATTATCAATATAATTACTTACGTGACGGTGAACAAGTAACCGCACCGC ；
P[8] 296R GGTGCGGTTACTTGTTCACCGTCACGTAAGTAATTATATTGATAATTTGCTGCCTTCCGC ；G2[87]F TCGAGGCAGAAGCTAAAAATGAGATTTCAGATGATGAATGGGAAAATACTC ；
G2[87]R TCGAGAGTATTTTCCCATTCATCATCTGAAATCTCATTTTTAGCTTCTGCC ；
携带有 Sac I 位点、BspT104 I 位点、Kpn I (RRtacc)位点、Bin I (ccrcrr)位点、Sac
II(ccrcrr)位点及Xho I (ctcRaR)位点的VP6载体蛋白编码基因的核苷酸序列:
I atggatgttt tgtattcatt atcaaaaact cttaaggatg ctagagacaa51 aattgtcgaa ggcactttat actctaatgt tagtgatcta attcaacaat101 ttaatcaaat gataattact atgaatggaa atgaatttca aactggagga151 attggtaatc taccaaccag aaattggagt tttgattttg gtttacttgg 201 aactacgctt ttgaatttag atgccaatta tgttgaaact gcgcgtaaca251 caattgatta ttttgttgat tttgtagata acgtatgtat ggatgagatg301gttagagaatcacaaagaaacggaattgcaccgcagtcagaatcacttag
351aaaactatcagggattaagtttaaaagaataaattttgacaattcgtcgg
401aatacatagaaaactggaacttgcaaaatagaagacaaagaactggtttt
451acatttcataaaccaaacatctttccatattcagcttcatttacgttaaa
501tagatcacaacctgcgcatg_agctcatgggtacaatgtggttgaatgcag
551gttcagagattcaagttgctggatttgattattcgaacatacagcaattt
601gagcatatagttcagctccgtagggtgttaacgacggctacaataactct
651tttaccagatgctgaaaggtttagtttccctagagtaattaattcagctg
701atggtaccacatggtattttaatccagtaatacttagaccgaataatgtc
751gaagtagaatttctattgaatggacagataataaatacttatcaggcacc
801taggtttggtacaattgtagctagaaattttgatactattagattatcat
851ttcaattgatgagaccgcggaccccatcagtcgcagcactcgagcatcat
901gctactgtaggactaacattacgcattgaatctgcaatttgtgagtcagt
951gcttgctgatgctagtgaaacaatgttagctaatgtaacatctgttagac
1001aagaatatgcaataccagttgggccagtttttccaccaggtatgaattgg
1051actgatttgattactaactactcaccatctagagaggataatttacaacg
1101tgtgtttacagtagcttccattagaagcatgcttgttaaatgataa。
权利要求
1.一种携带轮状病毒P[4]223抗原表位的重组蛋白，其特征在于其氨基酸序列为 Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys He ValGlu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu He Gln Gln Phe Asn Gln Met He IleThr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly He Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn TrpSer Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val GluThr Ala Arg Asn Thr He Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp GluMet Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly He Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys LeuSer Gly He Lys Phe Lys Arg He Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr He Glu Asn TrpAsn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn He Phe ProTyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Pro Pro He GlnAsn Thr Arg Asn Val Val Pro Glu Leu Met Gly Thr Met Trp Leu Asn Ala Gly Ser GluHe Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn He Gln Gln Phe Glu His He Val Gln LeuArg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr He Thr Leu Leu Pro Asp Ala Glu Arg Phe Ser PhePro Arg Val He Asn Ser Ala Asp Gly Thr Thr Trp Tyr Phe Asn Pro Val He Leu ArgPro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly Gln He He Asn Thr Tyr Gln AlaPro Arg Phe Gly Thr He Val Ala Arg Asn Phe Asp Thr He Arg Leu Ser Phe Gln LeuMet Arg Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu His His Ala Thr Val Gly Leu ThrLeu Arg He Glu Ser Ala He Cys Glu Ser Val Leu Ala Asp Ala Ser Glu Thr Met LeuAla Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala He Pro Val Gly Pro Val Phe Pro ProGly Met Asn Trp Thr Asp Leu He Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg Glu Asp Asn Leu GlnArg Val Phe Thr Val Ala Ser He Arg Ser Met Leu Val Lys其中，P[4] 223抗原表位的氨基酸序列为Leu Pro Pro He Gln Asn Thr Arg Asn Val Val Pro。
