专利名称：一种检测SKA1基因表达的方法及其siRNA的用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种抑制SKAl基因表达的siRNA，该siRNA的核苷酸序列以及含有该siRNA编码DNA的重组载体，以及它们的用途。本发明还涉及了可以从组织或者细胞中有效检测SKAl基因表达的逆转录引物，以及该引物在肿瘤诊断中的应用。
背景技术：
RNA干扰是指由双链RNA诱发的基因沉默现象，主要通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑制基因表达。研究表明，长度为21 23nt的小干扰RNA分子(small interferingRNA, siRNA)是引起 RNA 干扰的直接原因(Tuschl T, Zamore PD, Sharp PA, BartelDP.RNA1: double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to23 nucleotide intervals.Cell 2000,101:25-33.)。RNA 干扰在抑制基因表达方面具有高效性、简单性和特异性，目前在基因功能研究和疾病治疗中发挥了重要作用。近几年来，RNA干扰已经在肿瘤治疗方面也取得了一些成果(Uprichard, Susan L.The therapeuticpotential of RNA interference.FEBS Letters 2005,579:5996-6007)。
SKAl (The spindle and kinetochore associated complex subunit I)基因定位于染色体18q21.1，编码含有255个氨基酸、分子量约为30kDa的蛋白。目前对SKAl蛋白结构的研究还不深入，只明确了其在N端具有卷曲螺旋结构域(Rual JF, Venkatesan K, HaoT, et al.Towards a proteome—scale map of the human protein-protein interactionnetwork.Nature 2005;437:1173-1178.Sauer G, Korner R, Hanisch A, et al.Proteomeanalysis of the human mitotic spindle.Mol Cell Proteomics 2005;4:35-43.)。最初质谱分析结果表明，SKAl蛋白被确定为纺锤体的组成部分(Cheeseman IM, BrewC, Wolyniak M, et al.1mplication of a novel multiprotein Damlp complex in outerkinetochore function.J Cell Biol.2001; 155:1137-1145.)。后来通过酵母双杂试验,发现了纺锤体着丝点复合物(The spindle and kinetochore associated complex, SKA)的另一个亚基SKA2，体外和体内研究结果均表明，SKAl和SKA2相互作用形成稳定的复合体，对于SKA2的稳定以及SKA蛋白在着丝点和微管中的定位是必须的(Hanisch A.，Sillje HHW,Nigg EA.Timely anaphase onset requires a novel spindle and kinetochore complexcomprising Skal and Ska2.EMBO J.2006; 25:5504-5515.)。SKA 复合体对于有丝分裂至关重要，可以使所有染色体的着丝点都排列在赤道板平面上，这对于确保染色体均等分配和维持基因组稳定性十分必要。有丝分裂后期，染色体在纺锤体着丝点微管的作用下移向两极，并导致纺锤体检查点沉默，在这个过程中SKAl复合体也是必须的蛋白。然而在当时的研究中，SKAl在染色体分离中的作用并没有阐述清楚。