专利名称：小金海棠MxVHA-c蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及小金海棠MxVHA-C蛋白及其编码基因与应用。
背景技术：
铁元素是植物生长必需的营养元素之一。植物缺铁会引起叶片黄化、早衰、光合作用下降等现象，严重者造成作物产量与品质下降。农业生产缺铁是一个世界性的问题，世界各国都有大量有关植物缺铁的报道。因此，需要发展有效的抗缺铁的办法。
发明内容
本发明的一个目的是提供与植物耐缺铁相关的蛋白及其编码基因。
本发明所提供的与植物耐缺铁相关的蛋白，名称为MxVHA-c，来源于苹果属小金海棠(Malus xiaojinensis),是如下Ca)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列I的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐缺铁相关的由(a)衍生的蛋白质。其中，序列表中的序列I由166个氨基酸残基组成。为了使I)中的MxVHA-c便于纯化，可在由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表I所示的标签。表I标签的序列
标签__残基__序歹Li_
~ Poly-Arg_^6(通常为 5 个) —RRRRR
~Poly-His~10 (通常为 6 个) ^HHHHHH
~FLAG~8~~DYKDDDDK
_ Strep-tag II ~8~~WSHPQFEK
~ c-myc10EQKLISEEDL上述2)中的MxVHA-c可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述2)中的MxVHA-c的编码基因可通过将序列表中序列2的自5'末端第1-498位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表I所示的标签的编码序列得到。所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加可为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。上述与植物耐缺铁相关蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。所述与植物耐缺铁相关蛋白的编码基因具体可为如下1)-4)中任一所述的基因I)序列表中序列2自5’末端起第I位-498位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)在严格条件下与I)或2)所不的DNA分子杂交且编码所述蛋白的DNA分子；4)与I)或2)或3)的基因具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。
上述序列表中的序列2由498个核苷酸组成，其开放阅读框架(ORF)为自5'末端第1-498位脱氧核苷酸，编码的氨基酸序列如序列表中的序列I所示。含有所述与植物耐缺铁相关蛋白的编码基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。所述重组表达载体是在pYES2. 0载体的多克隆位点间插入所述与植物耐缺铁相关蛋白的编码基因得到的重组表达载体。本发明的另一个目的是提供一种获得重组酵母菌的方法。本发明所提供的获得重组酵母菌的方法，为如下I)或2)所示I)将与植物耐缺铁相关蛋白的编码基因导入出发酵母菌中，得到V型H+-ATPase酶活性增高的重组酵母菌； 2)将与植物耐缺铁相关蛋白的编码基因导入出发酵母菌中，得到耐Cd2+毒害能力增强和/或耐缺铁能力增强的重组酵母菌。所述与植物耐缺铁相关蛋白的编码基因是通过酵母表达载体导入出发酵母菌中。所述出发酵母菌为野生型酵母菌株BJ2168 (Saccharomyces cerevisiae)。根据所述方法获得的重组酵母菌也属于本发明的保护范围。上述任一所述蛋白或其编码基因在培育耐缺铁植物中的应用也属于本发明的保护范围。本发明的又一个目的是提供一种培育耐缺铁能力增强的转基因植物的方法。本发明所提供的培育耐缺铁能力增强的转基因植物的方法，是将上述蛋白的编码基因导入出发植物中，得到耐缺铁性能增强的转基因植物。所述出发植物为双子叶植物，具体为拟南芥。本发明所提供的小金海棠MxVHA-c蛋白及其编码基因MxVHA-c对于缺铁胁迫的植株来说有很重要的调节作用，本发明所用的材料小金海棠在是一种耐缺铁的植株，它是一种典型的机理I植物，即植物必须可以通过激活质膜上的H+-ATPase,使土壤酸化，增加铁的可溶性。然后在三价铁还原酶的作用下将三价铁还原成二价铁，在质膜上的二价铁转运蛋白的作用下转运进细胞质中，增加植株的耐缺铁性。本发明所提供的MxVHA-c基因对于缺铁胁迫的植株具有很重要的调节作用，本发明为进一步研究小金海棠的耐缺铁性提供了很好的理论依据。
图I为MxVHA-c基因的PCR扩增产物结果。图2为不同铁处理水平下MxVHA-c基因在小金海棠不同器官中的荧光定量PCR结果。图3为MxVHA-c基因瞬时表达载体pEZS-MxVHA_c的酶切鉴定结果。图4为MxVHA-c基因的亚细胞定位检测结果。图5为酵母表达载体pYES2. 0-MxVHA-c-GFP的酶切结果。图6为转基因酵母的PCR鉴定结果。图7为转基因酵母中V型H+-ATPase酶活的测定。图8为转基因酵母在40 ii M Ferrozine处理情况下的生长情况。
图9为转基因酵母在10 ii M CdCl2处理情况下的生长情况。图10为转基因株系的PCR鉴定图11为转基因拟南芥在缺铁情况下的生长情况。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例I、与植物耐缺铁相关蛋白MxVHA-c及其编码基因的获得一、MxVHA-c基因全长的获得
