专利名称：四氢呋喃醚衍生物可裂解连接单元及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及化学合成和生物化学领域，具体涉及ー种可用于DNA合成测序的四氢呋喃醚衍生物可裂解连接单元及其用途。
背景技术：
DNA测序技术是现代生物学研究中重要的手段之一。人类基因组计划完成后，DNA测序技术得到了迅速发展。DNA测序(DNA sequencing)是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)的排列方式。发展精确、高通量、低成本的DNA测序方法对于生物、医药科学等具有非常重要的意义。
合成法测序(Sequencing By Synthesis, SBS)是新一代DNA测序技术之一。合成法测序方法通过把大量被测的模板DNA片段进行固定，并在固定化的DNA测序模板上杂交结合通用的DNA引物，分别控制4种核苷酸在DNA引物上的延伸。通过检测延伸反应过程或延伸核苷酸，实现高通量并行的DNA序列信息的检测。在合成法测序中，首先要合成DNA链延长的四种核苷酸原料，又叫“可逆终端”(reversible terminator)。这类核苷酸除了要求3'-轻基阻断外，为了不影响下ー个指示核苷酸的并入和识别，还要求通过ー个可裂解的连接单元把核苷酸和指示分子，例如荧光素，连接起来。然后，在下ー个指示核苷酸并入之前，在温和的条件下使这个连接单元断裂，继续DNA链的延长，从而读出DNA碱基的序列。该连接单元对合成法测序的读长和效率有重要的影响，因此，人们也一直致力于发展新的可裂解连接单元，来提高DNA测序的效率。目前已报道的连接单元有还原剂敏感(ニ硫键，偶氮化合物)；光裂解(邻硝基苄基衍生物，苯甲酰甲基酯衍生物及其它光可裂解连接单元)；亲电子试剂/酸敏感(酸裂解；叠氮化合物)；金属作用下的裂解；氧化剂敏感等。然而这些连接単元都存在各自不同的缺点与局限性(Bioorganic&Medicinal Chemistry 2012,20,571-582)。可裂解连接单元对合成法测序的读长和效率有重要的影响，而现有的连接单元存在裂解条件不够温和、裂解效率不高，用于测序时读长太短等缺点，因此，设计、合成新的可裂解连接单元，并探索合适的裂解条件对于提高测序的效率、发展新的测序方法有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术存在的不足，提供一类新的可用于DNA合成测序的四氢呋喃醚衍生物可裂解连接单元及其用途。在合成测序中，该类连接単元的断裂效果即测序效果与原料的手性因素无关，也就是说在合成的四氢呋喃环衍生物中，无论是顺式、反式或二者的混合物都可用于测序，并具有相同的作用。该类化合物合成原料简单易得，合成过程均为常规化学反应，易于实现大量合成。该类化合物可与核苷酸和荧光素实现高效率的连接。通过研究该类化合物的裂解性能，发现该类化合物在温和的条件下可以实现高效率的裂解，具有应用于DNA测序的价值。
发明人在前期工作中，发展了一种可裂解连接单元，该类连接単元包含四氢吡喃醚和四氢呋喃醚两种(申请号201110331659. I)，可用于DNA合成测序。与前期工作相比，本发明进一步改进了 T系列化合物的合成方法，并增加了 YZ和ZY系列化合物，在T系列化合物改进的合成方法中，避免了使用剧毒化学品MsCl，同时减少了一步反应。并且反应原料不再局限于L谷氨酸，也可以为D型或DL型谷氨酸，所合成的四氢呋喃衍生物无论是顺式，反式或二者的混合物均可用于DNA合成测序，并具有相似的裂解性能。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的第一方面，本发明涉及ー种四氢呋喃醚衍生物可裂解连接单元，其结构式如式(I)所示
权利要求
1.ー种四氢呋喃醚衍生物可裂解连接单元，其特征在于，其结构式如式(I)所示
2.根据权利要求I所述的四氢呋喃醚衍生物可裂解连接单元，其特征在于，所述可裂解单元的结构式如式(II)所示
3.根据权利要求2所述的四氢呋喃醚衍生物可裂解连接单元，其特征在于，所述式(I)中η为21 44中的任意ー个整数。