2009年在Dev Cell和EMBO J杂志上的报道阐述了 SKAl复合体在着丝点和微管界面上发挥功能，并与微管直接作用，在微管上形成低聚装配体，沿着微管以一种解聚-偶联的方式运动，参与有丝分裂期间染色体的运动(Welburn JPI, Grishchuk EL, Backer CB, et al.The human kinetochore Skalcomplex facilitates microtubule depolymerization-coupled motility.Dev Cell2009;16:374-385.)D基因组研究表明，SKAl基因所处的18q21.1与慢性淋巴细胞白血病的发生有关(Crowther-Swanepoel D, Broderick P, Di Bernardo MC, et al.Common variants at2q37.3, 8q24.21, 15q21.3 and 16q24.1 influence chronic lymphocytic leukemiarisk.Nature genetics 2010;42:132-136.)。这意味着SKAl可能通过调节有丝分裂过程、细胞周期进展的方式参与肿瘤细胞的恶性增殖。另外，在最初解析SKAl功能的研究中，以微管解聚药物噻氨酯咕唑(nocodazole)和秋水仙碱(colchicine)处理细胞，发现SKAl在着丝点中的积聚水平降低；对阻滞于有丝分裂期间的细胞，加nocodazole处理，可导致SKAl和微管先后从着丝点上脱离；相反地，当细胞免除了 nocodazole的处理时，SKAl蛋白在着丝点上的定位得以恢复，相应的，纺锤体重新形成。而微管稳定剂紫杉醇(taxol)，并没有影响 SKAl 在着丝点上的定位(Sauer G,Korner R, Hanisch A, et al.Proteome analysisof the human mitotic spindle.Mol Cell Proteomics 2005; 4:35-43.)。这些研究都提不了 SKAl可能影响某些抗肿瘤药物敏感性。但是目前并没有关于SKAl与化疗耐药的报道，了解SKAl蛋白在骨肉瘤中的功能以及对原发耐药的影响，具有很强的临床实用价值。逆转录PCR,或者称反转录 PCR (reverse transcription-PCR, RT-PCR),是聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)的一种广泛应用方式。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。该技术在疾病诊断领域具有广阔的应用前景。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题就是针对目前在肿瘤原发耐药临床诊断和治疗中缺乏有效的预测肿瘤原发耐药的分子诊断标记物和治疗肿瘤原发耐药的分子靶点，提供一种有效的解决方法，即一组能够有效抑制SKAl基因表达的siRNA，所述siRNA作用的标靶序列以及能够从组织及细胞中检测SKAl基因表达的逆转录PCR引物和它们在制备或筛选抗肿瘤药物中的应用。本发明解决上述技术问题采取的技术方案之一是:一种分离的SKAl基因小分子干扰核糖核酸(siRNA)标靶DNA，其中所述标靶DNA是:(I)SKAl编码基因上的连续15 27个核苷酸组成的DNA ；(2) SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:4 中任意一条 DNA ;或(3)与(I)或(2)所述的DNA在严紧杂交条件下杂交的多核苷酸组成的DNA，或者与其互补的DNA。本发明所述分尚的SKAl基因小分子干扰核糖核酸(siRNA)标祀DNA分子,较佳地由SKAl编码区基因上的连续10 30个核苷酸构成，更佳地为15 27个核苷酸组成的DNA ;最佳地，本发明所述SKAl小分子干扰核糖核酸的标靶基因是SEQ ID NO:1 SEQ IDNO:4中任意一条DNA分子。
