专利名称：生物转化制备天然4-乙烯基愈创木酚的方法
技术领域：
本发明涉及生物转化制备天然4-乙烯基愈创木酚的方法，具体地说，尤其涉及使用一株芽孢杆菌feci77心sp. HY3 CCTCC M 2012247转化阿魏酸制备天然4-乙烯基愈创木酚的方法。
背景技术：
4-乙烯基愈创木酹(4-vinylguaiacol)又名2_甲氧基-4-乙烯基苯酹、对乙烯基愈创木酚，其分子式为C9H10O2，密度I. 11X103 kg/m3，熔点260C 29°C，沸点100°C /667Pa。常温常压下为无色或淡黄色油状液体，呈发酵香气，略带甜味，是决定酒类、酱油、茶叶、咖啡、干酪等食品品质的主要香味成分，也是日化、医药、香精合成等行业较为常用的高档香料之一。天然4-乙烯基愈创木酚主要存在于玉米酒精发酵的挥发物中。4-乙烯基愈创木酚常通过化学合成法生产，一般存在工艺路线复杂，收率低等问题。例如以阿魏酸和喹啉为底物，以对苯二酚为阻聚剂，在18(T185°C反应4飞小时后经过洗料、精制以后得到4-乙烯基愈创木酚。例如申请号为201010229531. X的发明专利涉及一种4-乙烯基愈创木酚的制备方法，步骤为(I)向反应器中，依次投入喹啉、阿魏酸和作为阻聚剂的对苯二酚，打开加热装置，接通氮气保护装置，到体系无气体溢出停止加热，继续搅拌40-60分钟；(2)将上述反应中加入溶剂苯中搅拌均匀，并向该溶液中加入盐酸，搅拌均匀，然后静置分层，检测水相PH值为中性为止；最后向去离子水洗后的溶液中加入干燥剂无水氯化钙；(3)将干燥后的溶液放入蒸馏器中，常压将作为溶剂的苯蒸出，然后连接上真空泵在100°C以下的气相温度下将产品蒸出，即可包装市售。该发明通过对4-乙烯基愈创木酚的合成工艺进行比对研究，确定了各种反应物阿魏酸，喹啉的最佳反应配比，因此反应收率得到提高。随着生活水平的提高，人们对天然绿色产品的需要也越来越高。与化学合成相比，生物法合成4-乙烯基愈创木酚具有反应条件温和，副产物少，提取步骤简单，生产清洁，环境污染低，产品安全可靠等优点，正日益受到人们的重视。通过生物转化阿魏酸生产天然4-乙烯基愈创木酚生产周期短，产物收率高，是一种经济可行、极有产业化前景的4-乙烯基愈创木酚生产工艺。
发明内容
针对目前天然产品需求逐年增加，以及化学法合成4-乙烯基愈创木酚工艺路线复杂、收率低等问题，本发明提供了使用一株芽孢杆菌sp. HY3 CCTCC M 2012247转化阿魏酸制备天然4-乙烯基愈创木酚的方法。本发明涉及的芽孢杆菌HY3 {Bacillus sp. HY3)，已于2012年6月25日保存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址中国武汉武汉大学；邮编430072 ;其保藏编号为CCTCC M 2012247。本发明涉及的芽孢杆菌feci77心sp. HY3 CCTCC M 2012247转化阿魏酸制备天然4-乙烯基愈创木酚，其涉及的详细步骤如下
(1)斜面培养将芽孢杆菌sp.HY3 CCTCC M 2012247接种到添加质量体积比为I %葡萄糖的LB固体培养基上，在30°C条件下，静置培养20小时，得到成熟的斜面培养物；
(2)制备种子培养液用步骤(I)所得的斜面培养物，接种到添加质量体积比为1%葡萄糖的LB液体培养基中，在30°C条件下，120转/分钟振荡培养15小时，制得种子培养液；
(3)转化细胞培养使用步骤(2)所得的种子培养液，按体积百分比6%的接种量接入LB液体培养基中，在30°C条件下，120转/分钟振荡培养20小时，得到转化细胞培养液；
(4)转化使用步骤(3)所得的转化细胞培养液，加入I 5克/升的阿魏酸，28°C 37°C条件下，120转/分钟振荡培养I 30小时，得到成熟的阿魏酸转化液；