以小金海棠(Malus xiaojinensis)(公众可从中国农业大学获得,记载过该小金海棠的非专利文献是成明昊，李晓林，张云贵，苹果优良砧木资源-小金海棠，西南农业大学学报，2000年10月，22(5):383-386)为实验材料，提取其叶片总RNA，将其反转录为cDNA。以此cDNA为模板，以引物Fl (序列表中序列3)和引物Rl (序列表中序列4)为引物对引物Fl AAAGAATTCATGTCTTCTTCAACCTTC,下划线部分表示酶切位点 EcoRI，引物Rl AAAGTCGACCCCTCAGCTCTTGACTGACC,下划线部分表示酶切位点 Sail,进行PCR扩增，反应体系中使用高保真的HiF mix,以确保扩增的特异性。PCR扩
增反应体系如下
ddH20^OjlII
2xHiF Mix (0.5U/|.il)IOfJ
F (IOmM)1.0 [i\
R (IOmM)1.0
模板(反转录的cDNA) 1.0 ix\
Total20 jjPCR反应条件先94°C预变性3min ;然后94°C变性40S，58°C退火40S，72°C延伸lmin，共30个循环；最后72°C延伸IOmin0取PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，结果如图I中A所示，其中，泳道M为2000bp的DNA分子量标准，泳道I和泳道2为PCR扩增产物。结果表明得到498bp的目的片段。切下目的条带，纯化回收后按照pEASY-Tl sample-Vector Kit载体试剂盒(购自全式金生物公司)说明书将PCR产物连接到载体pEASY-Tl sample (购自全式金生物公司)上，经Sail和EcoRI酶切验证后进行测序。酶切验证结果如图B所示泳道M为15000bp的DNA分子量标准，泳道I为酶切验证的产物。测序结果表明，PCR扩增产物序列全长为498bp，其核苷酸序列如序列表中序列2的自5'末端第1-498位核苷酸所示，编码具有序列表中序列I所示的氨基酸残基序列的蛋白质，序列表中序列I由166个氨基酸残基组成。将该基因命名为MxVHA-c，将该基因编码的蛋白命名为MxVHA-c。二、小金海棠不同器官中MxVHA-c基因的表达分析将小金海棠组培苗在生长培养基(MS + 0. 5mg/L IBA+0. 2mg/L 6-BA)中培养，待其生长到茎木质化后，转移至生根培养基(1/2MS+1. Omg/L IBA)，组培苗生出白色根后，移至1/2全营养液(组成见表2，初始pH值用NaOH调至6. 0)中覆膜保湿培养2周，之后转入全营养液(组成见表I，初始PH值用NaOH调至6. 0)培养一个月，每周换一次全营养液，培养条件为光照培养16小时(光量子通量密度250iiE *M-2 *S-1)，温度为25±2°C;黑暗培养8小时,温度为17±2°C。之后进行缺铁诱导，方法为将植株从全营养液中转至含4yM Fe营养液(组成见表3，初始pH值用NaOH调至6. 0)，转移前去离子水冲洗。表I全营养液的配方
权利要求
1.一种蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质 (a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将序列表中序列I的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐缺铁相关的由(a)衍生的蛋白质。
2.权利要求I所述蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述蛋白的编码基因为如下I)-4)中任一所述的基因 1)序列表中序列2自5’末端起第I位-498位核苷酸所示的DNA分子； 2)序列表中序列2所示的DNA分子； 3)在严格条件下与I)或2)所示的DNA分子杂交且编码所述蛋白的DNA分子； 4)与I)或2)或3)的基因具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述编码基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体是在PYES2.0载体的多克隆位点间插入权利要求2或3所述的编码基因得到的重组表达载体。
6.一种获得重组酵母菌的方法，为如下I)或2)所示 1)将权利要求2或3所述的编码基因导入出发酵母菌中，得到V型H+-ATPase酶活性增高的重组酵母菌； 2)将权利要求2或3所述的编码基因导入出发酵母菌中，得到耐Cd2+毒害能力增强和/或耐缺铁能力增强的重组酵母菌。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于权利要求2或3所述的编码基因是通过酵母表达载体导入出发酵母菌中；所述酵母表达载体为权利要求4或5中所述的重组表达载体；所述发酵母菌具体为酵母菌株BJ2168 (Saccharomyces cerevisiae)。
8.权利要求I所述蛋白、权利要求2或3所述编码基因在培育耐缺铁植物中的应用。
9.一种培育耐缺铁植物的方法，包括如下步骤将权利要求I所述蛋白的编码基因导入出发植物中，得到耐缺铁性能增强的转基因植物。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述出发植物为双子叶植物，具体为拟南芥。
全文摘要
本发明公开了小金海棠MxVHA-c蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的小金海棠MxVHA-c蛋白是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐缺铁相关的由(a)衍生的蛋白质。本发明所提供的MxVHA-c对于缺铁胁迫的植株具有很重要的调节作用，本发明为进一步研究小金海棠的耐缺铁性提供了很好的理论依据。
文档编号C12R1/865GK102766200SQ20121017741
公开日2012年11月7日 申请日期2012年5月31日 优先权日2011年9月16日
发明者吴婷, 张倩, 张新忠, 王忆, 许雪峰, 陈 峰, 韩振海 申请人:中国农业大学