其中所述杂交条件根据测量杂交时所用条件的严紧性程度来分类。严紧性程度可以核酸结合复合物或探针的解链温度Tm为依据，或者以杂交液的盐或离子强度条件为依据。所述杂交较佳地在标准条件下进行，可根据“分子克隆”中描述的方式进行=ColdSpring Harbor Laboratory Press,分子生物学中的通用方案(Current Protocols inMolecular Biology)。更佳地,多聚核苷酸杂交可以按照如下步骤进行,将一个载有被转录的待测DNA或RNA分子的膜与一个标记探针在杂交缓冲液中进行杂交。杂交缓冲液的组成为0.lwt%SDS、5 wt°/4t酸右旋糖苷、加入1/20的稀释抑制剂以及2 8XSSC。20XSSC为3M氯化钠和0.3M的柠檬酸组成的溶液。杂交温度为5(T70°C。在培养几个小时或过夜后，用清洗缓冲液清洗膜。清洗温度较佳地为室温，优选为杂交温度。清洗缓冲液的组成较佳地为6XSSC+0.1%SDS (wt)溶液，优选为5XSSC+0.1%SDS (wt)。当用这种清洗缓冲液清洗完膜后，就可以通过在DNA或RNA分子内被杂交的探针上的标记来识别DNA或RNA分子。本发明解决上述技术问题采取的技术方案之二是:本发明所述标靶DNA在筛选抗肿瘤药物中的应用。本发明所述标靶DNA在筛选抗肿瘤药物中的应用较佳地为作为药物靶点。所述药物靶点是指药物在体内的作用结合位点，选择确定新颖的有效药物点靶是新药开发的首要任务。合理化药物设计(rational drug design)可以依据生命科学研究中所揭示的包括酶、受体、离子通道、核酸等潜在的药物作用靶位，或其内源性配体以及天然底物的化学结构特征来设计药物分子，以发现选择性作用于靶点的新药。通过药物靶点的选择和利用，可以大大提高筛选抗肿瘤药物的效率，缩短抗肿瘤药物研究的周期。本发明解决上述技术问题采取的技术方案之三是:一种重组载体，其中所述重组载体包含本发明所述的标 靶DNA或包含SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:8中任意一条序列。其中所述的标靶DNA包括人工合成的DNA分子或通过PCR等技术从基因组中扩增分离到的DNA分子。本发明所述的重组载体优选地包含SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:8中任
意一条序列。其中所述的重组载体选自本领域常规的由逆转录病毒衍生的载体。所述的病毒衍生的载体包括慢病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关载体、疱疫病毒载体或痘苗病毒载体等，本发明优选慢病毒载体。慢病毒载体的优点是它们能使编码siRNA的DNA整合到宿主细胞的基因组中，得以产生特定基因被特异性阻抑的细胞系，某些病毒载体可用于体内转化细胞，从而可直接操纵体内和整个生物的基因表达。慢病毒载体主要是以人类免疫缺陷型病毒(HIV)为基础，通过去除enV、Vif、Vpr、vpu等毒性基因改造而来，用水泡口炎病毒G糖蛋白来代替HIV-1的包膜进行包装，宿主范围广，能增加病毒的滴度。慢病毒载体的毒性基因已被删除并被外源基因取代，属于假型病毒，并且该病毒感染细胞后不能再感染其它细胞，生物安全性高。慢病毒载体对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，并可以在体内较长期稳定的表达。本发明所用的慢病毒载体选自本领域常规的慢病毒载体，优选为pFHlUGW载体。本发明解决上述技术问题采取的技术方案之四是:一种抑制SKAl基因表达的小分子干扰核糖核酸(siRNA)，其中所述的siRNA包括正义RNA片段和反义RNA片段，所述正义RNA片段包含如上所述标靶DNA编码的RNA分子，所述正义RNA片段和反义RNA片段能够互补形成双链RNA分子。本发明所述siRNA是一种寡聚RNA分子(长度一般在2广25核苷酸)。siRNA的主要功能是激发与之互补的目标mRNA的沉默。