(5)4-乙烯基愈创木酚浓度检测阿魏酸转化液样品经分析纯乙酸丁酯萃取后检测4-乙烯基愈创木酚浓度。其中，步骤(4)中所述的转化温度优选是30 35°C。其中，步骤(4)中所述的加入的阿魏酸浓度优选为0. 5 2克/升。其中，步骤(4)中所述的转化时间优选是5 20小时。在上述利用芽孢杆菌feci77心sp. HY3 CCTCC M 2012247转化阿魏酸制备天然4-乙烯基愈创木酚的方法中，种子培养和转化细胞培养使用的LB液体培养基配方为葡萄糖10克/升，酵母粉5克/升，蛋白胨10克/升，氯化钠5克/升，调节pH至7. 0 ;斜面培养使用的LB固体培养基为在此培养基基础上添加质量体积比为I. 6%的琼脂。本发明的有益效果是，天然阿魏酸一般可从可再生的原料比如麦麸、谷糠中提取得到，使用芽孢杆菌feci77心sp. HY3 CCTCC M 2012247转化阿魏酸制备天然4-乙烯基愈创木酚的方法有反应条件温和，环境污染小，产物浓度高，副产物少，提取步骤简单，生产清洁，产品环境友好，安全可靠等优点，可有效解决采用化学合成法遇到的多种难题。本发明属于生物技术领域，采用该方法可高转化·率生产天然4-乙烯基愈创木酚，具有很大的应用前景。
具体实施例方式实施例I :
芽孢杆菌sp. HY3 CCTCC M 2012247菌体在种子培养15小时后以体积百分比6%接种量接入转化培养基中，菌体培养20小时后加入0. 2克/升阿魏酸，在30°C条件下120转/分钟振荡培养。10小时后取样测定4-乙烯基愈创木酚浓度。本发明涉及的芽孢杆菌feci77心sp. HY3 CCTCC M 2012247转化阿魏酸制备天然4-乙烯基愈创木酚，其涉及的详细步骤如下
(1)斜面培养将芽孢杆菌sp.HY3 CCTCC M 2012247接种到添加质量体积比为I %葡萄糖的LB固体培养基上，在30°C条件下，静置培养20小时，得到成熟的斜面培养物；
(2)制备种子培养液用步骤(I)所得的斜面培养物，接种到添加质量体积比为1%葡萄糖的LB液体培养基中，在30°C条件下，120转/分钟振荡培养15小时，制得种子培养液；
(3)转化细胞培养使用步骤(2)所得的种子培养液，按体积百分比6%的接种量接入LB液体培养基中，在30°C条件下，120转/分钟振荡培养20小时，得到转化细胞培养液；
(4)转化使用步骤(3)所得的转化细胞培养液，加入0.2克/升的阿魏酸，30°C条件下，120转/分钟振荡培养10小时，得到成熟的阿魏酸转化液；
(5)4-乙烯基愈创木酚浓度检测阿魏酸转化液样品经分析纯乙酸丁酯萃取后检测4-乙烯基愈创木酚浓度，最终4-乙烯基愈创木酚浓度为0. 147克/升，摩尔转化率为95. 1%。在上述利用芽孢杆菌feci77心sp. HY3 CCTCC M 2012247转化阿魏酸制备天然4-乙烯基愈创木酚的方法中，种子培养和转化细胞培养使用的培养基配方为葡萄糖10克/升，酵母粉5克/升，蛋白胨10克/升，氯化钠5克/升，调节pH至7. 0 ;斜面培养使用的固体培养基为在此培养基基础上添加质量体积比为I. 6%的琼脂。实施例2: 芽孢杆菌sp. HY3 CCTCC M 2012247菌体在种子培养15小时后以体积百分比6%接种量接入转化培养基中，菌体培养20小时后加入0. 5克/升阿魏酸，在30°C条件下120转/分钟振荡培养。其中种子培养和转化细胞培养使用的培养基配方同实施例I。10小时后取样测定4-乙烯基愈创木酚浓度为0.366克/升，摩尔转化率为94. 7%。实施例3:
芽孢杆菌sp. HY3 CCTCC M 2012247菌体在种子培养15小时后以体积百分比6%接种量接入LB液体培养基中，菌体培养20小时后加入I克/升阿魏酸，在30°C条件下120转/分钟振荡培养。其中种子培养和转化细胞培养使用的培养基配方同实施例I。10小时后取样测定4-乙烯基愈创木酚浓度为0.710克/升，摩尔转化率为
91.8%。实施例4
芽孢杆菌sp. HY3 CCTCC M 2012247菌体在种子培养15小时后以体积百分比6%接种量接入LB液体培养基中，菌体培养20小时后加入2克/升阿魏酸，在30°C条件下120转/分钟振荡培养。其中种子培养和转化细胞培养使用的培养基配方同实施例I。10小时后取样测定4-乙烯基愈创木酚浓度为I. 4克/升，摩尔转化率为90. 5%。实施例5
