专利名称：一种脂肪干细胞免疫抑制效力的检测方法
技术领域：
本发明涉及干细胞检测技术，具体地说，涉及一种脂肪干细胞免疫抑制效力的检测方法。
背景技术：
脂肪干细胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)是从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。这种细胞群易分离，并像骨髓中的间充质干细胞那样在特定条件下可分化为成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞、脂肪细胞、神经细胞等。研究表明[1]，从人或其他物种上分离出来脂肪干细胞，并且脂肪干细胞的表面抗原与骨髓间充质干细胞基本类似。直接比较人的脂肪干细胞和间充质干细胞的表面抗原，约多于90%都是一致的。实验表明，脂肪干细胞像骨髓源性的间充质干细胞一样，经体外扩增后，其具有较低的免疫原性，不会在体内引起T细胞(即胸腺依赖淋巴细胞)的细胞毒性反应。 脂肪干细胞具有很强的免疫调节能力，能够抑制异常淋巴细胞激活及炎性细胞因子分泌。脂肪干细胞用于自身免疫性疾病已被临床证实，如脂肪干细胞可治疗类风湿关节炎、胰岛素依赖型糖尿病、重症肌无力、慢性溃疡性结肠炎、系统性红斑狼疮、口眼干燥综合征、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、硬皮病等等，并有确切的疗效。移植同种异基因脂肪干细胞将不会引起强烈的免疫反应和后期的排斥反应，为脂肪干细胞的同源异体移植提供了有利条件。此外，脂肪干细胞来源广泛，可以通过脂肪抽吸术或脂肪切除术从任何人体内获得，安全无痛苦，且在体外培养稳定，扩增速度快，不易衰老。因此，脂肪干细胞成为目前研究的新热点，不论在再生医学还是作为免疫调节剂方面都具有重大的应用潜力。然而，由于细胞治疗本身的特点，脂肪干细胞用于临床治疗还具有某些方面的限制因素。其中最典型的方面是缺乏有效而快捷的具有针对性的生物学效力检测手段。目前多数临床前或临床使用的脂肪干细胞产品都是参照2006年国际细胞治疗协会提出的三条定义间充质干细胞标准[2]，而缺乏针对某一类疾病，特别是免疫抑制方面的可以定义细胞质量或初步判断细胞治疗效果的方法。为克服以上问题的不足，我们对脂肪干细胞表达的一种糖蛋白一galectin-3 (半乳糖凝聚素-3)进行了系统研究，该蛋白是galectins (半乳糖凝聚素)家族的一员，分子量为26kD，大量研究表明该蛋白可有效抑制T淋巴细胞的增殖，促进T淋巴细胞的凋亡[3-7]。我们在研究中发现脂肪干细胞(ADSC)与脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)相比，其在核酸水平和蛋白水平均有较高剂量的galectin-3表达，而且该蛋白在ADSC的表达又分为分泌型的和膜表达型；通过与hUC-MSC比较发现，ADSC在核酸水平和蛋白水平表达的galectin-3均较高，尤其流式细胞法检测细胞膜表面表达galectin-3发现90%以上ADSC膜表达galectin-3阳性，显著高于UC-MSC ;而细胞培养液中分泌的galectin-3，ADSC则低于后者，说明细胞表面表达的galectin-3可能发挥更重要作用。我们通过Transwell小室共培养试验发现，脐带间充质干细胞加入或不加Transwell小室均能显著抑制T淋巴细胞增殖，而脂肪干细胞加入Transwell小室后抑制淋巴细胞增殖能力明显弱于细胞直接接触组(不加Transwell小室组)，以上实验说明脂肪干细胞主要通过细胞直接接触发挥免疫抑制功能。我们通过RNA干扰试验证实，ADSC膜表达的galectin-3明显降低，而通过ADSC与淋巴细胞共培养时发现，经RNA干扰的ADSC抑制淋巴细胞增殖能力明显弱于不进行galectin-3干扰的细胞,说明膜表达的galectin-3在脂肪干细胞免疫调节方面发挥主要作用，由此提出了一种检测脂肪干细胞免疫抑制效力的新方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有脂肪干细胞生物学效力检测手段的不足，建立一套有效检测脂肪干细胞免疫抑制能力的新方法。本发明提供了一种脂肪干细胞免疫抑制效力的检测方法，其特征在于通过检测脂肪干细胞表面galectin-3表达量来判断其免疫抑制效力。在一个特定的实施方案中，所述脂肪干细胞为人脂肪干细胞，并且其判断标准为人脂肪干细胞表面表达galectin-3阳性率在90%以上，低于此数值的判定为脂肪干细胞免疫抑制效力不合格。优选地,使用流式细胞术方法检测脂肪干细胞表面galectin-3表达量。尽管之前的研究已经发现galectin-3表达与间充质干细胞免疫抑制能力之间存在密切关系，但在脂肪干细胞表达galectin-3方面至今没有报道，更没有开发出一套成熟的脂肪干细胞免疫抑制效力的检测方法。本发明首次发现细胞膜表面表达的galectin-3在脂肪干细胞免疫抑制过程中起主要作用，并在此基础上开发出一套有效检测脂肪干细胞免疫抑制能力的方法。本发明以流式检测膜表达galectin-3蛋白质为主要检测方法，针对性强，操作简便，定量准确，为临床应用自体脂肪干细胞治疗免疫性疾病提供了较好的生物学效力检测手段。