本发明所述siRNA包括正义RNA片段和反义RNA片段，所述正义RNA片段和反义RNA片段通过彼此间互补碱基的互补配对作用形成双链RNA区域。当正义RNA片段和反义RNA片段位于不同的RNA链时，形成双链RNA分子；当正义RNA片段和反义RNA片段位于同一条RNA链时，则形成具有颈环结构的单链RNA分子。本发明所述的小分子干扰核糖核酸(siRNA)长度为较佳地为8 50个核苷酸，其正义片段和反义片段之间互补区域的碱基对较佳地为15 18个碱基对。本发明所述siRNA优选地为:SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:8任意一条序列及其互补序列所编码的RNA，所述的siRNA包括形成双链的RNA分子或单链的RNA分子。本发明中所述的核糖核酸分子(DNA)或者脱氧核糖核酸分子(RNA)通过人工合成的方式或者通过从基因组扩增的方式获得，其方法均为本领域常规使用的方法。本发明所述siRNA包括人工合成的双链干扰RNA(dsRNA)，转染细胞后在细胞内通过Dicer酶系统加工获得的siRNA ;通过人工合成直接获得的siRNA ;或者通过构建相应的慢病毒载体，在标祀细胞内持续表达获得的siRNA。本发明解决上述技术问题采取的技术方案之五是:一种慢病毒颗粒，其中所述慢病毒颗粒包含本发明所述的重组载体。所述慢病毒颗粒(Lentivirus)是以HIV-1 (人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒颗粒制备方法较佳地包括以下步骤:将siRNA干扰的目的片段构建到慢病毒载体中，然后与包装载体共转染到真核细胞中，所述真核细胞优选地为293T细胞，经过培养后进行慢病毒的回收纯化，即得 包装好的慢病毒颗粒。本发明通过siRNA技术沉默SKAl基因，一较佳的实例包括如下步骤:首先根据SKAl基因的mRNA设计RNA干扰的序列，然后化学全合成编码该RNA分子的DNA分子，将该DNA插入质粒中，获得的重组质粒转染293T细胞,包装成重组慢病毒。该重组慢病毒的shRNACshort hairpin RNA, shRNA)表达框中含有本发明所述siRNA编码序列。然后用于转染肿瘤细胞。重组慢病毒进入细胞后，可能经过了如下步骤:利用逆转录酶转录出cDNA，然后将含有本发明的cDNA重组到细胞基因组中，利用宿主细胞的酶系统，转录出本发明所述针对SKAl基因的shRNA，本发明的SKAlshRNA与RNaseIII核酶家族的Dicer结合，并将其剪切成本发明的siRNA。随后siRNA与若干个蛋白组成的RNA诱导沉默复合体(RNA-1nducedsilencing complex, RISC)结合,解旋成单链,并由该复合体主导RNAi效应。RISC被活化后，活化型RISC受已成单链的siRNA引导，序列特异性地结合在SKAl基因mRNA上并切断SKAl基因mRNA，引发SKAl基因mRNA的特异性分解。本发明解决上述技术问题采取的技术方案之六是:一种SKAl基因沉默的细胞模型，所述细胞模型包含本发明所述的慢病毒颗粒。本发明所述细胞模型较佳地为真核细胞，更佳地为肿瘤细胞，优选的为人骨肉瘤细胞或结直肠癌肿瘤细胞。本发明所述的SKAl基因沉默的细胞模型的制备方法较佳地包括将本发明所述的慢病毒颗粒转染真核细胞。其中所述的转染方法为本领域常规方法，如DEAE-葡聚糖法，磷酸钙法，阳离子脂质体法，阳离子聚合物法，病毒介导法，生物颗粒传法(基因枪粒子轰击法)，显微注射法，电穿孔法等，本发明优选磷酸钙法。将包装好的慢病毒颗粒转染到细胞系中，进行筛选，得到稳定遗传的基因沉默细胞模型。其中所述细胞系较佳地为真核细胞系，本发明优选人骨肉瘤细胞，直结肠肿瘤细胞。本发明所述的SKAl基因沉默的细胞模型的制备方法的一较佳实例包括:将包装成功的重组慢病毒感染人肿瘤细胞，然后用嘌呤霉素进行筛选，挑取筛选的肿瘤细胞克隆，用western-blot方法检测不同的肿瘤细胞克隆的SKAl蛋白量的情况。结果表明编码本发明siRNA的DNA序列成功重组到肿瘤细胞基因组中，而且初步证实本发明的siRNA序列能够抑制SKAl基因的表达。