一种农杆菌菌液喷雾转基因方法
【专利摘要】本发明涉及植物基因工程领域，提供一种农杆菌菌液喷雾转基因方法，包括以下步骤：配制农杆菌菌液，所述农杆菌含有外源目的基因；选取刚开的棉花花朵，对其喷洒农杆菌菌液。本发明所述农杆菌菌液喷雾转基因方法，只需要对准花柱柱头喷洒，然后轻轻绑花，操作简单，速度快，操作上几乎不会造成机械性损伤，而且成铃率高，遗传稳定性相对较好。
【专利说明】一种农杆菌菌液喷雾转基因方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物基因工程领域，尤其涉及一种农杆菌菌液喷雾转基因方法。
【背景技术】
[0002]棉花是重要的经济作物，改革开放以后中国已成为世界主要产棉大国。近60年以来，全球棉花种植总面积不断增加，美国、非洲、苏联及中亚、印度等是主要的出口国家和地区。1982年以后，中国的棉花产量一直位于世界之首，但国内棉花生产却无法满足国内需求。
[0003]当前，转基因生物技术发展迅速，并全面推动育种技术的升级，引领了生物种业的重大变革，而且在农民创收、粮食安全和现代农业等多个方面发挥重要作用。美国所研制的抗虫棉大田种植面积已经超过棉花总种植面积的70%，中国和澳大利亚超过30%，世界转基因棉花种植总面积达680万公顷以上，占全球棉花种植总面积的20%。近年来，随着转基因技术的不断发展，利用生物技术开发棉花种质资源和培育新品种极大地推动了棉花遗传育种的研究进程。
[0004]在棉花转基因方式中，主要有农杆菌介导法(Agrobacterium-mediated genetransfer)、花粉管通道(Pollen tube pathway)和基因枪(Particle bombardment)三种转化方法。基因枪法是较为常见的棉花遗传转化方法，通常选用悬浮的胚性细胞作为受体材料，但是该方法对仪器设备要求很高，并且转基因后代多拷贝，整合效率低且遗传稳定性较差。农杆菌介导棉花胚性愈伤转化体系存在周期长、易受基因型限制、消耗人力和财力等问题。
[0005]利用花粉管通道法导入外源基因技术是我国学者周光宇(1979，1980)设计了外源DNA直接导入受体的花粉管通道法，并提出了 “DNA片段杂交”的假说，这是我国基因工程研究的一大特色。传统的花粉管通道技术方便、费用低，但是转化率不稳定。
[0006]农杆菌菌液喷雾法又称喷花法，是近年来新兴的一种简单、快速、高效、重复性好、稳定性高的非组织培养转基因方法，是将农杆菌介导法和花粉介导转化法有效结合的转基因技术。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供一种农杆菌菌液喷雾转基因方法，该方法简单易行，适合培育转基因海岛棉。
[0008]一种农杆菌菌液喷雾转基因方法，包括以下步骤:
[0009]配制农杆菌菌液，所述农杆菌含有外源目的基因；
[0010]选取刚开的棉花花朵，对其喷洒农杆菌菌液。
[0011]所述喷洒方式具体为:用喷壶对准花柱柱头喷洒所述农杆菌菌液，农杆菌菌液的喷洒量为每朵花f 2mL。
[0012]所述农杆菌菌液喷雾转基因方法，进一步还包括步骤:喷洒后，用绳子绑住花瓣，以保持相对的湿度和菌液活性。
[0013]喷洒过农杆菌菌液的花朵，向其花柄基部喷洒40 y g / L赤霉素。
[0014]所述棉花为海岛棉。
[0015]所述海岛棉为新海20或新海24。
[0016]所述农杆菌菌液的浓度为:0D600值为0.6。
[0017]所述农杆菌菌液为农杆菌重悬于渗透培养基中。
[0018]所述渗透培养基的配方为:20%蔗糖、I / 2MS、0.1%吐温-20，pH=6.0。
[0019]所述外源基因为p53。
[0020]本发明所述农杆菌菌液喷雾转基因方法，只需要对准花柱柱头喷洒，然后轻轻绑花，操作简单，速度快，操作上几乎不会造成机械性损伤。
[0021 ] 农杆菌菌液喷雾法处理的新海24的Ttl代植株成铃率为30.5%，与传统花粉管通道转化方法成铃率25%相比有所提高。T1代植株PCR检测，转化率为7.6%。随机抽取的转化植株T1代后代中，单拷贝植株所占比例较多。农杆菌菌液喷雾法遗传稳定性相对较好。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图lPCAMB1300_p53:gfp 质粒图谱
[0023]图21\代阳性植株PCR检测结果图，f 10:转基因植株；11:阳性质粒；12:非转基因植株；13:阴性对照；14:DL 200`0marker。
[0024]图31\代阳性植株的Southern检测，1:非转基因植株；2:阴性对照；3:阳性质粒；4^13:转基因植株。
【具体实施方式】
[0025]以下结合具体实施例对本发明的技术路线做进一步详细说明。
[0026]本发明用到的材料、试剂和仪器:
[0027]植物材料:海岛棉品种新海20和新海24由新疆农业大学农业生物技术重点实验
室提供。
[0028]菌株材料:农杆菌菌株为LBA4404。
[0029]质粒材料:PCAMB1300_p53:gfp，见图1。
[0030]植物基因组DNA 提取缓冲液:50mmol / L Tris-HCl, pH=8.0 ；
[0031]IOOmmol / L EDTA, pH=8.0 ；
[0032]1.5mmoI / LNaCl ；
[0033]1% SDS ；
[0034]1% PVP40 ；
[0035]30 uL3_Mer。
[0036]电泳缓冲液