2.一种携带轮状病毒P[4]56抗原表位的重组蛋白，其特征在于其氨基酸序列为Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys He ValGlu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu He Gln Gln Phe Asn Gln Met He IleThr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly He Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn TrpSer Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val GluThr Ala Arg Asn Thr He Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp GluMet Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly He Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys LeuSer Gly He Lys Phe Lys Arg He Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr He Glu Asn TrpAsn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn He Phe ProTyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Met Gly Thr MetTrp Leu Asn Ala Gly Ser Glu He Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn Asp Ser ThrThr Val Glu Pro Val Leu Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Ser Asn He Gln Gln Phe Glu HisHe Val Gln Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr He Thr Leu Leu Pro Asp Ala GluArg Phe Ser Phe Pro Arg Val He Asn Ser Ala Asp Gly Thr Thr Trp Tyr Phe Asn ProVal He Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly Gln He He AsnThr Tyr Gln Ala Pro Arg Phe Gly Thr He Val Ala Arg Asn Phe Asp Thr He Arg LeuSer Phe Gln Leu Met Arg Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu His His Ala ThrVal Gly Leu Thr Leu Arg He Glu Ser Ala lie Cys Glu Ser Val Leu Ala Asp Ala SerGlu Thr Met Leu Ala Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala lie Pro Val Gly ProVal Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu lie Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg GluAsp Asn Leu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser lie Arg Ser Met Leu Val Lys其中，P [4] 56抗原表位的氨基酸序列为Asn Asp Ser Th r Thr Val Glu Pro Val Leu Asp Gly Pro Tyr Gln Pro。
3.一种携带轮状病毒Gl [142]抗原表位的重组蛋白，其特征在于其氨基酸序列为Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys He ValGlu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu He Gln Gln Phe Asn Gln Met He IleThr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly He Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn TrpSer Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val GluThr Ala Arg Asn Thr He Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp GluMet Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly He Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys LeuSer Gly He Lys Phe Lys Arg He Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr He Glu Asn TrpAsn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn He Phe ProTyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Met Gly Thr MetTrp Leu Asn Ala Gly Ser Glu He Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn He Gln GlnPhe Glu His He Val Gln Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr He Thr Leu Leu ProAsp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val He Asn Ser Ala Asp Gly Thr Met Lys TyrAsp Gln Ser Leu Lys Leu Asp Met Gly Thr Thr Trp Tyr Phe Asn Pro Val He Leu ArgPro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly Gln He He Asn Thr Tyr Gln AlaPro Arg Phe Gly Thr He Val Ala Arg Asn Phe Asp Thr He Arg Leu Ser Phe Gln LeuMet Arg Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu His His Ala Thr Val Gly Leu ThrLeu Arg He Glu Ser Ala He Cys Glu Ser Val Leu Ala Asp Ala Ser Glu Thr Met LeuAla Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala He Pro Val Gly Pro Val Phe Pro ProGly Met Asn Trp Thr Asp Leu He Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg Glu Asp Asn Leu GlnArg Val Phe Thr Val Ala Ser He Arg Ser Met Leu Val Lys 其中，Gl[142]的氨基酸序列为Met Lys Tyr Asp Gln Ser Leu Lys Leu Asp Met。