然后挑取SKAl蛋白量较低的肿瘤细胞克隆，连续传代2代、4代、6代、8代后，用Trizol提取肿瘤细胞mRNA，半定量RT-PCR方法分析肿瘤细胞中SKAlmRNA的降解情况。表明本发明的SKAlsiRNA能够有效降解肿瘤细胞SKAl基因的mRNA。提取传代6次和8次的肿瘤细胞克隆中的蛋白，用western-blot方法检测细胞内SKAl蛋白的含量，表明本发明的siRNA序列能够稳定抑制SKAl基因的表达。本发明的SKAl基因的siRNA能够有效降解SKAl基因的mRNA，从而抑制SKAl基因的表达。本发明已经成功的用RNA干扰技术来抑制SKAl基因的表达，获得了 SKAl基因沉默的细胞模型。本发明的细胞模型与本领域常规的肿瘤细胞培养方法、保存、活化、传代一样，通常用10%血清的DMEM培养基，在37°C、含5%C02的细胞培养箱中进行培养，用含20%血清、10% DMSO的DMEM培养基作为冻存液冻存细胞。用含0.25%胰酶和0.02%EDTA的细胞消化液进行消化。本发明解决上述技术问题采取的技术方案之七是:本发明所述的SKAl基因沉默的细胞模型在筛选抗肿瘤药物中的应用。所述SKAl基因沉默的细胞模型在筛选抗肿瘤药物中的应用较佳地包括以下步骤:( 1)使候选药物与SKAl基因沉默的肿瘤细胞接触；(2)测试肿瘤细胞的数目；(3)选择使肿瘤数目下降的候选药物。本发明利用未进行SKAl基因沉默的普通肿瘤细胞作为对照组。根据本发明，所述的肿瘤细胞较佳地包括人骨肉瘤细胞或结直肠癌肿瘤细胞。利用本发明建立的细胞模型可进行肿瘤原发耐药性机制以及肿瘤增殖和扩增方面的研究。本发明解决上述技术问题采取的技术方案之八是:本发明所述的小分子干扰核糖核酸(siRNA)在制备抗肿瘤药物中的应用。实验证实SKAl基因在肿瘤细胞的原发耐药过程中有重要作用。含有SKAl-siRNA的慢病毒颗粒感染了骨肉瘤原发耐药细胞株后，通过荧光定量PCR和免疫印迹实验证实内源性SKAl基因的mRNA和蛋白水平都显著降低。内源性SKAl表达受到抑制后，骨肉瘤原发耐药细胞株细胞的增殖能力、致瘤能力都显著降低，对抗肿瘤药物的敏感性大大增强。本发明所述小分子干扰核糖核酸(siRNA)应用于抗肿瘤药物的制备和筛选，较佳地作为一种抗肿瘤药物的增敏剂。本发明所述应用较佳地包括一种药物组合物，所述药物组合物至少包括一种本发明所述的小分子干扰核糖核酸(siRNA)作为活性成分和一种药学上可接受的载体。其中所述的药物组合物制备方法较佳地采取本领域常规的方法，将本发明所述siRNA作为活性成分，与药学上可接受的载体制成各种剂型。其中所述的载体是本领域常规的药用载体，如填充剂、稀释剂和赋形剂等。在各种制剂中，活性成分的重量含量较佳地为
0.1% 99.9%，优选的重量含量为0.5 90%。本发明解决上述技术问题采取的技术方案之九是:一种SKAl基因的逆转录PCR引物。本发明所述SKAl基因的逆转录PCR引物分子包括单链DNA，通过体外人工合成或通过本领域其他常规技术例如从基因组中分离扩增等方法制备而得。本发明所述的引物为一段寡聚单链DNA或RNA分子，可结合在核酸链上与之互补的区域，其功为核苷酸聚合作用的起始点，核酸聚合酶可由其3'端开始合成新的核酸链。体外人工设计的引物被广泛用于聚合酶链反应、测序和探针合成等。本发明还提供所述SKAl基因的逆转录PCR引物分子在肿瘤诊断中的应用。所述应用一较佳实例是:以样本组织或细胞中提取的RNA为模板，利用本发明所述SKAl基因的逆转录PCR引物分子，逆转录合成cDNA，再以cDNA为模板扩增目标片段，检测组织样本或细胞中SKAl基因的表达量变化，从而诊断肿瘤或肿瘤细胞的发育状况。本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。相比于现有技术，本发明的有益效果如下:本发明设计了针对SKAl基因的逆转录PCR引物，RNA干扰靶点序列，构建相应的SKAl shRNA表达载体，其中siRNA能够显著下调SKAl基因在mRNA水平和蛋白水平的表达。使用慢病毒作为基因操作工具携带RNA干扰载体pHllUGW-SKAl-siRNA-l能够靶向地将针对SKAl基因的RNA干扰序列高效导入人骨肉瘤细胞Saos-2、SF-86和人结直肠癌细胞RK0，显著降低SKAl基因的表达水平，显著提高上述肿瘤细胞的化疗药物敏感性，使其原发耐药细胞株细胞的增殖能力、致瘤能力都显著降低，是骨肉瘤和结直肠肿瘤的潜在临床非手术治疗方式之一。本发明提供的SKAl基因的逆转录PCR引物，该引物能够通过检测SKAl基因在细胞或组织内的表达量变化，对肿瘤进行诊断。·