芽孢杆菌sp. HY3 CCTCC M 2012247菌体在种子培养15小时后以体积百分比6%接种量接入LB液体培养基中，菌体培养20小时后加入I克/升阿魏酸，在30°C条件下120转/分钟振荡培养。其中种子培养和转化细胞培养使用的培养基配方同实施例I。5小时后取样测定4-乙烯基愈创木酚浓度为0. 705克/升，摩尔转化率为91.2%。实施例6
芽孢杆菌sp. HY3 CCTCC M 2012247菌体在种子培养15小时后以体积百分比6%接种量接入LB液体培养基中，菌体培养20小时后加入I克/升阿魏酸，在30°C条件下120转/分钟振荡培养。其中种子培养和转化细胞培养使用的培养基配方同实施例I。20小时后取样测定4-乙烯基愈创木酚浓度为0.718克/升，摩尔转化率为
92.9%。实施例8 芽孢杆菌sp. HY3 CCTCC M 2012247菌体在种子培养15小时后以体积百分比6%接种量接入LB液体培养基中，菌体培养20小时后加入I克/升阿魏酸，在37°C条件下120转/分钟振荡培养。其中种子培养和转化细胞培养使用的培养基配方同实施例I。10小时后取样测定4-乙烯基愈创木酚浓度为0. 714克/升，摩尔转化率为
92.3%。
权利要求
1.ー种生物转化制备天然4-こ烯基愈创木酚的方法，其特征在于所述方法是以天然阿魏酸为底物，以芽孢杆菌sp. HY3 CCTCC M 2012247为生物催化剂，进行反应制得所述4-こ烯基愈创木酚。
2.根据权利要求I所述的生物转化制备4-こ烯基愈创木酚的方法，其涉及的步骤如下 (1)斜面培养将芽孢杆菌心sp.HY3 CCTCC M 2012247接种到添加质量体积比为I %葡萄糖的LB固体培养基上，在30°C条件下静置培养20小时，得到成熟的斜面培养物； (2)制备种子培养液用步骤(I)所得的斜面培养物，接种到添加质量体积比为1%葡萄糖的LB液体培养基中，在30°C条件下，120转/分钟振荡培养15小时，制得种子培养液； (3)转化细胞培养使用步骤(2)所得的种子培养液，按体积百分比6%的接种量接种到添加质量体积比为I %葡萄糖的LB液体培养基中，在30°C条件下，120转/分钟振荡培养20小时； (4)转化使用步骤(3)所得的转化细胞培养液，加入天然阿魏酸，在28°C 37°C条件下，120转/分钟振荡培养I 30小时，得到成熟的阿魏酸转化液。
3.根据权利要求2所述的生物转化制备天然4-こ烯基愈创木酚的方法，其特征是所述天然阿魏酸的浓度为I 5克/升。
4.根据权利要求2所述的生物转化制备天然4-こ烯基愈创木酚的方法，其特征是制备种子培养液及转化细胞培养使用的培养基配方均为葡萄糖10克/升，酵母粉5克/升，蛋白胨10克/升，氯化钠5克/升，调节pH至7. 0 ;斜面培养使用的固体培养基是在此培养 基基础上添加质量体积比为I. 6%的琼脂。
5.根据权利要求2所述的生物转化制备天然4-こ烯基愈创木酚的方法，其特征在于步骤(4)中所述的转化温度是30 37°C。
6.根据权利要求2所述的生物转化制备天然4-こ烯基愈创木酚的方法，其特征是步骤(4)中所述的转化时间为5 20小时。
7.根据权利要求2所述的生物转化制备天然4-こ烯基愈创木酚的方法，其特征是阿魏酸转化液样品经分析纯こ酸丁酯萃取后检测4-こ烯基愈创木酚浓度。
8.ー种芽孢杆菌YiYMMaciIIus sp. HY3)，其特征是该菌株已于2012年6月25日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2012247。
全文摘要
一种生物转化制备天然4-乙烯基愈创木酚的方法，该方法以芽孢杆菌Bacillussp.HY3CCTCCM2012247为生物催化剂，以天然阿魏酸为底物，通过微生物转化制备天然4-乙烯基愈创木酚。该生产过程包括(1)斜面培养,(2)制备种子培养液，(3)转化细胞培养,(4)转化。本发明属于生物技术领域，采用该方法可高转化率生产天然4-乙烯基愈创木酚，可用于烟酒、食品等领域，具有很大的应用前景。
文档编号C12P7/22GK102776246SQ20121028891
公开日2012年11月14日 申请日期2012年8月15日 优先权日2012年8月15日
发明者华栋梁, 张晓东, 张 杰, 李岩, 梁晓辉, 许敏, 许海朋 申请人:山东省科学院能源研究所