[0037]10XTBE:48.4g / L Tris 碱，11.42mL 冰乙酸，20mL 的 0.5mol / LEDTA (工作缓冲液为I X TBE)
[0038]Southern杂交配制溶液
[0039]20 X SSC:175.3g NaCl 和 88.2g 柠檬酸钠，溶于 IL 去离子水中，pH=7.0 ;[0040]Maleic Acid Buffer:11.067g 马来酸和 8.766g NaCl 溶于 IL 去离子水中，pH=7.5 ；
[0041]Washing Buffer:Maleic Acid Buffer 灭菌后加入 3mL 吐温-20 ;
[0042]Imol / L Tris-HCl:12.114g Tris-base,溶于 IOOmL 去离子水中，pH=8.0 ;
[0043]Detection Buffer:1.1688g NaCl 溶于 IOOmL 去离子水中，加 20mL 的 Imol / LTris-HCl (ρΗ=8.0),定容至 200mL, ρΗ=9.5 ；
[0044]10%SDS:10g SDS，溶于 IOOmL 水中，加热至 68°C溶解，pH=7.2 ；
[0045]低严谨洗膜液:2XSSC/ 0.5%SDS ；
[0046]高严谨洗膜液:0.5 X SSC / 0.5%SDS ；
[0047]Blocking Solution:用 Maleic Acid Buffer 将 IOXBlocking solution 稀释 10倍;
[0048]Antibody Solution:将 Ant1-Digoxigenin-AP (1000Or / min 离心)按 1:5000 用Blocking Solution 稀释；
[0049]MS 培养基:。
[0050]主要仪器:电热恒温水槽(DK-8D)、高速离心机(Centrifuge 5415R)、PCR仪(AG2233IHamburg)、电泳仪(DYY-6D)、凝胶成像系统(FluorChem FC2)。
`[0051]实施例1海岛棉农杆菌菌液喷雾转p53基因
[0052]本方法，包括以下步骤:
[0053]制备农杆菌菌液:将含有质粒PCAMB1300-p53:gfp的农杆菌LBA4404重悬于渗透培养基中，将菌液稀释到0D600值为0.6。渗透培养基配制:20%蔗糖、I / 2MS、0.1%吐温-20，pH=6.0。
[0054]喷洒农杆菌菌液:在北疆，于7月中旬棉花盛花期的晴天，北京时间10时左右，对刚开的花朵挂牌标记，花柄上系绳子，在棉花授粉之前，对标记花朵进行转基因喷洒。喷洒操作方式为:用食指和中指轻轻夹住花朵，只露出花柱的柱头，用喷壶对准花柱柱头喷洒菌液f2mL/朵。喷洒过程中，应尽量避免菌液喷洒到花药上。喷洒后，用绳子绑住花瓣，以保持相对的湿度和菌液活性。处理时，绳子不要过紧，以免损坏柱头。对处理后花朵的花柄基部喷洒40 μ g / L赤霉素，防止落铃。
[0055]本实施例所用棉花为新海24。
[0056]实施例2转p53基因海岛棉植株检测
[0057]1、标记基因检测
[0058]对转基因植株的T1代进行卡那霉素田间筛选，在棉花真叶期用400(T5000mg / L卡那霉素涂抹第一或第二片真叶，一周后依据叶片颜色进行初步筛选。将叶片涂抹处不变色(没有斑点)的植株进一步进行室内分子鉴定。
[0059]喷花处理对L代成铃率的影响
[0060]农杆菌菌液喷雾法处理的新海24的Ttl代植株成铃率为30.5%(见表1 )，与传统花粉管通道转化方法成铃率25%相比有所提高。
[0061 ] 表1农杆菌菌液喷雾处理Ttl代成铃率
[0062]
【权利要求】
1.一种农杆菌菌液喷雾转基因方法，包括以下步骤: 配制农杆菌菌液，所述农杆菌含有外源目的基因； 选取刚开的棉花花朵，对其喷洒农杆菌菌液。
2.根据权利要求1所述的农杆菌菌液喷雾转基因方法，其特征在于，所述喷洒方式具体为:用喷壶对准花柱柱头喷洒所述农杆菌菌液，农杆菌菌液的喷洒量为每朵花f2mL。
3.根据权利要求2所述的农杆菌菌液喷雾转基因方法，其特征在于包括以下步骤:喷洒后，用绳子绑住花瓣，以保持相对的湿度和菌液活性。
4.根据权利要求1所述的农杆菌菌液喷雾转基因方法，其特征在于，喷洒过农杆菌菌液的花朵，向其花柄基部喷洒40 μ g / L赤霉素。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的农杆菌菌液喷雾转基因方法，其特征在于，所述棉花为海岛棉。
6.根据权利要求5所述的农杆菌菌液喷雾转基因方法，其特征在于，所述海岛棉为新海20或新海24。
7.根据权利要求1-4任意一项所述的农杆菌菌液喷雾转基因方法，其特征在于，所述农杆菌菌液的浓度为=OD6tltl值为0.6。
8.根据权利要求7所述的农杆菌菌液喷雾转基因方法，其特征在于，所述农杆菌菌液为农杆菌重悬于渗透培养基中。
9.根据权利要求8所述的农杆菌菌液喷雾转基因方法，其特征在于，所述渗透培养基的配方为:20% 蔗糖、I / 2MS、0.1% 吐温-20，pH=6.0。
10.根据权利要求1所述`的农杆菌菌液喷雾转基因方法，其特征在于，所述外源基因为p53。
【文档编号】C12N15/82GK103667335SQ201210319378
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年8月31日 优先权日:2012年8月31日
【发明者】陈全家, 曲延英, 李琼, 孙国清 申请人:新疆农业大学