图I. qPCR结果分析ADSC与hUC-MSC mRNA水平表达galecitn-3比较，发现核酸水平 ADSC 表达 galectin-3 显著高于 hUC-MSC (P<0. 01 )。图2.流式细胞法分析ADSC与hUC-MSC培养上清中galecitn-3表达量比较，发现ADSC细胞表面表达galectin-3显著高于hUC-MSC (P<0. 01)。图3A. ELISA分析100万个ADSC与hUC-MSC裂解液中galecitn-3表达量比较，发现 ADSC 胞内表达 galectin-3 显著高于 hUC-MSC (P<0. 01)。图3B. ELISA分析ADSC与hUC-MSC培养上清中galecitn-3表达量比较，发现ADSC分泌至胞外的galectin-3显著低于hUC-MSC (P<0. 01)。图4. BrdU法检测与ADSC或hUC-MSC共培养后PBMC增殖情况。发现hUC-MSC加入或不加Transwell小室均能显著抑制T淋巴细胞增殖,而ADSC加入Transwell小室后抑制淋巴细胞增殖能力明显弱于不加Transwell小室组。
图5A. qPCR分析RNA干扰后ADSC核酸水平表达galectin-3的变化，发现经RNA干扰，核酸水平ADSC表达galectin-3显著降低(P〈0. 01)。
图5B.流式细胞法分析RNA干扰后ADSC细胞表面表达galectin-3的变化，发现经RNA干扰，ADSC细胞表面表达galectin-3显著降低(P〈0. 01)。图6. BrdU吸收法检测各共培养组PHA-P刺激的PBMC增殖情况(以光吸收值表示)，发现经RNA干扰，ADSC抑制PBMC增殖的能力显著降低(P〈0. 01)。
具体实施例方式实施例ImRNA水平检测galectin-3表达连续培养三批人脐带间充质干细胞(hUC-MSC)及脂肪干细胞(ADSC)，培养至P4代后，分别消化离心，用RNA提取试剂盒(Invitrogen公司产品)提取细胞总RNA,逆转为cDNA后，用galectin-3引物进行real-time qPCR (实时定量PCR)分析(正向引物5’ -CCAAAGAGGGAATGATGITGCC-3’，反向引物5’ -TGATTGTA CTGCAACAAGTGAGC-3’)，并对
real-time qPCR结果进行目标产物的2_AGt分析(结果见图I)。由结果可知，ADSC在mRNA水平表达galectin-3显著高于UC-MSC。实施例2流式细胞仪检测galectin-3表达连续培养3批脂肪干细胞和脐带间充质干细胞，培养48h后消化细胞，每100万细胞加入5iil Alexa488goat anti galectin-3抗体或同型对照,进行流式细胞分析,检测细胞表面galectin-3表达。结果如图3A, 3B所示,脂肪干细胞表面表达galectin-3可高达93. 34%±2. 25%，而脐带间充质干细胞则为77. 8%±3. 48%。实施例3ELISA检测galectin-3蛋白表达连续培养3批脂肪干细胞和脐带间充质干细胞，培养体系为10ml，培养48h收集上清液备用；48h末消化细胞，每100万细胞加入Iml RIPA试剂裂解细胞。细胞上清液和RIPA裂解液同时做ELISA检测(galectin-3ELISA试剂盒，Bender公司)。经比较细胞内和分泌至细胞外的galectin-3蛋白含量,细胞内表达的galectin-3脂肪明显多于脐带间充质干细胞(P〈0. 05)，如图3A;而培养液中galectin-3含量脐带间充质干细胞显著多于脂肪干细胞(P〈0. 01)，如图3B。实施例4脂肪干细胞与外周血单核细胞共培养将3个不同批次的ADSC及UC-MSC接种于24孔板，相同细胞各做6个平行孔，其中3孔加Transwell小室，另外3孔不加小室，各组细胞一起与经PHA-P刺激的PBMC共培养，48h后用BrdU法检测经上述各组细胞共培养后PBMC的增殖作用，增殖量以OD值(A450nm-A690nm)表不。如图4所示，PBMC经PHA-P刺激后可显著增殖(PP组)，hUC-MSC加入或不加Transwell小室均能显著抑制T淋巴细胞增殖，而ADSC加入Transwell小室后抑制淋巴细胞增殖能力明显弱于不加Transwell小室组(P〈0. 01)。实施例5对galectin-3进行RNA干扰采用galectin_3siRNA对脂肪干细胞RNA干扰；同时选择siRNA的阴性序列作为RNA干扰的阴性对照。galectin-3siRNA及阴性对照序列来源于Sigma-Aldrich公司，其中galectin_3siRNA 的序列(5’ -3’)如下sense CACUUUAACCCACGCUUCAdTdT,