以下结合
本发明的特征和有益效果。图1是载体图谱。图2是siRNA阳性克隆鉴定图谱。图3是MTX药敏试验结果。图4是IFO药敏实验结果。图5是荧光定量PCR结果柱状图。
具体实施例方式下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所述的“室温”是指进行试验的操作间的温度，一般为25°C。实施例1针对SKAl的siRNA设计通过Invitrogen的在线siRNA设计软件,选取网站评价较高的四条siRNA序列。通过NCBI网站，对siRNA序列进行比对分析(Blast分析)。发现这四条siRNA序列与除SKAl以外的其他基因没有显著地同源性。四条针对SKAl的siRNA序列见表I。表ISKAl基因的siRNA作用标靶序列
权利要求
1.一种分离的SKAl基因小分子干扰核糖核酸(SiRNA)标靶DNA，其特征在于，所述标靶DNA是: (1)SKAl编码基因上的连续15 27个核苷酸组成的DNA； (2)SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:4中任意一条序列；或 (3)与(I)或(2)所述的DNA在严紧杂交条件下杂交的多核苷酸组成的DNA，或者与其互补的DNA。
2.权利要求1所述的标靶DNA在筛选抗肿瘤药物中的应用。
3.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包含如权利要求1所述的标靶DNA或包含SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:8中任意一条序列。
4.一种抑制SKAl基因表达的小分子干扰核糖核酸(siRNA)，其特征在于，所述的siRNA包括正义RNA片段和反义RNA片段，所述正义RNA片段包含权利要求1所述标靶DNA编码的RNA分子，所述正义RNA片段和反义RNA片段能够互补形成双链RNA分子。
5.一种慢病毒颗粒，其特征在于，其包含如权利要求3所述的重组载体。
6.一种SKAl基因沉默的细胞模型，其特征在于，其包含如权利要求5所述的慢病毒颗粒。
7.如权利要求6所述的SKAl基因沉默的细胞模型在筛选抗肿瘤药物中的应用。
8.权利要求4所述的小分子干扰核糖核酸(siRNA)在制备抗肿瘤药物中的应用。
9.一种SKAl基因的逆转录PCR引物。
10.如权利要求9所述的SKAl基因的逆转录PCR引物在诊断肿瘤中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种抑制SKA1基因表达的siRNA，所述的siRNA的长度为15～27bp。本发明还公开了含有该siRNA的重组载体，该重组载体转染真核细胞，即得到SKA1基因沉默的细胞。本发明的siRNA序列能够有效降解SKA1基因的mRNA，从而特异性抑制SKA1基因的表达。本发明所述siRNA可用于制备与SKA1基因相关疾病包括肿瘤的治疗药物；同时对于研究SKA1基因在肿瘤耐药性中的作用，对肿瘤特别是骨肉瘤、结直肠恶性肿瘤的临床非手术治疗具有重要的意义。本项发明还公开了可以从组织或者细胞中有效检测SKA1的逆转录PCR引物，以及该引物在肿瘤诊断中的应用。
文档编号C12N7/01GK103255137SQ20121017746
公开日2013年8月21日 申请日期2012年5月31日 优先权日2012年5月31日
发明者姚阳, 沈赞, 劳昕元, 余文熙 申请人:上海黄离生物科技有限公司