4.根据权利要求2所述的四氢呋喃醚衍生物可裂解连接单元，其特征在于，所述可裂解连接单元是通过以下步骤合成的a、T-I的合成取D，L或DL-谷氨酸，在盐酸和亚硝酸钠作用下，发生环化反应得到T-I ； b、T-2的合成T-1在硼烷的醚类溶剂中，发生还原反应得Τ-2； c、T-3的合成取T-2，以ニ氯甲烷做溶剂，加入咪唑，惰性气体保护下和ニ甲基叔丁基氯娃烧反应得T-3 ； d、T-4的合成以ニ氯甲烷做溶剤，T-3在惰性气体保护及冰盐浴下和ニ异丁基氢化铝反应，得T-4 ； e、当η= O吋，Τ-6的合成取Τ-4，以ニ氯甲烷做溶剂，加入溴こ醇和离子交换树脂Α-15，在40 50°C回流I 3h，反应得T-6 ； 当n= i 44吋，T-6’的合成取T-4，以ニ氯甲烷做溶剂，加入溴代三聚こニ醇和Amberlyst A-15,在 40 50°C 回流 I 3h,反应得 T-6’ ； f、T-7或T-7’的合成以四氢呋喃做溶剂，在四丁基氟化铵作用下，T-6或T-6’脱羟基保护，反应得到T-7或T-7’ ； g、T-8或T-8’的合成T-7或Τ-7’在氨水中发生取代反应，得Τ-8或Τ_8’，Τ_8或Τ-8’即所述四氢呋喃醚衍生物可裂解连接单元。
5.根据权利要求I所述的四氢呋喃醚衍生物可裂解连接单元，其特征在于，所述可裂解单元的结构式如式(III)所示
6.根据权利要求5所述的四氢呋喃醚衍生物可裂解连接单元，其特征在于，所述可裂解単元是通过以下步骤合成的 a、YZl的合成丙ニ酸ニこ酯与2-溴-1，I-ニ甲氧基こ烷反应得到YZl； b、YZ2的合成YZ1在こ醚、四氢铝锂作用下，发生还原反应得到ΥΖ2； c、ΥΖ3的合成ΥΖ2在樟脑磺酸吡啶盐ニ氯甲烷溶液中发生环化反应得到ΥΖ3； d、YZ4的合成YZ3与苄基溴反应得到ΥΖ4；e、YZ5的合成YZ4在酸性条件下与1，4_ニ氧六环反应，去羟基保护基得到ΥΖ5 ； f、YZ6的合成YZ5与溴こ醇反应得到ΥΖ6； g、YZ7的合成YZ6在钯碳催化剂作用下，脱苄基得到ΥΖ7； h、YZ8的合成YZ7在氨水中发生氨化反应得到ΥΖ8，ΥΖ8即所述的四氢呋喃醚衍生物可裂解连接单元。
7.根据权利要求I所述的四氢呋喃醚衍生物可裂解连接单元，其特征在于，所述可裂解单元的结构式如式(IV)所示
8.根据权利要求7所述的四氢呋喃醚衍生物可裂解连接单元，其特征在于，所述可裂解连接单元是通过以下步骤合成的 a、ZYl的合成Y-丁内酯与甲酸甲酯在氢化钠存在下反应得ZYl； b、ZY2的合成ZY1在こ醚、甲酸甲酯的作用下，发生还原反应得到ΖΥ2； c、ΖΥ3的合成'1X1与苄基溴反应得到ΖΥ3；d、ZY4的合成ZY3在酸性条件下与1，4_ニ氧六环反应，去羟基保护基得到ΖΥ4 ； e、ZY5的合成ZY4与溴こ醇反应得到ΖΥ5； f、ZY6的合成ZY5在钯碳催化剂的作用下，脱苄基得到ΖΥ6； g、ZY7的合成ZY6在氨水中发生氨化反应得到ΖΥ7，ΖΥ7即所述的四氢呋喃醚衍生物可裂解连接单元。
9.一种如权利要求I所述的四氢呋喃醚衍生物可裂解连接单元在DNA合成测序中的用途。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，包括如下步骤将所述四氢呋喃醚衍生物可裂解连接单元连接核苷酸和荧光素，用于DNA合成测序。
全文摘要
本发明公开了四氢呋喃醚衍生物可裂解连接单元及其用途；本发明的可裂解连接单元，结构式如下式所示，其中，n为0～44中的任意一个整数。本发明的四氢呋喃环衍生物中，无论是顺式、反式或二者的混合物都可用于测序，并具有相同的作用；该类化合物合成原料简单易得，合成过程均为常规化学反应，易于实现大量合成；该类化合物可与核苷酸和荧光素实现高效率的连接；通过研究该类化合物的裂解性能，发现该类化合物在温和的条件下可以实现高效率的裂解，具有应用于DNA测序的价值。
文档编号C12Q1/68GK102675262SQ20121013269
公开日2012年9月19日 申请日期2012年4月28日 优先权日2012年4月28日
发明者伍新燕, 庄园, 沈玉梅, 邵志峰, 郭勋祥, 黎庆, 龚兵 申请人:上海交通大学