anti-sense UGAAGCGUGGGUUAAAGUGdTdT ；阴性对照序列(5’ -3’)如下sense :UUCUCCGAACGUGUCACGUTT，anti-sense:ACGUGACACGUUCGGAGAATT。具体方法为同一来源的细胞等分为3份，贴壁培养24h后，其中两份分别加入含有脂质体(lipofectamine RNAi MAX, Invitrogen 公司)和 galectin_3siRNA (gal_3 ▼组)或阴性对照序列(NA组)的Opti-MEM溶液，另外一份不做处理(contr组)。ADSC加入siRNA培养24h后，以qPCR法、流式细胞术法分别检测三份细胞mRNA水平、蛋白水平galectin-3表达情况。结果如图5A, gal_3 ▼组与NA组和contr组相比，hUC-MSC在mRNA水平表达galectin-3显著降低(P〈0. 01 )，抑制率高达88. 3%。而通过流式 细胞法检测细胞表面galectin-3表达发现，galectin表达由原来的94. 4%降低至28. 3%。实施例6ADSC (gal-3 ▼组/NA组/contr组)与PBMC共培养将3个不同批次的ADSC接种于24孔板，相同细胞各做3个平行孔，其中3孔分别进行galectin-3和阴性对照序列的RNA干扰(gal-3 ▼组/NA组)，另一孔不做处理(contr组)，每组各留一孔不加ADSC。干扰24h后各孔加入经PHA-P刺激的PBMC共培养，48h后BrdU法检测经上述各组hUC-MSC共培养后PBMC的增殖作用，增殖量以OD值(A450nm-A690nm)表示。如图6所示，不加ADSC的PBMC经PHA-P刺激后可显著增殖(PP组)，然而与ADSC共培养后，PBMC增殖明显被抑制(NA组和contr组)。而经galectin_3siRNA干扰后，ADSC抑制PBMC能力明显降低(P〈0. 01 )。其中PP组为经PHA-P刺激的PBMC单独培养组，gal-3 ▼组/NA组/contr组为经galectin_3siRNA处理/阴性对照序列处理/不处理的ADSC与经PHA-P刺激的PBMC共培养组。gal-3 ▼组与Contr组相比ADSC对PBMC增殖抑制率降低了 66. 9%。说明抑制率计算方法inhibitiongal-3T=⑴DPP-ODgal_3T) / ODPP,
(0D值为各组平均值，其他共培养组抑制率算法相同)。抑制率降低率算法Ainhibition= (inhibition,.；,i-'.T-inhibition N \ ) I inhibition xA, m=3。以上结果发现，经galectin-3 siRNA干扰后，ADSC抑制PHA-P刺激的PBMC增殖能力明显下降(P〈0. 01)，表明galectin-3的表达对于hUC_MSC免疫抑制有重要作用。实施例7ADSC细胞表面表达galectin-3检测连续培养P2 P6代次4批不同脂肪干细胞，培养48h后消化细胞，每100万细胞加A 5 U I Alexa488goat anti galectin-3抗体及同型对照进行流式细胞分析,检测细胞表面galectin-3表达。结果如表I示,脂肪干细胞表面表达galectin-3在不同代次及批次间差异较小，且多数均在90%以上。表I
权利要求
1.一种脂肪干细胞免疫抑制效力的检测方法，其特征在于通过检测脂肪干细胞表面galectin-3的表达判断其免疫抑制潜力。
2.根据权利要求I所述脂肪干细胞免疫抑制效力的检测方法，其中所述脂肪干细胞为人脂肪干细胞。
3.根据权利要求2所述脂肪干细胞免疫抑制效力的检测方法，其判断标准为人脂肪干细胞表面galectin-3的表达量以90%为阈值，低于此数值的判定为脂肪干细胞免疫抑制效力不合格。
4.根据权利要求1-3任一项所述脂肪干细胞免疫抑制效力的检测方法，其中使用流式细胞术方法检测脂肪干细胞培养表面galectin-3的表达量。
全文摘要
本发明提供了一种脂肪干细胞免疫抑制效力的检测方法，其特征在于通过检测脂肪干细胞表面galectin-3的表达量来判断该细胞免疫抑制能力强弱，操作简便，针对性强，定量准确，为临床应用自体脂肪干细胞治疗免疫性疾病提供了较好的生物学效力检测手段。
文档编号C12Q1/68GK102719546SQ20121022007
公开日2012年10月10日 申请日期2012年6月29日 优先权日2012年6月29日
发明者刘广洋, 刘拥军, 徐燚, 朱德琳, 秦臻, 金星 申请人:天津和泽干细胞科技有限公司