4.一种携带轮状病毒G4[208]抗原表位的重组蛋白，其特征在于其氨基酸序列为Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys He ValGlu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu He Gln Gln Phe Asn Gln Met He IleThr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly He Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn TrpSer Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val GluThr Ala Arg Asn Thr He Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp GluMet Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly He Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys LeuSer Gly He Lys Phe Lys Arg He Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr He Glu Asn TrpAsn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn He Phe ProTyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Met Gly Thr MetTrp Leu Asn Ala Gly Ser Glu He Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn lie Gln GlnPhe Glu His He Val Gln Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr lie Thr Leu Leu ProAsp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val lie Asn Ser Ala Asp Gly Thr Thr Trp TyrPhe Asn Pro Val He Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly GlnHe He Asn Thr Tyr Gln Ala Pro Arg Gln Thr Thr Asn Thr Ala Thr Phe Glu Thr ValAla Asp Pro Arg Phe Gly Thr He Val Ala Arg Asn Phe Asp Thr lie Arg Leu Ser PheGln Leu Met Arg Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu His His Ala Thr Val GlyLeu Thr Leu Arg He Glu Ser Ala He Cys Glu Ser Val Leu Ala Asp Ala Ser Glu ThrMet Leu Ala Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala lie Pro Val Gly Pro Val Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu He Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg Glu Asp AsnLeu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser lie Arg Ser Met Leu Val Lys 其中G4[208]的氨基酸序列为Gln Thr Thr Asn Thr Ala Thr Phe Glu Thr Val AlaAsp。
5.一种携带轮状病毒P[8]296抗原表位的重组蛋白，其特征在于其氨基酸序列为Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys He ValGlu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu He Gln Gln Phe Asn Gln Met He IleThr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly He Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn TrpSer Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val GluThr Ala Arg Asn Thr He Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp GluMet Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly He Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys LeuSer Gly He Lys Phe Lys Arg He Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr He Glu Asn TrpAsn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn He Phe ProTyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Met Gly Thr MetTrp Leu Asn Ala Gly Ser Glu He Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn He Gln GlnPhe Glu His He Val Gln Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr He Thr Leu Leu ProAsp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val He Asn Ser Ala Asp Gly Thr Thr Trp TyrPhe Asn Pro Val He Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly GlnHe He Asn Thr Tyr Gln Ala Pro Arg Phe Gly Thr He Val Ala Arg Asn Phe Asp ThrHe Arg Leu Ser Phe Gln Leu Met Arg Pro Arg Lys Ala Ala Asn Tyr Gln Tyr Asn TyrLeu Arg Asp Gly Glu Gln Val Thr Ala Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu HisHis Ala Thr Val Gly Leu Thr Leu Arg He Glu Ser Ala He Cys Glu Ser Val Leu AlaAsp Ala Ser Glu Thr Met Leu Ala Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala He ProVal Gly Pro Val Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu He Thr Asn Tyr Ser ProSer Arg Glu Asp Asn Leu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser He Arg Ser Met Leu ValLys 其中，P[8] 296的氨基酸序列为Lys Ala Ala Asn Tyr Gln Tyr Asn Tyr Leu Arg Asp Gly Glu Gln Val Thr Ala0
6.一种携带轮状病毒G2[87]抗原表位的重组蛋白，其特征在于其氨基酸序列为Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys He ValGlu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu lie Gln Gln Phe Asn Gln Met lie lieThr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly lie Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn TrpSer Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val GluThr Ala Arg Asn Thr He Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp GluMet Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly He Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys LeuSer Gly He Lys Phe Lys Arg He Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr lie Glu Asn TrpAsn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn lie Phe ProTyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Met Gly Thr MetTrp Leu Asn Ala Gly Ser Glu He Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn lie Gln GlnPhe Glu His He Val Gln Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr lie Thr Leu Leu ProAsp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val He Asn Ser Ala Asp Gly Thr Thr Trp TyrPhe Asn Pro Val He Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly GlnHe He Asn Thr Tyr Gln Ala Pro Arg Phe Gly Thr lie Val Ala Arg Asn Phe Asp Thr He Arg Leu Ser Phe Gln Leu Met Arg Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu AlaGlu Ala Lys Asn Glu He Ser Asp Asp Glu Trp Glu Asn Thr Leu Glu His His Ala ThrVal Gly Leu Thr Leu Arg He Glu Ser Ala He Cys Glu Ser Val Leu Ala Asp Ala SerGlu Thr Met Leu Ala Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala lie Pro Val Gly ProVal Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu lie Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg GluAsp Asn Leu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser lie Arg Ser Met Leu Val Lys其中，G2[87]的氨基酸序列为Ala Glu Ala Lys Asn Glu lie Ser Asp Asp Glu Trp Glu Asn Thr0
7. 一种同时携带有轮状病毒 P[4]223、P[4]56，Gl [142], G4[208]，P[8]296 和 G2[87]抗原表位重组蛋白，其特征在于其氨基酸序列Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys He ValGlu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu He Gln Gln Phe Asn Gln Met He IleThr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly He Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn TrpSer Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val GluThr Ala Arg Asn Thr He Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp GluMet Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly He Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys LeuSer Gly He Lys Phe Lys Arg He Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr He Glu Asn TrpAsn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn He Phe ProTyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Pro Pro He GlnAsn Thr Arg Asn Val Val Pro Glu Leu Met Gly Thr Met Trp Leu Asn Ala Gly Ser GluHe Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn Asp Ser Thr Thr Val Glu Pro Val Leu AspGly Pro Tyr Gln Pro Ser Asn He Gln Gln Phe Glu His He Val Gln Leu Arg Arg ValLeu Thr Thr Ala Thr He Thr Leu Leu Pro Asp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg ValHe Asn Ser Ala Asp Gly Thr Met Lys Tyr Asp Gln Ser Leu Lys Leu Asp Met Gly ThrThr Trp Tyr Phe Asn Pro Val He Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu LeuAsn Gly Gln He He Asn Thr Tyr Gln Ala Pro Arg Gln Thr Thr Asn Thr Ala Thr PheGlu Thr Val Ala Asp Pro Arg Phe Gly Thr lie Val Ala Arg Asn Phe Asp Thr lie ArgLeu Ser Phe Gln Leu Met Arg Pro Arg Lys Ala Ala Asn Tyr Gln Tyr Asn Tyr Leu ArgAsp Gly Glu Gln Val Thr Ala Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu Ala Glu AlaLys Asn Glu He Ser Asp Asp Glu Trp Glu Asn Thr Leu Glu His His Ala Thr Val GlyLeu Thr Leu Arg He Glu Ser Ala He Cys Glu Ser Val Leu Ala Asp Ala Ser Glu ThrMet Leu Ala Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala lie Pro Val Gly Pro Val PhePro Pro Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu He Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg Glu Asp AsnLeu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser lie Arg Ser Met Leu Val Lys0全文摘要
本发明提供一种携带轮状病毒抗原表位的重组嵌合蛋白及其制备，分别是携带有轮状病毒P[4]223，P[4]56、G1[142]、G4[208]、P[8]296、G2[87]抗原表位的六个重组蛋白，以及同时同时携带有P[4]223、P[4]56、G1[142]、G4[208]、P[8]296和G2[87]抗原表位的重组蛋白，经免疫学WesternBlot检测，所述各个重组嵌合蛋白均能与抗轮状病毒全病毒，抗轮状病毒的VP6和抗相应轮状病毒的VP4/VP7抗体发生特异性免疫反应。说明上述各个重组表达的重组嵌合蛋白具有VP6载体蛋白和所插入的轮状病毒抗原表位的良好的免疫反应性，且不具有传染性，没有毒力返祖和肠套叠等副作用，对进一步开发轮状病毒RV重组嵌合疫苗，具有较高的应用价值。
文档编号C12N15/70GK102643348SQ20121011259
公开日2012年8月22日 申请日期2012年4月17日 优先权日2012年4月17日
发明者陈元鼎 申请人:中国医学科学院医学生物学研究所